ამჟამად†მიმდინარე მისამართი: OX11 0DE, დიდი ბრიტანეთი, დაიმონდ ბილდინგი, ჰარველის მეცნიერებისა და ინოვაციების პარკი, დიეტკოტი, ოქსფორდშირი, დიდი ბრიტანეთი, Diamond Light Source Co., Ltd., ელექტრონული ბიოლოგიური ვიზუალიზაციის ცენტრი.
რეაქციის ცენტრის სინათლის შემგროვებელი კომპლექსი 1 (RC-LH1) წარმოადგენს იისფერი ფოტოტროფული ბაქტერიების ფოტოსინთეზის ძირითად კომპონენტს. ჩვენ წარმოვადგინეთ Rhodopseudomonas palustris-ის RC-LH1 კომპლექსის ორი კრიოელექტრონული მიკროსკოპიის სტრუქტურა. RC-LH114-W კომპლექსის 2.65-Å გარჩევადობის სტრუქტურა შედგება RC-ს გარშემო არსებული 14 ქვეერთეულის LH1 მარყუჟისგან, რომელიც წყდება W ცილით, ხოლო ცილა-W-ს გარეშე არსებული კომპლექსი მთლიანად RC შემადგენლობითაა გარშემორტყმული RC-ით. დახურული 16 ქვეერთეულის LH1 მარყუჟი. ამ სტრუქტურების შედარება იძლევა წარმოდგენას RC-LH1 კომპლექსში ქინონის დინამიკის შესახებ, მათ შორის აქამდე დაუდგენელი კონფორმაციული ცვლილებების შესახებ ქინონის RC QB ადგილზე შეკავშირებისას, ასევე დამხმარე ქინონის შეკავშირების ადგილების მდებარეობის შესახებ, რომლებიც ხელს უწყობენ მათ RC-ში გადაცემას. W ცილის უნიკალური სტრუქტურა ხელს უშლის LH1 მარყუჟის დახურვას, რითაც ქმნის არხს ქინონის/ქინოლონის გაცვლის დაჩქარებისთვის.
ფოტოსინთეზის მიერ გამოყოფილი ენერგია დედამიწაზე თითქმის ყველა სიცოცხლის შენარჩუნებას უწყობს ხელს და მას მზის ბიოტექნოლოგიისთვის დიდი პოტენციალი აქვს. გლობალური ფოტოსინთეზის ხელშეწყობის პარალელურად, იისფერი ფოტოტროფული ბაქტერიები ასევე ავლენენ სხვადასხვა ენერგეტიკულ რეჟიმებსა და მეტაბოლურ შესაძლებლობებს. მათ შეუძლიათ ფოტოსინთეზის თავიდან აცილება და სიბნელეში ჰეტეროტროფული ბაქტერიების სახით ზრდა, აზოტისა და ნახშირორჟანგის დაფიქსირება, წყალბადის წარმოება და არომატული ნაერთების დაშლა (1-3). ამ პროცესებისთვის ენერგიის უზრუნველსაყოფად, სინათლე სწრაფად და ეფექტურად უნდა გარდაიქმნას ქიმიურ ენერგიად. ეს პროცესი იწყება მაშინ, როდესაც სინათლის დამჭერი ანტენის კომპლექსი შთანთქავს სინათლეს და გადასცემს დაკავებულ ენერგიას რეაქციის ცენტრში (RC), რითაც იწყება მუხტის გამოყოფა (4-7). იისფერ ფოტოტროფულ ბაქტერიებში ფოტოსინთეზის ძირითადი ერთეული შედგება მე-2 ტიპის RC-სგან, რომელიც გარშემორტყმულია სინათლის შემგროვებელი კომპლექსით 1 (LH1), რომელიც ქმნის RC-LH1 ბირთვულ კომპლექსს. LH1 წარმოიქმნება მრუდი αβ ჰეტეროდიმერების მასივისგან, რომელთაგან თითოეული უკავშირდება ორ ბაქტერიულ ქლოროფილს (BChl)α მოლეკულას და ერთ ან ორ კაროტინოიდს (8-12). უმარტივესი LH1 ანტენა შედგება 16 ან 17 αβ ჰეტეროდიმერისგან, რომლებიც RC-ს (9-13) დახურულ მარყუჟში აკრავს გარს, მაგრამ სხვა ბირთვულ კომპლექსებში ტრანსმემბრანული პეპტიდები არღვევენ გარშემომყოფი LH1-ის უწყვეტობას, რითაც ხელს უწყობენ ქინოლის/ქინონის დიფუზიას RC-სა და ციტოქრომ bc1 კომპლექსს შორის (11, 13-15). იისფერი ფოტოტროფული მცენარე Rhodopseudomonas (Rps.) არის მოდელური ორგანიზმი, რომელსაც შეუძლია გაიგოს ენერგიისა და ელექტრონების გადაცემა, რომელიც ხელს უწყობს ფოტოსინთეზს. Rps-ის პირველი კრისტალური სტრუქტურა. palustris RC-LH1 კომპლექსის მოდელი არის RC, რომელიც გარშემორტყმულია 15 ჰეტეროდიმერული LH1 მარყუჟით, რომლებიც წყდება უცნობი ცილით, სახელწოდებით „ცილა W“ (14). ცილა-W შემდგომში იდენტიფიცირდა, როგორც RPA4402, რომელიც არის დაუხასიათებელი 10.5kDa ცილა სამი პროგნოზირებული ტრანსმემბრანული სპირალით (TMH) (16). ჩვენ ვთავაზობთ ცილა W-ს კოდირების rpa4402 გენის სახელის შეცვლას pufW-ით, რათა ეს თავსებადი იყოს RC-L, M (pufL, pufM) და LH1α, β (pufA, pufB) ქვეერთეულების კოდირების გენების ნომენკლატურასთან. საინტერესოა, რომ ცილა-W წარმოდგენილია RC-LH1-ის მხოლოდ დაახლოებით 10%-ში, რაც აჩვენებს, რომ Rps. palustris წარმოქმნის ორ განსხვავებულ RC-LH1 კომპლექსს. აქ ჩვენ წარმოგიდგენთ ორი ძირითადი კომპლექსის მაღალი გარჩევადობის კრიო-EM (კრიო-EM) სტრუქტურებს, ერთი ცილა W-თი და 14 αβ ჰეტეროდიმერით, მეორე კი ცილა W-ს გარეშე და დახურული 16 ჰეტეროდიმერი LH1 მარყუჟით. ჩვენი სტრუქტურა წარმოადგენს ნაბიჯ-ნაბიჯ ცვლილებას Rps. palustris-ის RC-LH1 კომპლექსის გაგებაში, რადგან ჩვენ გავაანალიზეთ თითოეული ვარიანტის ერთგვაროვანი პოპულაცია და გვაქვს საკმარისი გარჩევადობა, რათა ნათლად დავადგინოთ თითოეული პეპტიდი და შეკავშირებული პიგმენტები, ასევე მასთან დაკავშირებული ლიპიდები და ქინონები. ამ სტრუქტურების შედარება აჩვენებს, რომ სამი TMH ცილა-W, რომლებიც აქამდე არ აღმოჩენილა სხვა RC-LH1 კომპლექსში, წარმოქმნის ქინონის არხს ქინონის/ქინოლონის გაცვლის დასაჩქარებლად. იდენტიფიცირებულია ლიპიდებისა და ქინონის შეკავშირების რამდენიმე კონსერვირებული ადგილი და ჩვენ გამოვავლინეთ ახალი კონფორმაციული ცვლილება ქინონისა და RC-ის კომბინაციის შემდეგ, რომელიც შეიძლება შესაფერისი იყოს ჟანგბადით გაჯერებული ფოტოტროფული ორგანიზმების ფოტოსისტემა II (PSII) RC-სთვის. ჩვენი დასკვნები ახალ წარმოდგენას გვიქმნის ქინონის/ქინოლონის შეკავშირებისა და გაცვლის კინეტიკის შესახებ იისფერი ფოტოტროფული ბაქტერიების RC-LH1 ბირთვულ კომპლექსში.
Rps. palustris-ში აღმოჩენილი ორი კომპლექსის დეტალური შესწავლის გასაადვილებლად, ჩვენ ბიოქიმიური მეთოდებით გამოვყავით თითოეული RC-LH1. ცილა W-დეფიციტური კომპლექსი (შემდგომში ΔpufW) გაიწმინდა pufW გენის არმქონე შტამიდან (16) და შესაძლებელია მხოლოდ ერთი RC-LH1 კომპლექსის წარმოქმნა. ცილა W-შემცველი კომპლექსი წარმოიქმნება შტამის მიერ. ამ შტამის ცილა W მოდიფიცირებულია 10x His ნიშნით მის C-ბოლოზე, ისე, რომ ცილა W-შემცველი კომპლექსი ეფექტურად შერწყმული იყოს ცილა W-ს არმქონე უმეტეს ნაწილთან ლითონის იმობილიზაციის გზით. კომპლექსი ეფექტურად გამოიყოფა (16) აფინური ქრომატოგრაფიით (IMAC).
როგორც ნაჩვენებია ნახაზ 1-ში, ორივე კომპლექსი შეიცავს სამ ქვეერთეულ RC-ს (RC-L, RC-M და RC-H), რომლებიც გარშემორტყმულია LH1 ანტენით. ცილა-W-ს არმქონე კომპლექსის 2.80-A სტრუქტურა აჩვენებს 16 αβ ჰეტეროდიმერს, რომლებიც ქმნიან დახურულ LH1 მარყუჟს, რომელიც მთლიანად გარს აკრავს RC-ს, შემდგომში მოხსენიებული როგორც RC-LH116 კომპლექსი. ცილა-W შემცველი კომპლექსის 2.65 Å სტრუქტურას აქვს 14-ჰეტეროდიმერი LH1, რომელიც შეწყვეტილია ცილა-W-ით, შემდგომში მოხსენიებული როგორც RC-LH114-W.
(A და B) ნაერთის ზედაპირული წარმოდგენა. (C და D) შეკავშირებული პიგმენტები, რომლებიც გამოხატულია ჩხირებში. (E და F) ციტოპლაზმური ზედაპირიდან დაკვირვებულ კომპლექსებში პეპტიდები და LH1 ქვეერთეულები წარმოდგენილია კარტოგრაფიულად და დანომრილია საათის ისრის მიმართულებით ცილა-W უფსკრულიდან [შეესაბამება Rba ნუმერაციას. sphaeroides კომპლექსი (13)]. LH1-α-სთვის, ცილის ქვეერთეულის ფერი ყვითელია; LH1-β-სთვის, ცილის ქვეერთეულის ფერი ლურჯია; ცილა-W-სთვის, ცილა წითელია; RC-H-სთვის, ის ციანია; RC-L-ისთვის, ის ნარინჯისფერია; RC-M-ისთვის, მეწამული. კოფაქტორები წარმოდგენილია ჩხირებით, მწვანე წარმოადგენს BChl და BPh a მოლეკულებს, იისფერი წარმოადგენს კაროტინოიდებს, ხოლო ყვითელი წარმოადგენს UQ10 მოლეკულებს. (G და H) ცილა-W უფსკრულის გადიდებული ხედი RC-LH114-W კომპლექსის (G) და RC-LH116 კომპლექსის (H) ეკვივალენტურ რეგიონში. კოფაქტორები ნაჩვენებია სივრცის შევსების სახით, ხელატირებული ქინონი ნაჩვენებია ლურჯად. ცილა-W უფსკრული მონიშნულია ლურჯი წყვეტილი ხაზით (G)-ში, ხოლო პატარა ხვრელები, სადაც ქინონი/ქინოლოლი დიფუზირდება LH116 რგოლზე, მონიშნულია შავი წყვეტილი ხაზით (H)-ში.
