აწმყო *მიმდინარე მისამართი: კიოლნი 50931, გერმანია, კიოლნის ბრწყინვალების კლასტერული კვლევა უჯრედული სტრესთან რეაგირების შესახებ დაბერებასთან დაკავშირებულ დაავადებებში (CECAD).
მიტოქონდრიული დაავადებების ნეიროდეგენერაცია შეუქცევადად ითვლება, რადგან ნეირონების მეტაბოლური პლასტიურობა შეზღუდულია, თუმცა მიტოქონდრიული დისფუნქციის გავლენა ორგანიზმში ნეირონული მეტაბოლიზმის უჯრედულ ავტონომიაზე ცუდად არის შესწავლილი. აქ ჩვენ წარმოგიდგენთ პურკინიეს ნეირონების უჯრედ-სპეციფიკურ პროტეომას, რომელსაც აქვს პროგრესული OXPHOS დეფიციტი, რაც გამოწვეულია მიტოქონდრიული შერწყმის დინამიკის დარღვევით. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ მიტოქონდრიულმა დისფუნქციამ გამოიწვია პროტეომიკის სფეროში ღრმა ცვლილება, რამაც საბოლოოდ გამოიწვია ზუსტი მეტაბოლური პროგრამების თანმიმდევრული აქტივაცია უჯრედის სიკვდილამდე. მოულოდნელად, ჩვენ დავადგინეთ პირუვატ კარბოქსილაზას (PCx) და სხვა დაბერების საწინააღმდეგო ფერმენტების აშკარა ინდუქცია, რომლებიც ავსებენ TCA ციკლის შუალედურ პროდუქტებს. PCx-ის ინჰიბირებამ გაამწვავა ჟანგვითი სტრესი და ნეიროდეგენერაცია, რაც მიუთითებს, რომ ათეროსკლეროზს აქვს დამცავი ეფექტი OXPHOS-ის არმქონე ნეირონებში. მიტოქონდრიული შერწყმის აღდგენა ტერმინალურად დეგენერირებულ ნეირონებში მთლიანად ცვლის ამ მეტაბოლურ მახასიათებლებს, რითაც ხელს უშლის უჯრედების სიკვდილს. ჩვენი დასკვნები ადგენს აქამდე უცნობ გზებს, რომლებიც ანიჭებენ მდგრადობას მიტოქონდრიული დისფუნქციის მიმართ და აჩვენებს, რომ ნეიროდეგენერაცია შეიძლება შექცევადი იყოს დაავადების გვიან სტადიებზეც კი.
მიტოქონდრიების ცენტრალურ როლს ნეირონული ენერგიის მეტაბოლიზმის შენარჩუნებაში ხაზს უსვამს ადამიანის მიტოქონდრიულ დაავადებებთან დაკავშირებული ფართო ნევროლოგიური სიმპტომები. ამ დაავადებების უმეტესობა გამოწვეულია გენის მუტაციებით, რომლებიც არეგულირებენ მიტოქონდრიულ გენის ექსპრესიას (1, 2) ან გენის დესტრუქციით, რომელიც დაკავშირებულია მიტოქონდრიულ დინამიკასთან, რაც ირიბად მოქმედებს მიტოქონდრიული დნმ-ის (mtDNA) სტაბილურობაზე (3, 4). ცხოველებზე ჩატარებულმა კვლევამ აჩვენა, რომ მიმდებარე ქსოვილებში მიტოქონდრიული დისფუნქციის საპასუხოდ, შეიძლება გააქტიურდეს კონსერვატიული მეტაბოლური გზები (5-7), რაც მნიშვნელოვან ინფორმაციას იძლევა ამ რთული დაავადებების პათოგენეზის სიღრმისეული გაგებისთვის. ამის საპირისპიროდ, ჩვენი გაგება ტვინის მიტოქონდრიული ადენოზინტრიფოსფატის (ATP) წარმოების ზოგადი უკმარისობით გამოწვეული კონკრეტული უჯრედების მეტაბოლური ცვლილებების შესახებ ფუნდამენტურია (8), რაც ხაზს უსვამს თერაპიული სამიზნეების იდენტიფიცირების აუცილებლობას, რომელთა გამოყენება შესაძლებელია დაავადებების პრევენციის ან პრევენციისთვის. ნეიროდეგენერაციის პრევენცია (9). ინფორმაციის ნაკლებობა მდგომარეობს იმ ფაქტში, რომ ნერვულ უჯრედებს ფართოდ მიიჩნევენ, რომ აქვთ ძალიან შეზღუდული მეტაბოლური მოქნილობა მიმდებარე ქსოვილების უჯრედების ტიპებთან შედარებით (10). იმის გათვალისწინებით, რომ ეს უჯრედები ცენტრალურ როლს ასრულებენ ნეირონებისთვის მეტაბოლიტების მიწოდების კოორდინაციაში, რათა ხელი შეუწყონ სინაფსურ გადაცემას და რეაგირება მოახდინონ დაზიანებასა და დაავადების პირობებზე, უჯრედული მეტაბოლიზმის ადაპტაციის უნარი ტვინის ქსოვილის რთულ პირობებთან თითქმის შემოიფარგლება გლიური უჯრედებით (11-14). გარდა ამისა, ტვინის ქსოვილის თანდაყოლილი უჯრედული ჰეტეროგენულობა დიდწილად აფერხებს კონკრეტულ ნეირონულ ქვეჯგუფებში მიმდინარე მეტაბოლური ცვლილებების შესწავლას. შედეგად, ნეირონებში მიტოქონდრიული დისფუნქციის ზუსტი უჯრედული და მეტაბოლური შედეგების შესახებ ცოტა რამ არის ცნობილი.
მიტოქონდრიული დისფუნქციის მეტაბოლური შედეგების გასაგებად, ჩვენ გამოვყავით პურკინიეს ნეირონები (PNs) ნეიროდეგენერაციის სხვადასხვა სტადიაზე, რაც გამოწვეულია მიტოქონდრიის გარეთა მემბრანის შერწყმის (Mfn2) დაზიანებით. მიუხედავად იმისა, რომ ადამიანებში Mfn2 მუტაციები ასოცირდება მემკვიდრეობითი მოტორული სენსორული ნეიროპათიის ფორმასთან, რომელიც ცნობილია როგორც შარკო-მარი-ტუტის ტიპი 2A (15), თაგვებში Mfn2-ის პირობითი განადგურება არის ჟანგვის ფოსფორილირების ინდუქციის (OXPHOS) დისფუნქციის კარგად აღიარებული მეთოდი. სხვადასხვა ნეირონულ ქვეტიპებს (16-19) და შედეგად მიღებულ ნეიროდეგენერაციულ ფენოტიპს თან ახლავს პროგრესირებადი ნევროლოგიური სიმპტომები, როგორიცაა მოძრაობის დარღვევები (18, 19) ან ნათხემის ატაქსია (16). ეტიკეტის გარეშე რაოდენობრივი (LFQ) პროტეომიკის, მეტაბოლომიკის, ვიზუალიზაციისა და ვირუსოლოგიური მეთოდების კომბინაციის გამოყენებით, ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ პროგრესირებადი ნეიროდეგენერაცია ძლიერად იწვევს პირუვატ კარბოქსილაზას (PCx) და სხვა ფაქტორებს, რომლებიც მონაწილეობენ PN-ების არტერიოსკლეროზში in vivo ფერმენტების ექსპრესიაში. ამ აღმოჩენის შესაბამისობის დასადასტურებლად, ჩვენ კონკრეტულად შევამცირეთ PCx-ის ექსპრესია Mfn2-დეფიციტურ პერიფერიულ ნევროლოგიურ უჯრედებში და აღმოვაჩინეთ, რომ ამ ოპერაციამ გაამწვავა ჟანგვითი სტრესი და დააჩქარა ნეიროდეგენერაცია, რითაც დავამტკიცეთ, რომ აზოოსპერმია უზრუნველყოფს უჯრედების სიკვდილს. მეტაბოლური ადაპტირება. MFN2-ის მძიმე ექსპრესიას შეუძლია სრულად გადაარჩინოს ტერმინალური დეგენერაციის პერიფერიული ნევროლოგიური დაავადება OXPHOS-ის მძიმე დეფიციტით, მიტოქონდრიული დნმ-ის მასიური მოხმარებით და აშკარად დაზიანებული მიტოქონდრიული ქსელით, რაც კიდევ უფრო ხაზს უსვამს იმ ფაქტს, რომ ნეიროდეგენერაციის ამ ფორმას შეუძლია გამოჯანმრთელება დაავადების გვიან სტადიაშიც კი, უჯრედების სიკვდილამდე.