სურათი 1 (A და B) გვიჩვენებს RC-ს, რომელიც გარშემორტყმულია LH1αβ ჰეტეროდიმერების ღია ან დახურული მასივებით, რომელთაგან თითოეული უკავშირდება ორ BChl-ს და ერთ კაროტინოიდს (სურათი 1, C და D). წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ Rps არის LH1 კომპლექსი. სპირულინას ქსანტინის ბიოსინთეზურ გზაზე, ეს სახეობები შეიცავს კაროტინოიდების შერეულ პოპულაციებს (17). თუმცა, სპიროპიროქსანტინი არის დომინანტური კაროტინოიდი და მისი სიმკვრივე დამაკმაყოფილებელია. ამიტომ, ჩვენ გადავწყვიტეთ სპიროქსანტინის მოდელირება LH1-ის ყველა შეკავშირების ადგილას. ალფა და ბეტა პოლიპეპტიდები არის ერთჯერადი TMH-ები მოკლე მემბრანული გარე რეგიონებით (სურათი 1, A, B, E და F). მიუხედავად იმისა, რომ C-ბოლოზე 17 ნარჩენის სიმკვრივე არ დაფიქსირებულა, ალფა პოლიპეპტიდი ორივე კომპლექსში Met1-დან Ala46-მდე გაიყო. β პოლიპეპტიდი RC-LH116-ში Gly4-დან Tyr52-მდე და RC-LH114-W-ში Ser5-დან Tyr52-მდე. 3 ან 4 N-ტერმინალური ან 13 C-ტერმინალური ნარჩენის სიმკვრივე არ დაფიქსირებულა (სურათი S1). ველური ტიპის შტამიდან მომზადებული შერეული RC-LH1 კომპლექსის მას-სპექტრომეტრიულმა ანალიზმა აჩვენა, რომ დაკარგული რეგიონი ამ პეპტიდების ჰეტეროლოგიური დაშლის შედეგი იყო (სურათი S1 და S2). ასევე დაფიქსირდა α-Met1-ის N-ტერმინალური ფორმილირება (ვ). ანალიზმა აჩვენა, რომ α-პეპტიდი შედგება ნარჩენებისგან fMet1-დან Asp42/Ala46/Ala47/Ala50-მდე, ხოლო β-პეპტიდი შედგება ნარჩენებისგან Ser2-დან Ala53-მდე, რაც კარგად შეესაბამება დაბალი ტემპერატურის ელექტრომაგნიტური სიმკვრივის რუკას.
α-His29-ისა და β-His36-ის კოორდინაცია BChl-ებს პირისპირ აყენებს; თითოეული αβ ჰეტეროდიმერი მეზობლებთან ერთად ქმნის ღია მარყუჟს (RC-LH114-W) ან დახურულ მარყუჟს (RC-LH116) RC ექსიტონთან შეწყვილებული პიგმენტების მასივის გარშემო (სურათი 1, C და D). RC-LH114-W-ის 877 ნმ ზოლთან შედარებით, RC-LH116-ის 880 ნმ შთანთქმის წითელი წანაცვლება 3 ნმ-ია (სურათი 2A). თუმცა, წრიული დიქროიზმის სპექტრი თითქმის იგივეა (სურათი 2B), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ მიუხედავად იმისა, რომ ღია და დახურულ მარყუჟებს შორის აშკარა განსხვავებაა, BChl-ების ლოკალური გარემო ძალიან მსგავსია. შთანთქმის წითელი წანაცვლება შეიძლება იყოს თერმული მოძრაობის შემცირების და დახურულ მარყუჟზე სტაბილურობის გაზრდის შედეგი (18, 19), პიგმენტების შეერთების ცვლილების შედეგი, რომელიც გამოწვეულია დახურული მარყუჟით (20, 21), ან ამ ორი ეფექტის კომბინაციით (11).
(A) ულტრაიისფერი/ხილული/ახლო ინფრაწითელი შთანთქმის სპექტრი, რომლის პიკები აღნიშნულია შესაბამისი პიგმენტებით და ნორმალიზებულია Bph პიკზე 775 ნმ-ზე. (B) წრიული დიქროიზმის სპექტრი ნორმალიზებულია BChl შთანთქმის მიმართ 805 ნმ-ზე. (C და D) შერჩეული ΔA სპექტრები RC-LH114-W კომპლექსის (C) და RC-LH116 კომპლექსის დროში გადაჭრილი შთანთქმის სპექტრებიდან (D). უკეთესი შედარებისთვის, ყველა სპექტრი ნორმალიზებულია −A-ს ΔA-მდე 0.2 ps-ზე. (E) ციტოქრომ c2 დაჟანგვის სიჩქარე დასხივების შემდეგ UQ2-ის სხვადასხვა კონცენტრაციის თანაარსებობისას (ნედლი მონაცემებისთვის იხილეთ სურათი S8). (F) დაბალი, საშუალო ან მაღალი ინტენსივობის სინათლის ქვეშ გაზრდილ უჯრედებში (შესაბამისად, 10, 30 ან 300μMm-2 s-1), ცილა W და RC-L ქვეერთეულები გასუფთავებულ კომპლექსში და გამოყოფილი მემბრანის თანაფარდობა. ცილის დონე განსაზღვრეთ SDS-პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზისა და იმუნოანალიზის გამოყენებით (ნედლი მონაცემებისთვის იხილეთ სურათი S9). განსაზღვრეთ თანაფარდობა გასუფთავებულ RC-LH114-W კომპლექსთან მიმართებაში. RC-L-ის და კომპლექსის ცილა-W-ს სტექიომეტრიული თანაფარდობაა 1:1.
RC-LH114-W-ის დეფორმირებულ αβ14 მარყუჟში 1 პოზიციაზე მდებარე BChl-ები (სურათი 1, A, C და E) 6.8 Å-ით უფრო ახლოს არიან RC პირველად დონორთან (P), ვიდრე ეკვივალენტური BChl-ები RC-LH116-ში (სურათი 1, B, D და F და სურათი S3); თუმცა, ორი კომპლექსის გარდამავალი შთანთქმის კინეტიკა აჩვენებს, რომ RC-LH114-W-სა და RC-LH116-ისთვის, აგზნების ენერგიის გადაცემის დროის მუდმივები LH1-დან RC-მდე არის 40 ±4 და 44 ± 3 ps (სურათი 2). , C და D, სურათი S4 და ცხრილი S2). ასევე არ არის მნიშვნელოვანი განსხვავება ელექტრონულ გადაცემაში RC-ში (სურათი S5 და მასთან დაკავშირებული დამატებითი ტექსტი). ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ LH1-სა და RC-P-ს შორის ენერგიის გადაცემის დროის მჭიდრო შესაბამისობა განპირობებულია ორ LH1 მარყუჟში BChl-ების უმეტესობის მსგავსი მანძილით, კუთხით და პოტენციური ენერგიით. როგორც ჩანს, LH1 ენერგიის ნიმუშის შესწავლა მინიმალური მანძილის მისაღწევად არ არის უფრო სწრაფი, ვიდრე ენერგიის პირდაპირი გადაცემა სუბოპტიმალური ადგილებიდან RC-ში. RC-LH114-W-ში ღია მარყუჟის LH1 მარყუჟმა ასევე შეიძლება განიცადოს უმნიშვნელო თერმული მოძრაობა დაბალი ტემპერატურის პირობებში სტრუქტურული ანალიზისთვის და ოთახის ტემპერატურაზე αβ14 რგოლის კონფორმაცია უფრო გრძელია βBChls-ის პიგმენტაციის მანძილიდან RC 1-ის პოზიციაზე.
RC-LH116 კომპლექსი შეიცავს 32 BChl-ს და 16 კაროტინოიდს და მისი საერთო განლაგება იგივეა, რაც მიღებულია Thermochromatium (Tch.) piddipudum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 შტამიდან (PDB ID 7C9R) (12) და მწვანე წყალმცენარეებიდან (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). განლაგების შემდეგ, αβ ჰეტეროდიმერების პოზიციებში მხოლოდ მცირე გადახრები დაფიქსირდა, განსაკუთრებით 1-5, 15 და 16 (სურათი S6). ცილა-W-ს არსებობას მნიშვნელოვანი გავლენა აქვს LH1-ის სტრუქტურაზე. მისი სამი TMH დაკავშირებულია მოკლე მარყუჟებით, N-ტერმინალი კომპლექსის სანათურის მხარეს და C-ტერმინალი ციტოპლაზმურ მხარეს (სურათები 1A და 3, A-დან D-მდე). ცილა-W ძირითადად ჰიდროფობიურია (სურათი 3B), ხოლო TMH2 და TMH3 ურთიერთქმედებენ LH1αβ-14-თან ტრანსმემბრანული ზედაპირის წარმოქმნით (სურათი 3, B და E-დან G-მდე). ინტერფეისი ძირითადად შედგება Phe, Leu და Val ნარჩენებისგან ტრანსმემბრანულ რეგიონში. ეს ნარჩენები განლაგებულია ჰიდროფობური ამინომჟავებით და αβ-14 პიგმენტებით. ურთიერთქმედებაში ასევე მონაწილეობს ზოგიერთი პოლარული ნარჩენი, მათ შორის წყალბადის ბმა W-Thr68-სა და β-Trp42-ს შორის კომპლექსური ღრუს ზედაპირზე (სურათი 3, F და G). ციტოპლაზმის ზედაპირზე Gln34 ესაზღვრება αβ-14 კაროტინოიდების კეტო ჯგუფს. გარდა ამისა, n-დოდეცილ β-d-მალტოზიდის (β-DDM) მოლეკულა გაიყო და მისი ჰიდროფობიური კუდი გაგრძელდა ცილა-W-სა და αβ-14-ს შორის ინტერფეისამდე, ხოლო ლიპიდური კუდი შესაძლოა ორგანიზმში იყოს განლაგებული. ასევე შევნიშნეთ, რომ ცილა W-სა და RCH-ის C-ტერმინალური გარჩევადობის რეგიონები ძალიან ახლოსაა, მაგრამ სპეციფიკური ურთიერთქმედებების წარმოქმნის ფარგლებში არ შედის (სურათი 1, A და E). თუმცა, შესაძლოა, ამ ორი ცილის გაუხსნელ C-ტერმინალურ ამინომჟავებში ურთიერთქმედება იყოს, რაც შესაძლოა RC-LH114-W კომპლექსის აწყობის დროს ცილა-W-ს რეკრუტირების მექანიზმს წარმოადგენდეს.
(A) ცილა-W, რომელიც LH1αβ14-თან ინტერფეისისკენაა მიმართული მულტფილმის სახით, აქვს ღეროს ფორმის გვერდითი ჯაჭვი (წითელი), რომელიც ელექტროსტატიკური პოტენციალის დიაგრამის ნაწილშია ნაჩვენები (გამჭვირვალე ნაცრისფერი ზედაპირი 0.13 კონტურის დონით). (B) ცილა-W წარმოდგენილია ჰიდროფობიური ფერის ზედაპირით. პოლარული და დამუხტული არეები ნაჩვენებია ცისფერში, ჰიდროფობიური არეები - თეთრში, ხოლო ძლიერ ჰიდროფობიური არეები - ნარინჯისფერში. (C და D) ცილა-W წარმოდგენილია მულტფილმში, მისი ორიენტაცია იგივეა, რაც (A) (C)-ში და შემობრუნებულია 180°-ით (D). თანმიმდევრობაში პოზიციის მიხედვით, გამორჩეული ნარჩენები იღებენ ცისარტყელას ფერის სქემას, სადაც N-ტერმინალი არის ლურჯი, ხოლო C-ტერმინალი - წითელი. (E) ცილა-W იმავე ხედში, როგორც (A)-ში, და ცილა-W:LH1 ინტერფეისზე არსებული ნარჩენები წარმოდგენილია ღეროებით მიმაგრებული ნიშნებით. (F) კარტოგრაფიულ წარმოდგენაში ცილა-W (E)-სა და LH1αβ14-თან მიმართებაში 90°-ით არის შემობრუნებული, ხოლო ზოლიან წარმოდგენაში ინტერფეისის ნარჩენებთან მიმართებაში. ბეტა პოლიპეპტიდიდან გადმოკიდებული ნარჩენები მონიშნულია. კოფაქტორი ნაჩვენებია ნახაზი 1-ის ფერის შესაბამისი ზოლის სახით, დაშლილი β-DDM ნაჩვენებია ნაცრისფრად, ხოლო ჟანგბადი წითლად. (G) (F)-ში ხედი 180°-ით არის შემობრუნებული, მონიშნული ალფა პოლიპეპტიდის თვალსაჩინო ნარჩენებით.
ცილა-W ცვლის αβ ჰეტეროდიმერს (მე-15 ნახაზი 1F-ზე), რითაც ხელს უშლის მარყუჟის დახურვას და პირველი სამი αβ ჰეტეროდიმერის დახრას. დაფიქსირდა, რომ პირველი αβ-1 ჰეტეროდიმერის მაქსიმალური დახრის კუთხე ფირის ნორმალთან მიმართებაში იყო 25°-დან 29°-მდე (ნახაზი 1, A და E), რაც ჩამოყალიბდა αβ-1-ის 2°-დან 8°-მდე დახრით RC A მკვეთრი კონტრასტის მქონე LH116-ში (ნახაზი 1, B და F). მეორე და მესამე ჰეტეროდიმერები დახრილია შესაბამისად 12°-დან 22°-მდე და 5°-დან 10°-მდე. RC-ის სტერიული დაბრკოლების გამო, αβ-1-ის დახრა არ მოიცავს αβ-ს მეორე წყვილს (რაც შეესაბამება მე-16 αβ-ს ნახაზი 1F-ზე), რითაც წარმოიქმნება მკაფიო ნაპრალი LH1 რგოლში (ნახაზი 1, A და E). ორი αβ ჰეტეროდიმერის არარსებობის, რასაც თან ახლავს ოთხი BChl და ორი კაროტინოიდის დაკარგვა, არცერთი კაროტინოიდი არ უკავშირდება დაგრეხილ αβ-1 ქვეერთეულს, რის შედეგადაც წარმოიქმნება LH114-W რგოლი, რომელიც შეიცავს 13 ვეგეტარიანულ კაროტინოიდს და 28 BChl. αβ1-დან 7-მდე რეგიონებში ორი კომპლექსის ლოკალური გარჩევადობის შეფასებები უფრო დაბალია, ვიდრე LH1 მარყუჟის დანარჩენი ნაწილის, რაც შეიძლება ასახავდეს RC QB უბნის მიმდებარე LH1 ქვეერთეულის თანდაყოლილ პლასტიურობას (სურათი 4).