Mfn2 ნოკაუტირებულ პერიფერიულ ნერვულ უჯრედებში მიტოქონდრიების ვიზუალიზაციისთვის, ჩვენ გამოვიყენეთ თაგვის შტამი, რომელიც Cre-დამოკიდებულ მიტოქონდრიებს საშუალებას აძლევს, მიზანში ამოიღონ ყვითელი ფლუორესცენტული ცილის (YFP) (mtYFP) (20) Cre ექსპრესია და შევამოწმეთ მიტოქონდრიული მორფოლოგია in vivo. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ პერიფერიულ ნერვულ უჯრედებში Mfn2 გენის განადგურება მიტოქონდრიული ქსელის თანდათანობით დაყოფას გამოიწვევდა (სურათი S1A) და ყველაზე ადრეული ცვლილება 3 კვირის ასაკში დაფიქსირდა. ამის საპირისპიროდ, პერიფერიული ნერვულ უჯრედული შრის მნიშვნელოვანი დეგენერაცია, რასაც კალბინდინის იმუნოშეღებვის დაკარგვა ადასტურებს, 12 კვირის ასაკამდე არ დაწყებულა (სურათი 1, A და B). მიტოქონდრიული მორფოლოგიის ყველაზე ადრეულ ცვლილებებსა და ნეირონული სიკვდილის ხილულ დაწყებას შორის დროის შეუსაბამობამ გვაიძულა, გამოგვეკვლია მიტოქონდრიული დისფუნქციით გამოწვეული მეტაბოლური ცვლილებები უჯრედის სიკვდილამდე. ჩვენ შევიმუშავეთ ფლუორესცენციით გააქტიურებული უჯრედების დახარისხების (FACS) ბაზაზე დაფუძნებული სტრატეგია YFP (YFP+)-გამომხატველი PN-ის იზოლირებისთვის (სურათი 1C) და საკონტროლო თაგვებში (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP: : L7-cre), შემდგომში მოხსენიებული, როგორც CTRL (სურათი S1B). YFP სიგნალის ფარდობითი ინტენსივობის საფუძველზე კარიბჭის სტრატეგიის ოპტიმიზაცია საშუალებას გვაძლევს გავწმინდოთ PN-ების YFP+ სხეული (YFPhigh) არა-PN-ებისგან (YFPneg) (სურათი S1B) ან სავარაუდო ფლუორესცენტული აქსონის/დენდრიტული ფრაგმენტებისგან (YFPlow; სურათი S1D, მარცხნივ), რაც დადასტურდა კონფოკალური მიკროსკოპით (სურათი S1D, მარჯვნივ). კლასიფიცირებული პოპულაციის იდენტურობის დასადასტურებლად, ჩვენ ჩავატარეთ LFQ პროტეომიკა და შემდეგ მთავარი კომპონენტების ანალიზი და აღმოვაჩინეთ, რომ არსებობს მკაფიო გამიჯვნა YFPhigh და YFPneg უჯრედებს შორის (სურათი S1C). YFPhigh უჯრედებმა აჩვენეს ცნობილი PNs მარკერების (მაგ. Calb1, Pcp2, Grid2 და Itpr3) წმინდა გამდიდრება (21, 22), მაგრამ არ იყო ნეირონებში ან სხვა ტიპის უჯრედებში ხშირად გამოხატული ცილების გამდიდრება (სურათი 1D). დამოუკიდებელ ექსპერიმენტებში შეგროვებული კლასიფიცირებული YFPhigh უჯრედების ნიმუშებს შორის შედარებამ აჩვენა კორელაციის კოეფიციენტი > 0.9, რაც აჩვენებს კარგ რეპროდუცირებადობას ბიოლოგიურ რეპლიკაციებს შორის (სურათი S1E). შეჯამებისთვის, ამ მონაცემებმა დაადასტურა ჩვენი გეგმა შესაძლო PN-ის მწვავე და სპეციფიკური იზოლაციისთვის. იმის გამო, რომ გამოყენებული L7-cre დრაივერის სისტემა იწვევს მოზაიკურ რეკომბინაციას მშობიარობიდან პირველი კვირის განმავლობაში (23), ჩვენ დავიწყეთ თაგვების გამოყოფა CTRL-დან და პირობითი (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) კოლექციიდან. რეკომბინაციის დასრულების შემდეგ, მას 4 კვირის ასაკში Mfn2cKO ეწოდება. საბოლოო წერტილად ჩვენ ავირჩიეთ 8 კვირის ასაკი, როდესაც PN ფენა ხელუხლებელი იყო მიტოქონდრიის აშკარა ფრაგმენტაციის მიუხედავად (სურათი 1B და სურათი S1A). საერთო ჯამში, ჩვენ რაოდენობრივად განვსაზღვრეთ 3013 ცილა, რომელთაგან დაახლოებით 22% დაფუძნებული იყო MitoCarta 2.0 ანოტაციებზე, რომლებიც დაფუძნებული იყო მიტოქონდრიულ პროტეომაზე, როგორც მიტოქონდრიაზე (სურათი 1E) (სურათი 1E) (24). მე-8 კვირაში ჩატარებულმა დიფერენციალური გენის ექსპრესიის ანალიზმა აჩვენა, რომ ყველა ცილის მხოლოდ 10.5%-ს ჰქონდა მნიშვნელოვანი ცვლილებები (სურათი 1F და სურათი S1F), რომელთაგან 195 ცილა დაქვეითებული იყო, ხოლო 120 ცილა - ზედმეტად (სურათი 1F). აღსანიშნავია, რომ ამ მონაცემთა ნაკრების „ინოვაციური გზების ანალიზი“ აჩვენებს, რომ დიფერენცირებულად ექსპრესირებული გენები ძირითადად მიეკუთვნება სპეციფიკური მეტაბოლური გზების შეზღუდულ ნაკრებს (სურათი 1G). საინტერესოა, რომ მიუხედავად იმისა, რომ OXPHOS-თან და კალციუმის სიგნალიზაციასთან დაკავშირებული გზების დაქვეითებული რეგულაცია ადასტურებს მიტოქონდრიული დისფუნქციის ინდუქციას შერწყმის დეფიციტის მქონე პერიფერიულ ნეირონებში, სხვა კატეგორიები, რომლებიც ძირითადად ამინომჟავების მეტაბოლიზმს მოიცავს, მნიშვნელოვნად მომატებულია, რაც შეესაბამება მიტოქონდრიულ პერიფერიულ ნეირონებში მიმდინარე მეტაბოლიზმს. გადაკავშირება თანმიმდევრულია.