RC-LH114-W (A და B) და RC-LH116 (C და D) სურათები ნაჩვენებია ერთი და იგივე ზემოდან/გვერდითი ხედით (A და B) (A და C) და ღრუს ზედაპირიდან, როგორც ეს ნაჩვენებია ნახ. 1-ში (B და D). ფერადი კლავიშები ნაჩვენებია მარჯვნივ.
ერთადერთი სხვა დამახასიათებელი ბირთვული კომპლექსი 1:14 სტექიომეტრიული თანაფარდობით არის Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX დიმერი (13). თუმცა, ცილა W-ს და PufX-ს არ აქვთ აშკარა ჰომოლოგია და მნიშვნელოვან გავლენას ახდენენ მათ შესაბამის LH1 სტრუქტურებზე. PufX არის ერთი TMH N-ტერმინალური ციტოპლაზმური დომენით, რომელიც ურთიერთქმედებს RC-H ქვეერთეულის ციტოპლაზმურ მხარესთან (13) Rps. palustris LH116αβ-16-ის შესაბამის პოზიციაზე. PufX ქმნის არხს ქინონის/ქინოლონის გაცვლისთვის RC-LH1-სა და ციტოქრომ bcl კომპლექსს შორის და წარმოდგენილია ყველა Rba. sphaeroides ბირთვულ კომპლექსში (13). თუმცა მონომერ-მონომერის ინტერფეისი Rba-შია. sphaeroides RC-LH1-PufX დიმერი მდებარეობს ცილა W-ს შეკავშირების პოზიციაზე RC-LH114-W-ში, ხოლო PufX-ით და ცილა-W-ით გამოწვეული უფსკრული ეკვივალენტურ პოზიციაზეა (სურათი S7A). RC-LH114-W-ში არსებული უფსკრული ასევე შეესაბამება Pseudomonas rosea LH1-ის ჰიპოთეტურ ქინონის არხს (8), რომელიც წარმოიქმნება პეპტიდებით, რომლებიც არ არიან დაკავშირებული ცილა W-სთან ან PufX-თან (სურათი S7B). გარდა ამისა, Blc-ში არსებული ქინონის არხი. ზურმუხტისფერი მწვანე LH1, რომელიც წარმოიქმნება ერთი γ ქვეერთეულის (7) გამორიცხვით, მდებარეობს მსგავს პოზიციაზე (სურათი S7C). მიუხედავად იმისა, რომ სხვადასხვა ცილებით არის განპირობებული, ამ ქინონ/ქინოლოლის არხების RC-LH1 კომპლექსში საერთო პოზიციაში გამოჩენა, როგორც ჩანს, კონვერგენტული ევოლუციის მაგალითია, რაც მიუთითებს, რომ ცილა W-ს მიერ შექმნილი უფსკრული შეიძლება მოქმედებდეს როგორც ქინონის არხი.
LH114-W მარყუჟში არსებული ნაპრალი საშუალებას იძლევა RC-LH114-W კომპლექსის შიდა სივრცესა და მასიურ მემბრანას შორის უწყვეტი მემბრანული რეგიონის წარმოქმნის (სურათი 1G), ცილების მსგავსად, ორი დომენის ცილის ფორით დაკავშირების ნაცვლად. RC-LH116 კომპლექსი მსგავსია დახურული Tch. ნემსისებრი კომპლექსისა (22) (სურათი 1H). რადგან ქინონის დიფუზია მემბრანაში უფრო სწრაფია, ვიდრე ვიწრო ცილოვანი არხის დიფუზია, ღია LH114-W მარყუჟს შეუძლია უზრუნველყოს RC-ის უფრო სწრაფი ბრუნვა, ვიდრე დახურულ LH116 მარყუჟს, და ქინონის დიფუზია RC-ში შეიძლება უფრო შეზღუდული იყოს. იმის შესამოწმებლად, მოქმედებს თუ არა ცილა W ქინონების კონვერსიაზე RC-ის მეშვეობით, ჩვენ ჩავატარეთ ციტოქრომის დაჟანგვის ანალიზი უბიქინონ 2-ის (UQ2) გარკვეულ კონცენტრაციაზე (ბუნებრივი UQ10-ის ანალოგი უფრო მოკლე იზოპრენის კუდით) (სურათი 2E). მიუხედავად იმისა, რომ ხელირებული ქინონის არსებობა ხელს უშლის მიქაელისის მუდმივას ზუსტად განსაზღვრას (RC-LH114-W და RC-LH116 შესაბამისად, შესაფერისია 0.2±0.1μM და 0.5±0.2μM-ისთვის), RC-LH114-W-ის მაქსიმალური სიჩქარე (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) 28±5%-ით მეტია RC-LH116-თან შედარებით (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
თავდაპირველად ჩვენ შევაფასეთ, რომ ცილა-W ბირთვული კომპლექსის დაახლოებით 10%-შია წარმოდგენილი (16); აქ, დაბალი განათების, საშუალო განათების და მაღალი განათების ზრდის უჯრედების დაკავებულობის მაჩვენებლები შესაბამისად 15±0.6%, 11±1% და 0.9±0.5%-ია (სურათი 2F). მას-სპექტრომეტრიის რაოდენობრივმა შედარებამ აჩვენა, რომ ჰისტიდინის ტეგის დამატებამ არ შეამცირა ცილა-W-ს შედარებითი სიჭარბე ველური ტიპის შტამებთან შედარებით (P = 0.59), ამიტომ ეს დონეები არ წარმოადგენს მოდიფიცირებული ცილა-W-ს არტეფაქტს (სურათი S10). თუმცა, ცილა-W-ს ეს დაბალი დაკავებულობა RC-LH1 კომპლექსში შესაძლოა ზოგიერთ RC-ს საშუალებას აძლევდეს დაჩქარებული ტემპით გადაიხაროს, რითაც შემცირდება ქინონის/ქინოლონის ნელი ცვლა RC-LH116 კომპლექსში. ჩვენ შევამჩნიეთ, რომ მაღალი დაკავებულობის მაჩვენებელი სინათლის მიმართ არ შეესაბამება ბოლო ტრანსკრიპტომიკის მონაცემებს, რაც მიუთითებს, რომ pufW გენის ექსპრესია იზრდება ძლიერი განათების ქვეშ (სურათი S11) (23). pufW ტრანსკრიფციასა და ცილა-W-ს RC-LH1 კომპლექსში ინკორპორაციას შორის განსხვავება დამაბნეველია და შესაძლოა, ცილის კომპლექსურ რეგულაციას ასახავდეს.
RC-LH114-W-ში გამოყოფილი და მოდელირებულია 6 კარდიოლიპინი (CDL), 7 ფოსფატიდილქოლინი (POPC), 1 ფოსფატიდილგლიცეროლი (POPG) და 29 β-DDM მოლეკულა, რომელშიც 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG და 12 βDDM RC-LH116 (სურათი 5, A და B). ამ ორ სტრუქტურაში CDL თითქმის კომპლექსის ციტოპლაზმურ მხარესაა განლაგებული, ხოლო POPC, POPG და β-DDM ძირითადად ლუმინალურ მხარესაა განლაგებული. RC-LH114-W კომპლექსის αβ-1-დან αβ-6-მდე რეგიონში იზოლირებული იქნა ორი ლიპიდური და დეტერგენტული მოლეკულა (სურათი 5A), ხოლო ხუთი - RC-LH116-ის ეკვივალენტურ რეგიონში (სურათი 5B). კომპლექსის მეორე მხარეს მეტი ლიპიდი აღმოჩნდა, ძირითადად CDL, რომელიც დაგროვდა RC-სა და αβ-7-დან αβ-13-მდე (სურათი 5, A და B). სხვა სტრუქტურულად გახსნილი ლიპიდები და დეტერგენტები განლაგებულია LH1 რგოლის გარეთ, ხოლო კარგად გახსნილი აცილის ჯაჭვები ვრცელდება LH1 ქვეერთეულებს შორის, რომლებიც RC-LH114-W-ში სავარაუდოდ β-DDM-ად არის დანიშნული და RC-ში β-DDM-ად განისაზღვრება, როგორც β-DDM. ჩვენს სტრუქტურაში ხელაციურ ლიპიდებსა და დეტერგენტებს მსგავსი პოზიციები მიუთითებს, რომ ისინი ფიზიოლოგიურად მნიშვნელოვანი შეკავშირების ადგილებია (სურათი S12A). Tch-ში ეკვივალენტური მოლეკულების პოზიციებს ასევე კარგი კონსისტენცია აქვთ. Gentle და Trv. შტამი 970 RC-LH1s (სურათი S12, B-დან E-მდე) (9, 12) და ლიპიდური თავის ჯგუფის წყალბადის ბმების ნარჩენებმა საკმაოდ კარგი კონსერვაცია აჩვენეს თანმიმდევრობის განლაგებაში (სურათი S13), რაც მიუთითებს, რომ შენარჩუნებულია CDL, რომელიც უკავშირდება RC-ს (24), ეს ადგილები შეიძლება კონსერვირებული იყოს RC-LH1 კომპლექსში.
(A და B) RC-LH114-W (A) და RC-LH116 (B) პეპტიდები წარმოდგენილია კარიკატურებით, ხოლო პიგმენტები - ჩხირებით, სურათი 1-ზე მოცემული ფერთა სქემის გამოყენებით. ლიპიდები ნაჩვენებია წითლად, ხოლო დეტერგენტები - ნაცრისფრად. RC QA და QB საიტებთან დაკავშირებული UQ ყვითელია, ხოლო იზოლირებული UQ ლურჯი. (C და D) იგივე ხედები, რაც (A) და (B), ლიპიდების გამოტოვებით. (E-დან G-მდე) RC-LH116-დან Q1(E), Q2(F) და Q3(G)-ის გადიდებული ხედი, გვერდითი ჯაჭვებით, რომლებიც გავლენას ახდენენ ერთმანეთზე. წყალბადური ბმები ნაჩვენებია შავი წყვეტილი ხაზებით.