(A) CTRL და Mfn2cKO თაგვების ნათხემის მონაკვეთების წარმომადგენლობითი კონფოკალური ფოტოები, რომლებიც აჩვენებენ პარენტერალური ნერვების პროგრესულ დაკარგვას (კალბინდინი, ნაცრისფერი); ბირთვები შეღებილი იყო DAPI-ით. (B) (A)-ს რაოდენობრივი განსაზღვრა (ვარიანსის ცალმხრივი ანალიზი, ***P<0.001; n = 4-დან 6 წრემდე სამი თაგვიდან). (C) ექსპერიმენტული სამუშაო პროცესი. (D) პურკინიეს (ზედა) და სხვა უჯრედების ტიპებისთვის სპეციფიკური მარკერების სითბური რუკის განაწილება (შუაში). (E) ვენის დიაგრამა, რომელიც აჩვენებს კლასიფიცირებულ პარენტერალურ ნერვულ ...
პროტეომიკის მონაცემებმა აჩვენა, რომ I, III და IV კომპლექსების ცილის ექსპრესია თანდათან შემცირდა. I, III და IV კომპლექსები შეიცავდა mtDNA-თი კოდირებულ აუცილებელ ქვეერთეულებს, ხოლო II კომპლექსი, რომელიც მხოლოდ ბირთვული კოდირებით იყო დაწერილი, ძირითადად უცვლელი დარჩა (სურათი 2A და სურათი S2A). პროტეომიკის შედეგებთან შესაბამისობაში, ნათხემის ქსოვილის მონაკვეთების იმუნოჰისტოქიმიამ აჩვენა, რომ პარენტერალურ ნევრალგიაში IV კომპლექსის MTCO1 (მიტოქონდრიული ციტოქრომ C ოქსიდაზას ქვეერთეული 1) ქვეერთეულის დონე თანდათან შემცირდა (სურათი 2B). mtDNA-თი კოდირებული Mtatp8 ქვეერთეული მნიშვნელოვნად შემცირდა (სურათი S2A), ხოლო ბირთვული კოდირებული ATP სინთაზას ქვეერთეულის სტაციონარული დონე უცვლელი დარჩა, რაც შეესაბამება ცნობილ სტაბილურ ATP სინთაზას ქვეასამბლეის F1 კომპლექსს, როდესაც mtDNA-ს ექსპრესია სტაბილურია. ფორმირება თანმიმდევრულია. შეწყვეტა (7). დალაგებულ Mfn2cKO პნევმონიაში მტდნმ-ის დონის რეალურ დროში პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციით (qPCR) შეფასებამ დაადასტურა მტდნმ-ის ასლების რაოდენობის თანდათანობითი შემცირება. საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით, 8 კვირის ასაკში, მტდნმ-ის დონის მხოლოდ დაახლოებით 20% იყო შენარჩუნებული (სურათი 2C). ამ შედეგებთან შესაბამისობაში, დნმ-ის აღმოსაჩენად გამოყენებული იქნა Mfn2cKO პნევმონიანების კონფოკალური მიკროსკოპიული შეღებვა, რაც აჩვენებს მიტოქონდრიული ნუკლეოტიდების დროზე დამოკიდებულ მოხმარებას (სურათი 2D). ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ მიტოქონდრიული ცილების დეგრადაციასა და სტრესულ რეაქციაში ჩართული მხოლოდ ზოგიერთი კანდიდატი იყო მომატებული, მათ შორის Lonp1, Afg3l2 და Clpx, და OXPHOS კომპლექსის აწყობის ფაქტორები. აპოპტოზში ჩართული ცილების დონეზე მნიშვნელოვანი ცვლილებები არ დაფიქსირებულა (სურათი S2B). ანალოგიურად, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ კალციუმის ტრანსპორტირებაში ჩართულ მიტოქონდრიებსა და ენდოპლაზმურ ბადის არხებს მხოლოდ მცირე ცვლილებები აქვთ (სურათი S2C). გარდა ამისა, აუტოფაგიასთან დაკავშირებული ცილების შეფასებამ მნიშვნელოვანი ცვლილებები არ გამოავლინა, რაც თანხვედრაშია აუტოფაგოსომების ხილულ ინდუქციასთან, რომელიც in vivo დაკვირვებით იმუნოჰისტოქიმიითა