RC-LH116-ში, როგორც RC QA, ასევე QB UQ, რომლებიც მონაწილეობენ ელექტრონების გადაცემაში მუხტის გამოყოფის პროცესში, იშლება მათ შეკავშირების ადგილებში. თუმცა, RC-LH114-W-ში, QB ქინონი არ არის გამოყოფილი და ქვემოთ დეტალურად იქნება განხილული. QA და QB ქინონების გარდა, ორი ხელატირებული UQ მოლეკულა (მდებარეობს RC და LH1 რგოლებს შორის) განაწილებულია RC-LH114-W სტრუქტურაში მათი კარგად გამოყოფილი სათავე ჯგუფების მიხედვით (მდებარეობს შესაბამისად Q1 და Q2-ში). სივრცე). სურათი 5C). Q1-ს ენიჭება ორი იზოპრენის ერთეული და სიმკვრივის რუკა ხსნის Q2-ის სრულ 10 იზოპრენის კუდს. RC-LH116-ის სტრუქტურაში, სამი ხელატირებული UQ10 მოლეკულა (Q1-დან Q3-მდე, სურათი 5D) გამოიყო და ყველა მოლეკულას აქვს მკაფიო სიმკვრივე მთელ კუდში (სურათი 5, D-დან G-მდე). ორ სტრუქტურაში, Q1-ისა და Q2-ის ქინონის თავური ჯგუფების პოზიციებს შესანიშნავი თანმიმდევრულობა აქვს (სურათი S12F) და ისინი ურთიერთქმედებენ მხოლოდ RC-თან. Q1 მდებარეობს RC-LH114-W-ის W ნაპრალის შესასვლელთან (სურათი 1G და 5, C, D და E), ხოლო Q2 მდებარეობს QB შეკავშირების ადგილის მახლობლად (სურათი 5, C, D) და F). კონსერვირებული L-Trp143 და L-Trp269 ნარჩენები ძალიან ახლოსაა Q1-თან და Q2-თან და უზრუნველყოფს პოტენციურ π-დაწყობის ურთიერთქმედებას (სურათი 5, E და F და სურათი S12). L-Gln88, რომელიც Q1-ის დისტალური ჟანგბადიდან 3.0 Å-ით არის დაშორებული, უზრუნველყოფს ძლიერ წყალბადურ ბმას (სურათი 5E); ეს ნარჩენი კონსერვირებულია ყველა RC-ში, გარდა ყველაზე შორეული ურთიერთობისა (სურათი S13). L-Ser91 კონსერვატიულად ცვლის Thr-ს სხვა RC-ების უმეტესობაში (სურათი S13), Q1-ის მეთილჟანგბადისგან 3.8 ანგსტრემითაა დაშორებული და შესაძლოა სუსტი წყალბადური ბმებიც წარმოქმნას (სურათი 5E). როგორც ჩანს, Q3-ს სპეციფიკური ურთიერთქმედება არ აქვს, მაგრამ მდებარეობს ჰიდროფობულ რეგიონში RC-M ქვეერთეულსა და LH1-α ქვეერთეულებს შორის 5-დან 6-მდე (სურათი 5, D და G). Q1, Q2 და Q3 ან ახლომდებარე ხელატირებული ქინონები ასევე აღმოჩენილია Tch. Gentle, Trv. Strain 970 და Blc-ში. ფერადი გარსის სტრუქტურა (9, 10, 12) მიუთითებს RC-LH1 კომპლექსში კონსერვირებულ დამხმარე ქინონის შეკავშირების ადგილზე (სურათი S12G). RC-LH116-ში ხუთი დაშლილი UQ კარგად შეესაბამება მაღალი ხარისხის სითხით ქრომატოგრაფიით (HPLC) განსაზღვრულ თითოეული კომპლექსის 5.8±0.7-ს, ხოლო RC-LH114-W-ში სამი დაშლილი UQ უფრო დაბალია, ვიდრე 6.2±0.3 გაზომილი მნიშვნელობა (სურ. S14) მიუთითებს, რომ სტრუქტურაში არის გაუხსნელი UQ მოლეკულები.
ფსევდოსიმეტრიული L და M პოლიპეპტიდები შეიცავს ხუთ TMH-ს და ქმნის ჰეტეროდიმერს, რომელიც აერთიანებს ერთ BChl დიმერს, ორ BChl მონომერს, ორ ბაქტერიოფაგის (BPh) მონომერს, ერთ არაჰემურ რკინას და ერთ ან ორ UQ10 მოლეკულას. ტერმინალურ კეტონის ჯგუფზე წყალბადის ბმების არსებობისა და Rps-ში მისი ცნობილი დაგროვების გზით, კაროტინოიდები ინტეგრირდება M-ქვეერთეულში, რომელსაც ცის-3,4-დეჰიდროორჰოდოპინი ეწოდება. სახეობები (25). RC-H-ის გარე მემბრანული დომენი მემბრანაზე მიმაგრებულია ერთი TMH-ით. საერთო RC სტრუქტურა მსგავსია მონათესავე სახეობების (მაგალითად, Rba) სამქვეერთეული RC-ს. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl-ის და BPh-ის მაკროციკლები, კაროტინოიდული ხერხემალი და არაჰემური რკინა გადაფარავს ერთმანეთს ამ სტრუქტურების გარჩევადობის დიაპაზონში, ისევე როგორც UQ10 სათავე ჯგუფი QA ადგილზე და QB ქინონი RC-LH116-ზე (სურათი S15).
ორი RC სტრუქტურის არსებობა QB ადგილის სხვადასხვა დაკავების სიჩქარით იძლევა ახალ შესაძლებლობას, შევისწავლოთ QB ქინონის შეკავშირების თანმხლები თანმიმდევრული კონფორმაციული ცვლილებები. RC-LH116 კომპლექსში QB ქინონი მდებარეობს სრულად შეკავშირებულ „პროქსიმალურ“ პოზიციაში (26), მაგრამ RC-LH114-W-ის გამოყოფას არ აქვს QB ქინონი. RC-LH114-W-ში QB ქინონი არ არის, რაც გასაკვირია, რადგან კომპლექსი აქტიურია, უფრო მეტად, ვიდრე RC-LH116 კომპლექსი სტრუქტურულად გახსნილ QB ქინონთან. მიუხედავად იმისა, რომ ორი LH1 რგოლი ხელატებს დაახლოებით ექვს ქინონს, ხუთი სტრუქტურულად გახსნილია დახურულ RC-LH116 რგოლში, ხოლო მხოლოდ სამია სტრუქტურულად შეზღუდული ღია RC-LH114-W რგოლში. სტრუქტურული აშლილობის ეს ზრდა შეიძლება ასახავდეს RC-LH114-W QB ადგილების უფრო სწრაფ ჩანაცვლებას, კომპლექსში ქინონის უფრო სწრაფ კინეტიკას და LH1 მარყუჟის გადაკვეთის გაზრდილ ალბათობას. ჩვენი ვარაუდით, RC-LH114-W-ის RC QB უბანში UQ-ს ნაკლებობა შესაძლოა უფრო რთული და აქტიური კომპლექსის შედეგი იყოს და RC-LH114-W-ის QB უბანი მყისიერად გაიყინა UQ ბრუნვაში. კონკრეტული ეტაპი (QB უბანში შესასვლელი დაკეტილია) ამ აქტივობის კონფორმაციას ასახავს.
QB-ის გარეშე, L-Phe217-ის თანმხლები ბრუნვა UQ10-თან შეკავშირებასთან შეუთავსებელ პოზიციაზე მოხდება, რადგან ეს გამოიწვევს კუდის პირველ იზოპრენულ ერთეულთან სივრცულ შეჯახებას (სურათი 6A). გარდა ამისა, აშკარაა ძირითადი კონფორმაციული ცვლილებები, განსაკუთრებით სპირალი de (TMH D-სა და E-ს შორის მარყუჟში მოკლე სპირალი), სადაც L-Phe217 გადაადგილებულია QB შეკავშირების ჯიბეში და L-Tyr223-ის ბრუნვა (სურათი 6A), რაც წყალბადის ბმის გაწყვეტას იწვევს M-Asp45 ჩარჩოსთან და QB შეკავშირების ადგილის შესასვლელის დახურვას (სურათი 6B). სპირალი de ბრუნავს მის ფუძესთან, L-Ser209-ის Cα გადაადგილებულია 0.33 Å-ით, ხოლო L-Val221Cα გადაადგილებულია 3.52 Å-ით. TMH D-სა და E-ში დაკვირვებადი ცვლილებები არ შეინიშნება, რომლებიც ორივე სტრუქტურაში ერთმანეთზეა გადაფარებული (სურათი 6A). რამდენადაც ჩვენთვის ცნობილია, ეს არის ბუნებრივი RC-ის პირველი სტრუქტურა, რომელიც ხურავს QB ადგილს. სრულ (QB-შეკავშირებულ) სტრუქტურასთან შედარება აჩვენებს, რომ ქინონის აღდგენამდე, ქინონში მისი შესასვლელად საჭიროა კონფორმაციული ცვლილება. L-Phe217 ბრუნავს ქინონის სათავე ჯგუფთან π-დასტის ურთიერთქმედების შესაქმნელად, ხოლო სპირალი გარეთ გადაინაცვლებს, რაც L-Gly222-ის ჩონჩხს და L-Tyr223-ის გვერდით ჯაჭვს საშუალებას აძლევს შექმნან წყალბადური ბმების ქსელი სტაბილური წყალბადური ბმების სტრუქტურით (სურათი 6, A და C).
(A) ჰოლოგრამის (L ჯაჭვი, ნარინჯისფერი/M ჯაჭვი, მეწამული) და apo (ნაცრისფერი) სტრუქტურის გადაფარვის მულტფილმი, რომელშიც ძირითადი ნარჩენები ღეროსებრი წარმოდგენის სახითაა გამოსახული. UQ10 წარმოდგენილია ყვითელი ზოლით. წერტილოვანი ხაზი მიუთითებს მთელ სტრუქტურაში წარმოქმნილ წყალბადის ბმებზე. (B და C) აპოლიპოპროტეინის და მთელი რგოლის სტრუქტურის ზედაპირული წარმოდგენა, რომელიც შესაბამისად ლურჯად ხაზს უსვამს L-Phe217-ის გვერდითი ჯაჭვის ჟანგბადს და წითლად L-Tyr223-ს. L ქვეერთეული ნარინჯისფერია; M და H ქვეერთეულები არ არის შეღებილი. (D და E) აპოლიპოპროტეინი (D) და მთლიანი (E) RC QB საიტები [შეღებეთ შესაბამისად (A)-თი] და Thermophilus thermophilus PSII (მწვანე, ლურჯი პლასტმასის ქინონით; PDB ID: 3WU2) გასწორება (58).
მოულოდნელად, მიუხედავად იმისა, რომ ხელმისაწვდომია QB-დეფიციტური RC-ების რამდენიმე სტრუქტურა LH1-ის გარეშე, ამ კვლევაში დაფიქსირებული კონფორმაციული ცვლილებები აქამდე არ ყოფილა აღწერილი. ესენია Blc. viridis-ის (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum-ის (PDB ID: 1EYS) (28) და Rba. sphaeroides-ის (PDB ID: 1OGV) (29) QB-ის დეპლეციური სტრუქტურა, რომელთაგან ყველა თითქმის იგივეა, რაც მათი საერთო QB სტრუქტურა. 3PRC-ის დაკვირვებამ აჩვენა, რომ LDAO (ლაურილ დიმეთილ ამინოქსიდი) სარეცხი ნივთიერების მოლეკულები უკავშირდება QB პოზიციის შესასვლელს, რამაც შეიძლება ხელი შეუშალოს დახურულ კონფორმაციაში გადალაგებას. მიუხედავად იმისა, რომ LDAO არ იშლება იმავე პოზიციაზე 1EYS-ში ან 1OGV-ში, ეს RC-ები მზადდება იმავე სარეცხი ნივთიერების გამოყენებით და, შესაბამისად, შეიძლება იგივე ეფექტი გამოიწვიოს. Rba-ს კრისტალური სტრუქტურა. ციტოქრომ c2-თან თანაკრისტალიზებული Sphaeroides RC (PDB ID: 1L9B) ასევე, როგორც ჩანს, დახურული QB ადგილი აქვს. თუმცა, ამ შემთხვევაში, RC-M პოლიპეპტიდის N-ტერმინალური რეგიონი (რომელიც ურთიერთქმედებს QB შეკავშირების ადგილთან Q სპირალზე Tyr ნარჩენის H ბმის მეშვეობით) იღებს არაბუნებრივ კონფორმაციას და QB კონფორმაციული ცვლილება შემდგომში არ არის შესწავლილი (30). დამამშვიდებელია ის, რომ ჩვენ არ შეგვხვედრია M პოლიპეპტიდის ამ ტიპის დეფორმაცია RC-LH114-W სტრუქტურაში, რომელიც თითქმის იგივეა, რაც RC-LH116 RC-ის N-ტერმინალური რეგიონი. ასევე უნდა აღინიშნოს, რომ სარეცხი საშუალებაზე დაფუძნებული LH1 ანტენის აღმოფხვრის შემდეგ, PDB-ში აპოლიპოპროტეინების RC-ები გაიშალა, რამაც აღმოფხვრა შიდა ქინონის გუნდები და ლიპიდები RC-სა და მიმდებარე LH1 რგოლის შიდა ზედაპირს შორის არსებულ ნაპრალში (31, 32). RC ფუნქციონალური რჩება, რადგან ის ინარჩუნებს ყველა კოფაქტორს, გარდა დაშლილი QB ქინონისა, რომელიც ნაკლებად სტაბილურია და ხშირად იკარგება მომზადების პროცესში (33). გარდა ამისა, ცნობილია, რომ LH1-ის და ბუნებრივი ციკლური ლიპიდების მოცილება RC-დან შეიძლება გავლენა იქონიოს ფუნქციებზე, როგორიცაა მუხტით გამოყოფილი P+QB მდგომარეობის სიცოცხლის ხანგრძლივობის შემცირება (31, 34, 35). ამიტომ, ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ RC-ის გარშემო არსებული ლოკალური LH1 რგოლის არსებობამ შეიძლება შეინარჩუნოს „დახურული“ QB ადგილი, რითაც შენარჩუნდება QB-ის მახლობლად არსებული ლოკალური გარემო.