და ელექტრონული მიკროსკოპიით დაფიქსირდა (სურათი S3). თუმცა, პროგრესულ OXPHOS დისფუნქციას პერიფერიულ ნეოპლაზმებში თან ახლავს აშკარა ულტრასტრუქტურული მიტოქონდრიული ცვლილებები. მიტოქონდრიული კლასტერები ჩანს 5 და 8 კვირის ასაკის Mfn2cKO პერიფერიული ნეოპლაზმების უჯრედულ სხეულებსა და დენდრიტულ ხეებში, ხოლო შიდა მემბრანის სტრუქტურამ განიცადა ღრმა ცვლილებები (სურათი S4, A და B). ამ ულტრასტრუქტურულ ცვლილებებთან და mtDNA-ს მნიშვნელოვან შემცირებასთან შესაბამისობაში, ტეტრამეთილროდამინის მეთილის ეთერით (TMRM) მწვავე ცერებრალური ნაჭრების ანალიზმა აჩვენა, რომ Mfn2cKO პერიფერიულ ნეოპლაზმებში მიტოქონდრიული მემბრანული პოტენციალი მნიშვნელოვნად შემცირდა (სურათი S4C).
(A) OXPHOS კომპლექსის ექსპრესიის დონის დროითი მსვლელობის ანალიზი. განიხილეთ მხოლოდ ცილები P<0.05-ით 8 კვირაში (ორმხრივი ANOVA). წერტილოვანი ხაზი: CTRL-თან შედარებით კორექტირება არ არის. (B) მარცხნივ: ანტი-MTCO1 ანტისხეულით მონიშნული ნათხემის მონაკვეთის მაგალითი (მასშტაბის ზოლი, 20 μm). პურკინიეს უჯრედული სხეულებით დაკავებული ფართობი დაფარულია ყვითლად. მარჯვნივ: MTCO1 დონის რაოდენობრივი განსაზღვრა (ვარიანსის ცალმხრივი ანალიზი; n = 7-დან 20-მდე უჯრედი, გაანალიზებული სამი თაგვიდან). (C) mtDNA ასლების რაოდენობის qPCR ანალიზი დახარისხებულ PN-ში (ვარიანსის ცალმხრივი ანალიზი; n = 3-დან 7-მდე თაგვი). (D) მარცხნივ: ანტი-დნმ ანტისხეულით მონიშნული ნათხემის მონაკვეთის მაგალითი (მასშტაბის ზოლი, 20 μm). პურკინიეს უჯრედული სხეულებით დაკავებული ფართობი დაფარულია ყვითლად. მარჯვნივ: mtDNA დაზიანებების რაოდენობრივი განსაზღვრა (ვარიანსის ცალმხრივი ანალიზი; n = 5-დან 9-მდე უჯრედი სამი თაგვიდან). (E) მწვავე ნათხემის მონაკვეთის მაგალითი, რომელიც აჩვენებს mitoYFP + პურკინიეს უჯრედებს (ისარი) მთლიანი უჯრედის პაჩ-კლიპის ჩანაწერში. (F) IV მრუდის რაოდენობრივი განსაზღვრა. (G) დეპოლარიზაციული დენის ინექციის წარმომადგენლობითი ჩანაწერები CTRL და Mfn2cKO პურკინიეს უჯრედებში. ზედა კვალი: პირველი იმპულსი, რომელმაც გამოიწვია AP. ქვედა კვალი: მაქსიმალური AP სიხშირე. (H) პოსტსინაფსური სპონტანური შეყვანის (sPSPs) რაოდენობრივი განსაზღვრა. წარმომადგენლობითი ჩანაწერის კვალი და მისი მასშტაბირების კოეფიციენტი ნაჩვენებია (I)-ში. ვარიაციის ცალმხრივი ანალიზით გაანალიზდა n = 5-დან 20 უჯრედამდე სამი თაგვიდან. მონაცემები გამოხატულია, როგორც საშუალო ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) სპონტანური AP-ის წარმომადგენლობითი კვალი, რომელიც ჩაწერილია პერფორირებული პაჩ-კლიპის რეჟიმის გამოყენებით. ზედა კვალი: მაქსიმალური AP სიხშირე. ქვედა კვალი: ერთი AP-ის მასშტაბირება. (K) განსაზღვრეთ საშუალო და მაქსიმალური AP სიხშირე (J)-ის მიხედვით. მან-უიტნის ტესტი; n = 5 უჯრედი გაანალიზდა ოთხი თაგვიდან. მონაცემები გამოხატულია, როგორც საშუალო ± სტანდარტული სიდიდე; არ არის მნიშვნელოვანი.