მიუხედავად იმისა, რომ აპოლიპოპროტეინი (QB ქინონის გარეშე) და სრული სტრუქტურა QB უბნის ბრუნვის მხოლოდ ორ სურათს წარმოადგენს და არა მოვლენათა სერიას, არსებობს მინიშნებები, რომ შეკავშირება შეიძლება შეფერხდეს ჰიდროქინონით ხელახალი შეკავშირების თავიდან ასაცილებლად სუბსტრატის ინჰიბირების მიზნით. ქინოლოლისა და ქინონის ურთიერთქმედება აპოლიპოპროტეინის QB უბანსთან ახლოს შეიძლება განსხვავებული იყოს, რაც იწვევს მის უარყოფას RC-ის მიერ. დიდი ხანია ვარაუდობენ, რომ კონფორმაციული ცვლილებები როლს თამაშობს ქინონების შეკავშირებასა და შემცირებაში. გაყინული RC-ების უნარი, შეამცირონ ქინონები სიბნელეში ადაპტაციის შემდეგ, დაქვეითებულია (36); რენტგენის კრისტალოგრაფია აჩვენებს, რომ ეს დაზიანება გამოწვეულია QB ქინონების „დისტალურ“ კონფორმაციაში მოხვედრით აქტიური პროქსიმალური პოზიციიდან დაახლოებით 4.5 Å-ის დაშორებით (26), 37). ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ ეს დისტალური შეკავშირების კონფორმაცია არის შუალედური მდგომარეობის სურათს აპოლიპოპროტეინსა და სრულ რგოლურ სტრუქტურას შორის, რომელიც მოჰყვება ქინონთან საწყის ურთიერთქმედებას და QB უბანის გახსნას.
გარკვეული ფოტოტროფული ბაქტერიებისა და ციანობაქტერიების, წყალმცენარეებისა და მცენარეების PSII კომპლექსში აღმოჩენილ II ტიპის RC-ს აქვს სტრუქტურული და ფუნქციური კონსერვაცია (38). ნახაზ 6-ზე (D და E) ნაჩვენები სტრუქტურული განლაგება ხაზს უსვამს PSII RC-ებსა და ბაქტერიული RC კომპლექსის QB ადგილს შორის მსგავსებას. ეს შედარება დიდი ხანია წარმოადგენს მოდელს ქინონის შეკავშირებისა და შემცირების მჭიდროდ დაკავშირებული სისტემების შესასწავლად. წინა პუბლიკაციებში ვარაუდობენ, რომ კონფორმაციულ ცვლილებებს თან ახლავს ქინონების PSII აღდგენა (39, 40). ამიტომ, RC-ის ევოლუციური კონსერვაციის გათვალისწინებით, ეს აქამდე დაუკვირვებელი შეკავშირების მექანიზმი შეიძლება ასევე გამოყენებული იყოს PSII RC-ის QB ადგილზე ჟანგბადით გაჯერებულ ფოტოტროფულ მცენარეებში.
Rps ΔpufW (არამონიშნული pufW წაშლით) და PufW-His (C-ტერმინალური 10x His-მონიშნული ცილა-W, რომელიც გამოხატულია ბუნებრივი pufW ლოკუსიდან) შტამები. palustris CGA009 აღწერილი იყო ჩვენს წინა ნაშრომში (16). ეს შტამები და იზოგენური ველური ტიპის მშობელი შტამი ამოღებული იქნა საყინულედან PYE (თითოეული 5 გ ლიტრი -1) ​​(შენახული LB-ში -80°C-ზე, შეიცავს 50% (w/v) გლიცეროლის) ცილას, საფუარის ექსტრაქტს და სუქცინატს) აგარ [1.5% (w/v)] ფირფიტაზე მცირე რაოდენობის უჯრედების დატანით. ფირფიტა ინკუბირებული იყო ღამით სიბნელეში ოთახის ტემპერატურაზე ანაერობულ პირობებში, შემდეგ კი განათებული იყო თეთრი სინათლით (~50 μmolm-2 s-1), რომელიც უზრუნველყოფილი იყო OSRAM 116-W ჰალოგენური ნათურებით (RS Components, დიდი ბრიტანეთი) 3-დან 5 დღემდე, სანამ ერთი კოლონია არ გაჩნდებოდა. ერთი კოლონია გამოყენებული იქნა 10 მლ M22+ გარემოს (41) ინოკულაციისთვის, რომელიც შეიცავდა 0.1% (w/v) კაზამინომჟავებს (შემდგომში M22). კულტურა გაიზარდა დაბალი ჟანგბადის პირობებში, სიბნელეში, 34°C ტემპერატურაზე, 180 ბრ/წთ სიჩქარით შენჯღრევით 48 საათის განმავლობაში, შემდეგ კი კულტურის 70 მლ ინოკულირებული იქნა იმავე პირობებში 24 საათის განმავლობაში. ნახევრად აერობული კულტურა, რომლის მოცულობაც 1 მლ იყო, გამოიყენება 30 მლ M22 გარემოს ინოკულაციისთვის 30 მლ უნივერსალურ, ხრახნიან-თავსახურიან გამჭვირვალე შუშის ბოთლში და დასხივებულია 48 საათის განმავლობაში სტერილური მაგნიტური ძალის მქონე შემრევი ღეროთი შერევით (~50μmolm-2 s-1). შემდეგ კულტურის 30 მლ ინოკულირებული იქნა დაახლოებით 1 ლიტრი კულტურით იმავე პირობებში, რომელიც შემდეგ გამოყენებული იქნა დაახლოებით 9 ლიტრი კულტურის ინოკულაციისთვის, რომელიც განათებული იყო ~200 μmolm-2 s-1-ზე 72 საათის განმავლობაში. უჯრედები შეგროვდა ცენტრიფუგირებით 7132 RCF ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში, ხელახლა სუსპენზირებული იქნა ~10 მლ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ხსნარში და შენახული იქნა -20°C ტემპერატურაზე საჭიროების გარეშე.
გალღობის შემდეგ, ხელახლა შესუსტებულ უჯრედებს დაუმატეთ დეზოქსირიბონუკლეაზა I-ის რამდენიმე კრისტალი (Merck, დიდი ბრიტანეთი), ლიზოციმი (Merck, დიდი ბრიტანეთი) და Roche-ის ჰოლოენზიმ პროტეაზას ინჰიბიტორის ორი ტაბლეტი (Merck, დიდი ბრიტანეთი). 20,000 psi სიმძლავრის ფრანგული წნევის უჯრედში (Aminco, აშშ) უჯრედები 8-12-ჯერ დაიშალა. დაუზიანებელი უჯრედებისა და უხსნადი ნარჩენების 18,500 RCF-ზე ცენტრიფუგირებით 15 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე, მემბრანა გამოიყო პიგმენტირებული ლიზატიდან 113,000 RCF-ზე ცენტრიფუგირებით 2 საათის განმავლობაში 43,000°C ტემპერატურაზე. გადააგდეთ ხსნადი ფრაქცია და ხელახლა შესუსტეთ ფერადი მემბრანა 100-200 მლ 20 mM tris-HCl-ში (pH 8.0) და ჰომოგენიზება მოახდინეთ მანამ, სანამ ხილული აგრეგატები არ გაქრება. სუსპენზიური მემბრანა ინკუბირებული იქნა 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, აშშ) ხსნარში, რომელიც შეიცავდა 2% (w/v) β-DDM-ს, 1 საათის განმავლობაში სიბნელეში 4°C ტემპერატურაზე, ნაზი მორევის პირობებში. შემდეგ ცენტრიფუგირდა 70°C ტემპერატურაზე, რათა გაიხსნას 150,000 RCF 4°C ტემპერატურაზე 1 საათის განმავლობაში, ნარჩენი უხსნადი ნივთიერებების მოსაშორებლად.
ΔpufW შტამიდან გამხსნელი მემბრანა დატანილი იქნა 50 მლ DEAE სეფაროზის იონგაცვლით სვეტზე, შემაკავშირებელი ბუფერის სამი სვეტის მოცულობით (CV) [20 mM tris-HCl (pH 8.0), რომელიც შეიცავდა 0.03% (w/v) β-DDM]. სვეტი გარეცხეთ ორი CV შემაკავშირებელი ბუფერით, შემდეგ კი სვეტი გარეცხეთ ორი შემაკავშირებელი ბუფერით, რომელიც შეიცავდა 50 mM NaCl-ს. RC-LH116 კომპლექსი გამოირეცხა 150-დან 300 mM NaCl-მდე წრფივი გრადიენტით (შემაკავშირებელ ბუფერში) 1.75 CV-ზე, ხოლო დარჩენილი შემაკავშირებელი კომპლექსი გამოირეცხა 300 mM NaCl-ის შემცველი შემაკავშირებელი ბუფერით 0.5 CV-ზე. შთანთქმის სპექტრი შეაგროვეთ 250-დან 1000 ნმ-მდე, 880-დან 280 ნმ-მდე შეინახეთ ფრაქცია, რომლის შთანთქმის კოეფიციენტი (A880/A280) 1-ზე მეტია, ორჯერ გააზავეთ შემაკავშირებელ ბუფერში და კვლავ გამოიყენეთ იგივე პროცედურა DEAE სვეტზე. გაწმენდისას გააზავეთ ფრაქციები, რომელთა A880/A280 თანაფარდობა 1.7-ზე მეტია და A880/A805 თანაფარდობა 3.0-ზე მეტია, ჩაატარეთ იონური ცვლის მესამე რაუნდი და შეინახეთ ფრაქციები, რომელთა A880/A280 თანაფარდობა 2.2-ზე მეტია და A880/A805 თანაფარდობა 5.0-ზე მეტია. ნაწილობრივ გაწმენდილი კომპლექსი კონცენტრირებული იქნა დაახლოებით 2 მლ-მდე Amicon 100,000 მოლეკულური წონის გათიშვის (MWCO) ცენტრიდანულ ფილტრში (Merck, დიდი ბრიტანეთი) და დატვირთული იქნა Superdex 200 16/600 ზომის გამორიცხვის სვეტზე (GE Healthcare, აშშ), რომელიც შეიცავდა 200 mM NaCl ბუფერს, შემდეგ კი გამოიყო იმავე ბუფერში 1.5 CV სიმძლავრით. შეაგროვეთ ზომის გამორიცხვის ფრაქციის შთანთქმის სპექტრები და კონცენტრირდით შთანთქმის სპექტრებზე A880/A280 თანაფარდობით 2.4-ზე და A880/A805 თანაფარდობით 5.8-დან 100 A880-მდე და დაუყოვნებლივ გამოიყენეთ ისინი კრიო-TEM ბადის მოსამზადებლად ან შესანახად. შეინახეთ -80°C ტემპერატურაზე საჭიროების შემთხვევაში.
PufW-His შტამიდან მიღებული გამხსნელი მემბრანა დამონტაჟდა 20 მლ HisPrep FF Ni-NTA სეფაროზის სვეტზე (20 mM tris-HCl (pH 8.0), რომელიც შეიცავს 200 mM NaCl-ს და 0.03% (w/w)) IMAC ბუფერში (GE Healthcare). v) β-DDM]. სვეტი გაირეცხა IMAC ბუფერის ხუთი CV-ით, შემდეგ კი 10 mM ჰისტიდინის შემცველი IMAC ბუფერის ხუთი CV-ით. ბირთვის კომპლექსი გამოიყო სვეტიდან 100 mM ჰისტიდინის შემცველი ხუთი IMAC ბუფერით. RC-LH114-W კომპლექსის შემცველი ფრაქცია კონცენტრირებულია დაახლოებით 10 მლ-მდე Amicon 100,000 MWCO ფილტრით (Merck, დიდი ბრიტანეთი) აღჭურვილ მორევიან ავზში, 20-ჯერ განზავებულია შემაკავშირებელი ბუფერით და შემდეგ ემატება 25 მლ-ს. DEAE სეფაროზის სვეტში წინასწარ გამოიყენება ბუფერთან დაკავშირებული ოთხი CV. სვეტი გარეცხეთ ოთხი CV შემაკავშირებელი ბუფერით, შემდეგ კომპლექსი გამოიყავით რვა CV-ზე 0-დან 100 mM NaCl-ის წრფივ გრადიენტზე (შემაკავშირებელ ბუფერში), ხოლო დარჩენილი ოთხი CV შეიცავდა 100 mM შემაკავშირებელ ბუფერს. ნატრიუმის ქლორიდზე გამოყოფილი ნარჩენი კომპლექსები, რომლებიც შერწყმული იყო 2.4-ზე მაღალი A880/A280 თანაფარდობის და 4.6-ზე მაღალი A880/A805 თანაფარდობის ფრაქციებთან, კონცენტრირებული იქნა დაახლოებით 2 მლ-მდე Amicon 100,000 MWCO ცენტრიდანულ ფილტრში და შევსებული იქნა 1.5 CV IMAC წინასწარ ბუფერით. დაბალანსებული Superdex 200 16/600 ზომის გამორიცხვის სვეტი და შემდეგ გამოიყავით იმავე ბუფერში 1.5 CV-ზე მეტი სიმძლავრით. შეაგროვეთ ზომის გამორიცხვის ფრაქციების შთანთქმის სპექტრები და კონცენტრირდით შთანთქმის სპექტრებზე A880/A280 თანაფარდობებით 2.1-ზე და A880/A805 თანაფარდობებით 4.6-დან 100 A880-მდე, რომლებიც დაუყოვნებლივ გამოიყენება გაყინული TEM ბადის მოსამზადებლად ან ინახება -80°C ტემპერატურაზე საჭიროების გარეშე.
დაბალი ტემპერატურის TEM ბადეების მოსამზადებლად გამოყენებული იქნა Leica EM GP ჩაძირვის საყინულე. კომპლექსი განზავდა IMAC ბუფერში A880-მდე 50-მდე, შემდეგ კი 5μl ჩაიტვირთა ახლად გახურებულ QUANTIFOIL 1.2/1.3 ნახშირბადით დაფარულ სპილენძის ბადეზე (Agar Scientific, დიდი ბრიტანეთი). ბადე ინკუბირებული იქნა 20°C ტემპერატურაზე და 60%-იანი ფარდობითი ტენიანობის პირობებში 30 წამის განმავლობაში, შემდეგ გაშრეს 3 წამის განმავლობაში და შემდეგ ჩააქრეთ თხევად ეთანში -176°C ტემპერატურაზე.
RC-LH114-W კომპლექსის მონაცემები ჩაიწერა eBIC-ზე (ელექტრონული ბიოვიზუალიზაციის ცენტრი) (ბრიტანული ალმასის სინათლის წყარო) Titan Krios მიკროსკოპით, რომელიც მუშაობს 300 კვ აჩქარების ძაბვაზე, 130,000× ნომინალური გადიდებით და 20 eV ენერგიით. მონაცემების შესაგროვებლად გამოყენებული იქნა Gatan 968 GIF Quantum K2 პიკური დეტექტორით გამოსახულებების ჩასაწერად დათვლის რეჟიმში. დაკალიბრებული პიქსელის ზომაა 1.048 Å, ხოლო დოზის სიჩქარეა 3.83 e-Å-2s-1. ფირი შეგროვდა 11 წამში და დაიყო 40 ნაწილად. მიკროსკოპის ხელახლა ფოკუსირებისთვის გამოიყენეთ ნახშირბადით დაფარული არე, შემდეგ კი თითო ხვრელზე სამი ფირი შეგროვდა. სულ შეგროვდა 3130 ფირი, დეფოკუსირების მნიშვნელობებით -1-დან -3μm-მდე.
RC-LH116 კომპლექსის მონაცემები შეგროვდა იმავე მიკროსკოპის გამოყენებით ასტერბერის ბიოსტრუქტურის ლაბორატორიაში (ლიდსის უნივერსიტეტი, დიდი ბრიტანეთი). მონაცემები შეგროვდა დათვლის რეჟიმში 130 k გადიდებით და პიქსელის ზომა დაკალიბრდა 1.065 Å-მდე 4.6 e-Å-2s-1 დოზით. ფილმი ჩაიწერა 12 წამში და დაიყო 48 ნაწილად. სულ შეგროვდა 3359 ფირი, დეფოკუსირების მნიშვნელობებით -1-დან -3μm-მდე.
ყველა მონაცემთა დამუშავება ხორციელდება Relion 3.0 მილსადენში (42). სხივის მოძრაობის დოზის შეწონვით კორექტირებისთვის გამოიყენეთ Motioncorr 2 (43), შემდეგ კი CTFFIND 4.1 (44) გამოიყენეთ CTF (კონტრასტის გადაცემის ფუნქცია) პარამეტრის დასადგენად. ამ საწყისი დამუშავების ეტაპების შემდეგ ტიპური ფოტომიკროგრაფია ნაჩვენებია ნახაზ 2-ში. S16. ავტომატური შერჩევის შაბლონი გენერირდება 250 პიქსელიან ჩარჩოში 1000 ნაწილაკის დაახლოებით 250 პიქსელის ხელით შერჩევით და ორგანზომილებიანი (2D) კლასიფიკაციის გარეშე, რითაც უარყოფილია ის კლასიფიკაციები, რომლებიც აკმაყოფილებენ ნიმუშის დაბინძურებას ან არ აქვთ შესამჩნევი მახასიათებლები. შემდეგ, ავტომატური შერჩევა განხორციელდა ყველა მიკროფოტოგრამაზე და RC-LH114-W იყო 849,359 ნაწილაკი, ხოლო RC-LH116 კომპლექსი - 476,547 ნაწილაკი. ყველა შერჩეულმა ნაწილაკმა გაიარა არასაცნობარო 2D კლასიფიკაციის ორი რაუნდი და თითოეული ცდის შემდეგ, ნაწილაკები, რომლებიც აკმაყოფილებენ ნახშირბადის არეს, ნიმუშის დაბინძურებას, არ აქვთ აშკარა მახასიათებლები ან ძლიერად გადაფარავენ ნაწილაკებს, უარყოფილია, რის შედეგადაც მიიღება შესაბამისად 772,033 (90.9%) და 359,678 (75.5%) ნაწილაკი RC-LH114-W და RC-LH116-ის 3D კლასიფიკაციისთვის. საწყისი 3D საცნობარო მოდელი გენერირებული იქნა სტოქასტური გრადიენტული დაღმავალი მეთოდის გამოყენებით. საწყისი მოდელის, როგორც საცნობარო მოდელის გამოყენებით, შერჩეული ნაწილაკები კლასიფიცირდება ოთხ კატეგორიად 3D-ში. ამ კატეგორიის მოდელის, როგორც საცნობარო მოდელის გამოყენებით, ჩაატარეთ 3D დახვეწა ყველაზე დიდი კატეგორიის ნაწილაკებზე, შემდეგ გამოიყენეთ საწყისი 15 Å დაბალი გამტარობის ფილტრი გამხსნელის არეს დასაფარად, დაამატეთ რბილი კიდეების 6 პიქსელი და დაამუშავეთ პიქსელები ზედა დეტექტორის Gatan K2 პიკის მოდულაციის გადაცემის ფუნქციის გამოსასწორებლად. RC-LH114-W მონაცემთა ნაკრებისთვის, ეს საწყისი მოდელი მოდიფიცირებული იქნა ნიღბის კიდეებზე ძლიერი სიმკვრივის მოცილებით (რომლებიც გათიშულია UCSF Chimera-ში ბირთვის კომპლექსის სიმკვრივისგან). შედეგად მიღებული მოდელები (RC-LH114-W და RC-LH116 გარჩევადობები შესაბამისად 3.91 და 4.16 Å) გამოიყენება 3D კლასიფიკაციის მეორე რაუნდისთვის საცნობარო მასალად. გამოყენებული ნაწილაკები დაჯგუფებულია საწყის 3D კლასში და არ შეიცავს ძლიერ კორელაციას სამეზობლოსთან. გადაფარვა ან აშკარა სტრუქტურული მახასიათებლების არარსებობა. 3D კლასიფიკაციის მეორე რაუნდის შემდეგ, შეირჩა ყველაზე მაღალი გარჩევადობის მქონე კატეგორია [RC-LH114-W-სთვის ერთი კატეგორიაა 377,703 ნაწილაკი (44.5%), RC-LH116-ისთვის არის ორი კატეგორია, სულ 260,752 ნაწილაკი (54.7%), სადაც ისინი იდენტურია მხოლოდ მაშინ, როდესაც ისინი გასწორებულია საწყისი ბრუნვის შემდეგ მცირე სხვაობით]. შერჩეული ნაწილაკები ხელახლა ექსტრაქცირდება 400 პიქსელიან ყუთში და ხდება მათი 3D დახვეწა. გამხსნელის ნიღაბი გენერირდება საწყისი 15 Å დაბალი გამტარობის ფილტრის, 3 პიქსელიანი რუკის გაფართოების და 3 პიქსელიანი რბილი ნიღბის გამოყენებით. ნაწილაკზე CTF დახვეწის, ნაწილაკზე მოძრაობის კორექციის და ნაწილაკზე CTF დახვეწის მეორე რაუნდის გამოყენებით, თითოეული ნაბიჯის შემდეგ ხორციელდება 3D დახვეწა, გამხსნელის ნიღაბი და შემდგომი დამუშავება მიღებული ტექსტურის შემდგომი დახვეწის მიზნით. FSC (ფურიეს გარსის კორელაციის კოეფიციენტი) 0.143 ზღვრული მნიშვნელობის გამოყენებით, RC-LH114-W და RC-LH116-ის საბოლოო მოდელების გარჩევადობა შესაბამისად 2.65 და 2.80 Å-ია. საბოლოო მოდელის FSC მრუდი ნაჩვენებია ნახაზ 2-ში. S17.
ყველა ცილის თანმიმდევრობა გადმოწერილია UniProtKB-დან: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC-ის ჰომოლოგიის მოდელის შესაქმნელად გამოყენებული იქნა SWISS-MODEL (45), რომელიც შეიცავს RC-L, RC-M და RC-H ცილის თანმიმდევრობებს და Rba.sphaeroides-ის კრისტალურ სტრუქტურას. RC გამოყენებული იქნა როგორც შაბლონი (PDB ID: 5LSE) (46). გენერირებული მოდელის რუკასთან (47) შესაბამისობაში მოსაყვანად, ცილის სტრუქტურის გასაუმჯობესებლად და კოფაქტორის [4×BChl a (მონომერული ბიბლიოთეკის ნარჩენის სახელი = BCL), 2×BPh a (BPH), UQ10-ის ერთი ან ორი სახეობა (U10), ერთი არაჰემური რკინა (Fe) და ერთი 3,4-დიჰიდროჰექსაკარბონილქოლინი (QAK)] დასამატებლად გამოიყენეთ Coot (48). რადგან QAK მონომერულ ბიბლიოთეკაში არ არის ხელმისაწვდომი, მისი პარამეტრიზაცია განხორციელდა PHENIX-ში (49) eLBOW ინსტრუმენტის გამოყენებით.
შემდეგ, აგებული იქნა LH1 ქვეერთეული. თავდაპირველად, PHENIX-ში (49) ავტომატური აგების ინსტრუმენტი გამოყენებული იქნა LH1 თანმიმდევრობის ნაწილის ავტომატურად აგებისთვის, რუკისა და LH1-α და LH1-β ცილოვანი თანმიმდევრობების შეყვანის სახით გამოყენებით. აირჩიეთ ყველაზე სრულყოფილი LH1 ქვეერთეული, ამოიღეთ იგი და ჩატვირთეთ Coot-ში, ხელით დაამატეთ მასში დაკარგული თანმიმდევრობა და ხელით დახვეწეთ მთელი სტრუქტურა ორი BCls a (BCL) და სპირილოქსანტინის (CRT) დამატებამდე [LH1 კომპლექსის შესაბამისი Rps სიმკვრივისა და ცნობილი კაროტინოიდების შემცველობის მიხედვით. სახეობები (17)]. დააკოპირეთ სრული LH1 ქვეერთეული და გამოიყენეთ UCSF Chimera „Docking Map Tool“ LH1 სიმკვრივის მიმდებარე არამოდელურ არეალში დასაკავშირებლად და შემდეგ დახვეწეთ იგი Coot-ში; გაიმეორეთ პროცესი მანამ, სანამ ყველა LH1 ქვეერთეული არ იქნება მოდელირებული. RC-LH114-W სტრუქტურისთვის, Coot-ში გამოუყოფელი სიმკვრივის ამოღებით, ცილა სეგმენტირებულია USCF Chimera რუკაზე დარჩენილი არაცილის კომპონენტებიდან და Autobuild ინსტრუმენტი გამოიყენება საწყისი მოდელის დასადგენად და დარჩენილი ქვეერთეულების (ცილა-W) მოდელირებისთვის. PHENIX-ში (49). დაამატეთ ნებისმიერი დაკარგული თანმიმდევრობა Coot-ში (48) მიღებულ მოდელს და შემდეგ ხელით დახვეწეთ მთელი ქვეერთეული. დარჩენილი გამოუყოფელი სიმკვრივე შეესაბამება ლიპიდების (PDB მონომერული ბიბლიოთეკის ID CDL = CDL, POPC = 6PL და POPG = PGT), β-DDM დეტერგენტის (LMT) და UQ10 მოლეკულების (U10) კომბინაციას. გამოიყენეთ PHENIX ოპტიმიზაცია (49) და ხელით ოპტიმიზაცია Coot-ში (48) სრული საწყისი მოდელის დასახვეწად, სანამ მოდელის სტატისტიკა და მორგების ვიზუალური ხარისხი აღარ გაუმჯობესდება. დაბოლოს, გამოიყენეთ LocScale (50) ლოკალური რუკის გასამახვილებლად და შემდეგ შეასრულეთ გამოუყოფელი სიმკვრივის მოდელირების და ავტომატური და ხელით ოპტიმიზაციის რამდენიმე სხვა ციკლი.