8 კვირის Mfn2cKO პარენტერალურ ნეონატში OXPHOS-ის აშკარა დაზიანება დაფიქსირდა, რაც მიუთითებს ნეირონების ფიზიოლოგიური ფუნქციის სერიოზულ დარღვევაზე. ამიტომ, ჩვენ გავაანალიზეთ OXPHOS-დეფიციტური ნეირონების პასიური ელექტრული მახასიათებლები 4-5 და 7-8 კვირაზე, ნათხემის მწვავე ნაჭრებში მთელი უჯრედის პაჩ-კლიმპინგის ჩაწერის გზით (სურათი 2E). მოულოდნელად, Mfn2cKO ნეირონების საშუალო მოსვენების მემბრანული პოტენციალი და შეყვანის წინააღმდეგობა კონტროლის მსგავსი იყო, თუმცა უჯრედებს შორის მცირე განსხვავებები იყო (ცხრილი 1). ანალოგიურად, 4-5 კვირის ასაკში, დენის-ძაბვის თანაფარდობაში (IV მრუდი) მნიშვნელოვანი ცვლილებები არ დაფიქსირებულა (სურათი 2F). თუმცა, 7-8 კვირის ასაკის არცერთი Mfn2cKO ნეირონი არ გადაურჩა ინტრავენურ რეჟიმს (ჰიპერპოლარიზაციის საფეხური), რაც მიუთითებს, რომ ამ გვიან სტადიაზე ჰიპერპოლარიზაციის პოტენციალის მიმართ აშკარა მგრძნობელობაა. ამის საპირისპიროდ, Mfn2cKO ნეირონებში, დეპოლარიზაციული დენები, რომლებიც იწვევენ განმეორებითი მოქმედების პოტენციალის (AP) განმუხტვას, კარგად აიტანება, რაც მიუთითებს, რომ მათი საერთო განმუხტვის ნიმუშები მნიშვნელოვნად არ განსხვავდება 8 კვირის საკონტროლო ნეირონებისგან (ცხრილი 1 და სურათი 2G). ანალოგიურად, სპონტანური პოსტსინაფსური დენების (sPSC) სიხშირე და ამპლიტუდა შედარებადი იყო საკონტროლო ჯგუფის მონაცემებთან და მოვლენების სიხშირე გაიზარდა 4 კვირიდან 5 კვირამდე, 7 კვირიდან 8 კვირამდე მსგავსი ზრდით (სურათი 2, H და I). სინაფსური მომწიფების პერიოდი პერიფერიულ ნეირონებში (25). მსგავსი შედეგები მიღებული იქნა პერფორირებული პერიფერიული ნეირონების ლაქების შემდეგ. ეს კონფიგურაცია ხელს უშლის უჯრედული ATP დეფექტების შესაძლო კომპენსაციას, რაც შეიძლება მოხდეს მთელი უჯრედის ლაქის დამჭერის ჩაწერისას. კერძოდ, Mfn2cKO ნეირონების მოსვენების მემბრანულ პოტენციალზე და სპონტანურ გაშვების სიხშირეზე გავლენა არ მოუხდენია (სურათი 2, J და K). შეჯამებისთვის, ეს შედეგები მიუთითებს, რომ OXPHOS-ის აშკარა დისფუნქციის მქონე პერიფერიულ ნეირონებს კარგად შეუძლიათ მაღალი სიხშირის განმუხტვის ნიმუშებთან გამკლავება, რაც მიუთითებს კომპენსაციის მექანიზმზე, რომელიც მათ საშუალებას აძლევს შეინარჩუნონ თითქმის ნორმალური ელექტროფიზიოლოგიური რეაქციები.