შესაბამისი პეპტიდები, კოფაქტორები და სხვა ლიპიდები და ქინონები, რომლებიც განლაგებულია შესაბამის სიმკვრივეებში, ნაჩვენებია ნახაზებში 1 და 2. S18-დან S23-მდე. საბოლოო მოდელის სტატისტიკური ინფორმაცია ნაჩვენებია ცხრილში S1.
თუ სხვა რამ არ არის მითითებული, UV/Vis/NIR შთანთქმის სპექტრები შეგროვდა Cary60 სპექტროფოტომეტრზე (Agilent, აშშ) 1 ნმ ინტერვალებით 250 ნმ-დან 1000 ნმ-მდე და 0.1 წმ ინტეგრაციის დროით.
ნიმუში გააზავეთ კვარცის კიუვეტში, რომლის A880-მდე 2 მმ-იანი ბილიკი 1-ია და შეაგროვეთ შთანთქმის სპექტრი 400-დან 1000 ნმ-მდე. წრიული დიქროული სპექტრები შეგროვდა Jasco 810 სპექტროპოლარიმეტრზე (Jasco, იაპონია) 1 ნმ ინტერვალებით 400 ნმ-დან 950 ნმ-მდე, 20 ნმ წთ-1 სკანირების სიჩქარით.
მოლური ჩაქრობის კოეფიციენტი განისაზღვრება ბირთვის კომპლექსის დაახლოებით 50-მდე A880-მდე განზავებით. 10 μl მოცულობა გააზავეთ 990 μl შემაკავშირებელ ბუფერში ან მეთანოლში და დაუყოვნებლივ შეაგროვეთ შთანთქმის სპექტრი BChl-ის დეგრადაციის მინიმიზაციის მიზნით. მეთანოლის თითოეული ნიმუშის BChl-ის შემცველობა გამოითვალა 771 ნმ-ზე ჩაქრობის კოეფიციენტით 54.8 mM-1 სმ-1 და განისაზღვრა ჩაქრობის კოეფიციენტი (51). ბირთვის კომპლექსის კონცენტრაციის დასადგენად გაყავით გაზომილი BChl კონცენტრაცია 32-ზე (RC-LH114-W) ან 36-ზე (RC-LH116), რომელიც შემდეგ გამოიყენება ბუფერში შეგროვებული იმავე ნიმუშის შთანთქმის სპექტრის დასადგენად. ჩაქრობის კოეფიციენტი. პარალელურად. თითოეული ნიმუშისთვის ჩატარდა სამი განმეორებითი გაზომვა და გამოთვლისთვის გამოყენებული იქნა BChl Qy მაქსიმუმის საშუალო შთანთქმა. RC-LH114-W-ის ჩაქრობის კოეფიციენტი, რომელიც გაზომილია 878 ნმ-ზე, არის 3280±140 mM-1 სმ-1, ხოლო RC-LH116-ის ჩაქრობის კოეფიციენტი, რომელიც გაზომილია 880 ნმ-ზე, არის 3800±30 mM-1 სმ-1.
UQ10 რაოდენობრივად განისაზღვრა (52)-ში მოცემული მეთოდის მიხედვით. მოკლედ, უკუფაზის HPLC (RP-HPLC) ჩატარდა Agilent 1200 HPLC სისტემის გამოყენებით. გახსენით დაახლოებით 0.02 ნმოლ RC-LH116 ან RC-LH114-W 50μl 50:50 მეთანოლ:ქლოროფორმის 50μl-ში, რომელიც შეიცავს 0.02% (w/v) რკინის ქლორიდს და შეიყვანეთ წინასწარ დაბალანსებული Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 მმ. გახსენით 1 მლ-1 წთ-1-ში 40°C-ზე HPLC გამხსნელში (80:20 მეთანოლი:2-პროპანოლი) ×25 სმ სვეტზე. ჩაატარეთ იზოკრატიული ელუირება HPLC გამხსნელში, რათა აკონტროლოთ შთანთქმა 275 ნმ-ზე (UQ10), 450 ნმ-ზე (კაროტინოიდები) და 780 ნმ-ზე (BChl) 1 საათის განმავლობაში. 275 ნმ ქრომატოგრამაზე 25.5 წუთში პიკი ინტეგრირებული იყო, რომელიც არ შეიცავდა სხვა აღმოსაჩენ ნაერთებს. ინტეგრირებული ფართობი გამოიყენება ექსტრაგირებული UQ10-ის მოლური რაოდენობის გამოსათვლელად, 0-დან 5.8 ნმოლამდე სუფთა სტანდარტების ინექციიდან გამოთვლილი კალიბრაციის მრუდის მიხედვით (სურათი S14). თითოეული ნიმუში გაანალიზდა სამ ეგზემპლარად და დაფიქსირებული შეცდომა შეესაბამება საშუალო სტანდარტული გადახრის გადახრას.
RC-LH1 კომპლექსის შემცველი ხსნარი, რომლის მაქსიმალური Qy შთანთქმა 0.1 იყო, მომზადდა 30 μM აღდგენილი ცხენის გულის ციტოქრომ c2-ით (Merck, დიდი ბრიტანეთი) და 0-დან 50 μMUQ2-მდე (Merck, დიდი ბრიტანეთი). თითოეული UQ2 კონცენტრაციით მომზადდა სამი 1 მლ ნიმუში და ინკუბირებული იქნა ღამით სიბნელეში 4°C ტემპერატურაზე, რათა გაზომვამდე უზრუნველყოფილიყო სიბნელესთან სრული ადაპტაცია. ხსნარი ჩაიტვირთა OLIS RSM1000 მოდულარულ სპექტროფოტომეტრში, რომელიც აღჭურვილი იყო 300 ნმ ალის/500 ხაზის გისოსით, 1.24 მმ შესასვლელით, 0.12 მმ შუა და 0.6 მმ გამოსასვლელი ჭრილებით. 600 ნმ სიგრძის გამტარი ფილტრი მოთავსებულია ნიმუშის ფოტომილისა და საცნობარო ფოტოგამრავლების მილის შესასვლელში, რათა გამოირიცხოს აგზნების სინათლე. შთანთქმის მონიტორინგი ხდებოდა 550 ნმ-ზე 0.15 წმ ინტეგრაციის დროით. აგზნების სინათლე გამოიყოფა 880 ნმ M880F2 LED-დან (სინათლის გამოსხივების დიოდი) (Thorlabs Ltd., დიდი ბრიტანეთი) ბოჭკოვანი ოპტიკური კაბელის მეშვეობით 90%-იანი ინტენსივობით DC2200 კონტროლერის (Thorlabs Ltd., დიდი ბრიტანეთი) მეშვეობით და გამოიყოფა სინათლის წყაროსკენ 90°-იანი კუთხით. საზომი სხივი მიმართულია სარკისკენ, რათა დააბრუნოს ნებისმიერი სინათლე, რომელიც თავდაპირველად არ იყო შთანთქმული ნიმუშის მიერ. აკონტროლეთ შთანთქმა 50 წამის განათებამდე 10 წამით ადრე. შემდეგ შთანთქმის მონიტორინგი განხორციელდა სიბნელეში 60 წამის განმავლობაში, რათა შეფასდეს, თუ რამდენად სპონტანურად ამცირებს ქინოლოლი ციტოქრომ c23+-ს (ნედლი მონაცემებისთვის იხილეთ სურათი S8).
მონაცემები დამუშავდა 0.5-დან 10 წამამდე (UQ2 კონცენტრაციის მიხედვით) წრფივი საწყისი სიჩქარის მორგებით და სამივე ნიმუშის სიჩქარის საშუალოდ გამოთვლით თითოეული UQ2 კონცენტრაციისთვის. შესაბამისი ჩაქრობის კოეფიციენტით გამოთვლილი RC-LH1 კონცენტრაცია გამოყენებული იქნა სიჩქარის კატალიზურ ეფექტურობაში გადასაყვანად, რომელიც გრაფიკულად არის წარმოდგენილი Origin Pro 2019-ში (OriginLab, აშშ) და მიხაელის-მენტენის მოდელზე მორგებული იქნა Km და Kcat მნიშვნელობების დასადგენად.
გარდამავალი შთანთქმის გაზომვებისთვის, RC-LH1 ნიმუში განზავდა ~2μM-მდე IMAC ბუფერში, რომელიც შეიცავდა 50 mM ნატრიუმის ასკორბატს (Merck, აშშ) და 0.4 mM ტერბუტინს (Merck, აშშ). ასკორბინის მჟავა გამოიყენება როგორც მსხვერპლშეწირული ელექტრონული დონორი, ხოლო tert-ბუტაკლოფენი გამოიყენება როგორც QB ინჰიბიტორი იმის უზრუნველსაყოფად, რომ მთავარი RC დონორი დარჩეს შემცირებული (ანუ არ იყოს ფოტოოქსიდირებული) გაზომვის მთელი პროცესის განმავლობაში. დაახლოებით 3 მლ ნიმუში ემატება მორგებულ მბრუნავ უჯრედს (დაახლოებით 0.1 მ დიამეტრის, 350 RPM) 2 მმ ოპტიკური ბილიკის სიგრძით, რათა უზრუნველყოფილი იყოს, რომ ლაზერულ ბილიკზე ნიმუშს ჰქონდეს საკმარისი დრო აგზნების იმპულსებს შორის სიბნელესთან ადაპტაციისთვის. გამოიყენეთ ~100-fs ლაზერული იმპულსები Ti: Sapphire ლაზერული სისტემის (Spectra Physics, აშშ) გასაძლიერებლად, რათა აღგზნოთ ნიმუში 880 ნმ-ზე 1 kHz გამეორების სიჩქარით (20 ნჯ NIR-ისთვის ან 100 ნჯ Vis-ისთვის). მონაცემების შეგროვებამდე, ნიმუში დაახლოებით 30 წუთის განმავლობაში გააჩერეთ აღგზნების სინათლეზე. ექსპოზიცია გამოიწვევს ხარისხის ინდექსის ინაქტივაციას (შესაძლოა, ხარისხის ინდექსი ერთხელ ან ორჯერ შემცირდეს). თუმცა, გაითვალისწინეთ, რომ ეს პროცესი შექცევადია, რადგან სიბნელესთან ადაპტაციის ხანგრძლივი პერიოდის შემდეგ, RC ნელ-ნელა დაუბრუნდება ხარისხის ინდექსის აქტივობას. გარდამავალი სპექტრების გასაზომად გამოყენებული იქნა Helios სპექტრომეტრი (Ultrafast Systems, აშშ) -10-დან 7000 ps-მდე დაყოვნების დროით. გამოიყენეთ Surface Xplorer პროგრამული უზრუნველყოფა (Ultrafast Systems, აშშ) მონაცემთა ნაკრებების განსაჯგუფებლად, შემდეგ გაერთიანებისა და სტანდარტიზაციისთვის. გამოიყენეთ CarpetView პროგრამული პაკეტი (Light Conversion Ltd., ლიეტუვა) დაშლის დიფერენციალური სპექტრების მისაღებად კომბინირებული მონაცემთა ნაკრების გამოსაყენებლად, ან გამოიყენეთ ფუნქცია, რომელიც აერთიანებს მრავალ ექსპონენტს ინსტრუმენტის რეაქციასთან, რათა მოერგოს Origin-ში (OriginLab, აშშ) ერთტალღოვანი სპექტრული ევოლუციას.
როგორც ზემოთ აღინიშნა (53), მომზადდა ფოტოსინთეზური აპკი, რომელიც შეიცავდა LH1 კომპლექსს, რომელსაც არ ჰქონდა როგორც RC, ასევე პერიფერიული LH2 ანტენა. მემბრანა განზავდა 20 mM tris-ში (pH 8.0) და შემდეგ ჩაიტვირთა კვარცის კიუვეტში 2 მმ ოპტიკური ბილიკით. ნიმუშის აღგზნებისთვის გამოყენებული იქნა 30nJ ლაზერული იმპულსი 540 ნმ-ზე, -10-დან 7000 ps-მდე დაყოვნების დროით. მონაცემთა ნაკრები დაამუშავეთ ისე, როგორც აღწერილია Rps.pal ნიმუშისთვის.
მემბრანა დაგრეხილი იქნა ცენტრიფუგირებით 150,000 RCF-ზე 2 საათის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე, შემდეგ კი მისი 880 ნმ-ზე შთანთქმის უნარი ხელახლა შესუსტდა 20 mM tris-HCl-ში (pH 8.0) და 200 mM NaCl-ში. მემბრანა გახსენით ნელა მორევით 2%-იან (w/v) β-DDM-ში 1 საათის განმავლობაში სიბნელეში 4°C ტემპერატურაზე. ნიმუში განზავდა 100 mM ტრიეთილამონიუმის კარბონატში (pH 8.0) (TEAB; Merck, დიდი ბრიტანეთი) 2.5 მგ მლ-1 ცილის კონცენტრაციამდე (Bio-Rad ანალიზი). შემდგომი დამუშავება განხორციელდა ადრე გამოქვეყნებული მეთოდით (54), დაწყებული 50 μg ცილის განზავებით სულ 50 μl TEAB-ში, რომელიც შეიცავდა 1% (w/v) ნატრიუმის ლაურატს (Merck, დიდი ბრიტანეთი). 60 წამიანი ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ, იგი აღდგა 5 mM ტრის(2-კარბოქსიეთილ)ფოსფინით (Merck, დიდი ბრიტანეთი) 37°C ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში. S-ალკილირებისთვის, ნიმუში ინკუბირებული იქნა 10 mM მეთილ S-მეთილთიომეთანსულფონატში (Merck, დიდი ბრიტანეთი) და დამატებული იქნა 200 mM იზოპროპანოლის საწყის ხსნარში 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. პროტეოლიზური დაშლა განხორციელდა 2 μg ტრიფსინის/ენდოპროტეინაზას Lys-C ნარევის დამატებით (Promega UK) და ინკუბირებული იქნა 37°C ტემპერატურაზე 3 საათის განმავლობაში. ლაურატის ზედაპირულად აქტიური ნივთიერება ექსტრაგირებული იქნა 50 μl ეთილის აცეტატის და 10 μl 10% (v/v) LC ხარისხის ტრიფტორძმარმჟავას (TFA; Thermo Fisher Scientific, დიდი ბრიტანეთი) დამატებით და 60 წამიანი მორევის შედეგად. ფაზების გამოყოფა გაუმჯობესდა ცენტრიფუგირებით 15,700 RCF-ზე 5 წუთის განმავლობაში. მწარმოებლის პროტოკოლის თანახმად, პეპტიდის შემცველი ქვედა ფაზის ფრთხილად ასპირაციისა და დემარილიზაციისთვის გამოყენებული იქნა C18 სპინური სვეტი (Thermo Fisher Scientific, დიდი ბრიტანეთი). ვაკუუმური ცენტრიფუგირებით გაშრობის შემდეგ, ნიმუში გაიხსნა 0.5% TFA-სა და 3% აცეტონიტრილში, ხოლო 500 ნგ გაანალიზდა ნანოფლოუ RP ქრომატოგრაფიით, მას-სპექტრომეტრიასთან ერთად, ადრე აღწერილი სისტემის პარამეტრების გამოყენებით.
ცილის იდენტიფიკაციისა და რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის გამოიყენეთ MaxQuant v.1.5.3.30 (56) Rps. palustris პროტეომის მონაცემთა ბაზის მოსაძებნად (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). მას-სპექტრომეტრიის პროტეომიკის მონაცემები განთავსებულია ProteomeXchange Alliance-ში PRIDE პარტნიორი რეპოზიტორის მეშვეობით (http://proteomecentral.proteomexchange.org) მონაცემთა ნაკრების იდენტიფიკატორის PXD020402 ქვეშ.
ელექტროსპრეის იონიზაციის მას-სპექტრომეტრიასთან ერთად RPLC ანალიზისთვის, RC-LH1 კომპლექსი მომზადდა ველური ტიპის Rps-დან. ადრე გამოქვეყნებული მეთოდის (16) გამოყენებით, palustris უჯრედებში წარმოქმნილი ცილის კონცენტრაცია იყო 2 მგ მლ-1 20 mM Hepes-ში (pH 7.8), 100 mM NaCl-ში და 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad ანალიზი) ) DDM-ში. მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით, გამოიყენეთ 2D გამწმენდი ნაკრები (GE Healthcare, USA) 10 μg ცილის ამოსაღებად დალექვის მეთოდით და გახსენით ნალექი 20 μl 60% (v/v) ჭიანჭველმჟავაში (FA), 20% (v/v) აცეტონიტრილში და 20% (v/v) წყალში. ხუთი მიკროლიტრი გაანალიზდა RPLC-ით (Dionex RSLC) მას-სპექტრომეტრიასთან ერთად (Maxis UHR-TOF, Bruker). გამოყოფისთვის გამოიყენეთ MabPac 1.2×100 მმ სვეტი (Thermo Fisher Scientific, დიდი ბრიტანეთი) 60°C ტემპერატურაზე და 100μlmin -1 ტემპერატურაზე, 85% (v/v) გამხსნელი A [0.1% (v/v) FA და 0.02% (V/v) TFA წყალხსნარში] გრადიენტით 85% (v/v) გამხსნელ B-მდე [0.1% (v/v) FA და 0.02% (v/v) 90% (v/v) აცეტონიტრილ TFA-ში]. სტანდარტული ელექტროსპრეის იონიზაციის წყაროს და ნაგულისხმევი პარამეტრების გამოყენებით 60 წუთზე მეტი ხნის განმავლობაში, მას-სპექტრომეტრი იღებს 100-დან 2750 მ/ზ-მდე (მასა-მუხტის თანაფარდობა). ExPASy ბიოინფორმატიკული რესურსების პორტალის FindPept ინსტრუმენტის (https://web.expasy.org/findpept/) დახმარებით, მასის სპექტრი კომპლექსის ქვეერთეულებზე დააკავშირეთ.
უჯრედები 72 საათის განმავლობაში გაიზარდა 100 მლ დაბალი (10μMm-2 s-1), საშუალო (30μMm-2 s-1) ან მაღალი (300μMm-2 s-1) სინათლის ქვეშ. M22 გარემო (M22 გარემო, რომელშიც ამონიუმის სულფატი გამოტოვებულია და ნატრიუმის სუქცინატი ჩანაცვლებულია ნატრიუმის აცეტატით) 100 მლ ხრახნიან ბოთლში (23). ხუთ 30-წამიან ციკლში, 0.1 მიკრონიანი მინის მძივები დამუშავდა 1:1 მოცულობითი თანაფარდობით უჯრედების დასაშლელად და გაცივდა ყინულზე 5 წუთის განმავლობაში. უხსნადი ნივთიერება, დაუზიანებელი უჯრედები და მინის მძივები ამოიღეს ცენტრიფუგირებით 16,000 RCF ტემპერატურაზე 10 წუთის განმავლობაში, მაგიდის მიკროცენტრიფუგაში. მემბრანა გამოიყო Ti 70.1 როტორში 100,000 RCF-ით 20 mM tris-HCl-ში (pH 8.0) 40/15% (w/w) საქაროზას გრადიენტით 10 საათის განმავლობაში.
როგორც ჩვენს წინა ნაშრომშია აღწერილი, His ტეგის იმუნოდეტექცია PufW-ზე (16). მოკლედ, გაწმენდილი ბირთვის კომპლექსი (11.8 nM) ან მემბრანა, რომელიც შეიცავს RC-ს იმავე კონცენტრაციას (განისაზღვრა დაჟანგვით, შემცირებული სხვაობის სპექტრის გამოკლებით და შეღებილ გელზე დატვირთვის შესაბამისობით) 2x SDS დატვირთვის ბუფერში (Merck, დიდი ბრიტანეთი) ორჯერ განზავდა. ცილები გამოეყო რეპლიკა 12%-იან ბის-ტრის NuPage გელზე (Thermo Fisher Scientific, დიდი ბრიტანეთი). გელი შეღებილი იქნა Coomassie Brilliant Blue-ით (Bio-Rad, დიდი ბრიტანეთი) RC-L ქვეერთეულის ჩასატვირთად და ვიზუალიზაციისთვის. მეორე გელზე არსებული ცილა გადატანილი იქნა მეთანოლით გააქტიურებულ პოლივინილიდენ ფტორიდის (PVDF) მემბრანაზე (Thermo Fisher Scientific, დიდი ბრიტანეთი) იმუნოანალიზისთვის. PVDF მემბრანა დაიბლოკა 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 და 5% (w/v) უცხიმო რძის ფხვნილში, შემდეგ კი ინკუბირებული იქნა ანტი-His პირველად ანტისხეულთან (განზავებული ანტისხეულების ბუფერში [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl და 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, აშშ) 4 საათის განმავლობაში. ანტისხეულების ბუფერში 5 წუთის განმავლობაში 3-ჯერ გარეცხვის შემდეგ, მემბრანა შეურიეს ხრენის პეროქსიდაზას (Sigma-Aldrich, დიდი ბრიტანეთი) ანტი-თაგვის მეორად ანტისხეულს (განზავებული 1:10,000 პროპორციით ანტისხეულების ბუფერში). ინკუბაცია მოახდინეს დეტექტირებისთვის (ანტისხეულების ბუფერში 3 გარეცხვიდან 5 წუთის შემდეგ) WESTAR ETA C 2.0 ქემილუმინესცენციის სუბსტრატის (Cyanagen, იტალია) და Amersham Imager 600-ის (GE Healthcare, დიდი ბრიტანეთი) გამოყენებით.
ImageJ (57)-ში თითოეული შეღებილი გელის ან იმუნოანალიზის ზოლის ინტენსივობის განაწილების დახაზვით, პიკის ქვეშ არსებული ფართობის ინტეგრირებით და RC-L-ის (შეღებილი გელი) და Protein-W-ის (იმუნოანალიზი) ინტენსივობის თანაფარდობის გამოთვლით, გამოსახულების დამუშავება. ეს თანაფარდობები მოლურ თანაფარდობებად გადაკეთდა იმის დაშვებით, რომ სუფთა RC-LH114-W ნიმუშში RC-L-ისა და Protein-W-ის თანაფარდობა 1:1 იყო და შესაბამისად, მთელი მონაცემთა ნაკრების ნორმალიზებით.
ამ სტატიის დამატებითი მასალებისთვის იხილეთ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
ეს არის ღია წვდომის სტატია, რომელიც გავრცელებულია Creative Commons Attribution License-ის პირობებით. სტატია იძლევა შეუზღუდავი გამოყენების, გავრცელებისა და რეპროდუცირების საშუალებას ნებისმიერ მედიაში იმ პირობით, რომ ორიგინალი ნაშრომი სათანადოდ არის ციტირებული.
შენიშვნა: ჩვენ მხოლოდ თქვენი ელექტრონული ფოსტის მისამართის მითითებას გთხოვთ, რათა გვერდზე თქვენს მიერ რეკომენდაციის გაწევრიანებულმა პირმა იცოდეს, რომ გსურთ, რომ მათ ელ.წერილი ნახონ და რომ ის სპამი არ არის. ჩვენ არ შევინახავთ ელექტრონული ფოსტის მისამართებს.
ეს კითხვა გამოიყენება იმის შესამოწმებლად, ხართ თუ არა ვიზიტორი და ავტომატური სპამის გაგზავნის თავიდან ასაცილებლად.
დევიდ ჯ.კ. სვეინსბერი, პარკ ციანი, ფილიპ ჯ. ჯექსონი, კეიტლინ მ. ფერიესი, დარიუშ მ. ნიდზვიეძკი, ელიზაბეტ ს. მარტინი, დევიდ ა. ფარმერი, ლორნა ა. მელოუნი, რებეკა ფ. ტომპსონი, ნილ ა. რენსონი, დენიელ პ. კანიფი, მარკ ჯ. დიკმანი, დიუი ჰოლტენი, კრისტინ კირმაიერი, ენდრიუ ჰიჩკოკი, ს. ნილ ჰანტერი
რეაქციის ცენტრში სინათლის ხაფანგ 1 კომპლექსის მაღალი გარჩევადობის სტრუქტურა ქინონის დინამიკის შესახებ ახალ ინფორმაციას გვაწვდის.
დევიდ ჯ.კ. სვეინსბერი, პარკ ციანი, ფილიპ ჯ. ჯექსონი, კეიტლინ მ. ფერიესი, დარიუშ მ. ნიდზვიეძკი, ელიზაბეტ ს. მარტინი, დევიდ ა. ფარმერი, ლორნა ა. მელოუნი, რებეკა ფ. ტომპსონი, ნილ ა. რენსონი, დენიელ პ. კანიფი, მარკ ჯ. დიკმანი, დიუი ჰოლტენი, კრისტინ კირმაიერი, ენდრიუ ჰიჩკოკი, ს. ნილ ჰანტერი
რეაქციის ცენტრში სინათლის ხაფანგ 1 კომპლექსის მაღალი გარჩევადობის სტრუქტურა ქინონის დინამიკის შესახებ ახალ ინფორმაციას გვაწვდის.
©2021 ამერიკის ასოციაცია მეცნიერების წინსვლისთვის. ყველა უფლება დაცულია. AAAS არის HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef და COUNTER-ის პარტნიორი. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.