მონაცემები გამოხატულია საშუალო ± სტანდარტული ზომის მნიშვნელობით (ვარიანსის ცალმხრივი ანალიზი, ჰოლმ-სიდაკის მრავალჯერადი შედარების ტესტი; *P<0.05). ერთეულის ნომერი მითითებულია ფრჩხილებში.
ჩვენ გადავწყვიტეთ გამოგვეკვლია, შეიცავს თუ არა პროტეომიკის მონაცემთა ნაკრებში (სურათი 1G) რომელიმე კატეგორია ისეთ გზებს, რომლებსაც შეუძლიათ OXPHOS-ის მწვავე დეფიციტის წინააღმდეგ ბრძოლა, რითაც აიხსნება, თუ რატომ შეუძლია დაზარალებულ პერიფერიულ კვებას თითქმის ნორმალური ელექტროფიზიოლოგიის შენარჩუნება (სურათი 2, E-დან K-მდე). პროტეომიკის ანალიზმა აჩვენა, რომ განშტოებული ჯაჭვის ამინომჟავების (BCAA) კატაბოლიზმში ჩართული ფერმენტები მნიშვნელოვნად მომატებული იყო (სურათი 3A და სურათი S5A), ხოლო საბოლოო პროდუქტი აცეტილ-CoA (CoA) ან სუქცინილ CoA შეიძლება ავსებდეს ტრიკარბოქსილატებს არტერიოსკლეროზის მჟავის (TCA) ციკლში. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ BCAA ტრანსამინაზა 1-ის (BCAT1) და BCAT2-ის შემცველობა გაიზარდა. ისინი აკატალიზებენ BCAA კატაბოლიზმის პირველ საფეხურს α-კეტოგლუტარატიდან გლუტამატის გენერირებით (26). განშტოებული ჯაჭვის კეტომჟავა დეჰიდროგენაზას (BCKD) კომპლექსის შემადგენელი ყველა ქვეერთეული ზედმეტად აქტიურია (კომპლექსი კატალიზებს შედეგად მიღებული BCAA ნახშირბადის ჩონჩხის შემდგომ და შეუქცევად დეკარბოქსილირებას) (სურათი 3A და სურათი S5A). თუმცა, დახარისხებულ პარენტერალურ უჯრედებში BCAA-ში აშკარა ცვლილებები არ დაფიქსირებულა, რაც შესაძლოა განპირობებული იყოს ამ აუცილებელი ამინომჟავების უჯრედული შეწოვის გაზრდით ან TCA ციკლის შესავსებად სხვა წყაროების (გლუკოზა ან რძემჟავა) გამოყენებით (სურათი S5B). OXPHOS-ის არმქონე პარენტერალურ უჯრედებში ასევე აღინიშნა გლუტამინის დაშლისა და ტრანსამინაციის აქტივობის მომატება 8 კვირის ასაკში, რაც შეიძლება აისახოს მიტოქონდრიული ფერმენტების გლუტამინაზას (GLS) და გლუტამინპირუვატ ტრანსამინაზა 2-ის (GPT2) ზედმეტად აქტიური აქტივობით (სურათი 3, A და C). აღსანიშნავია, რომ GLS-ის ზერეგულაცია შემოიფარგლება სპლაისირებული იზოფორმით გლუტამინაზა C (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL-ის ცვლილება დაახლოებით 4.5-ჯერ მეტია, P = 0.05) და მისი სპეციფიკური ზერეგულაცია სიმსივნურ ქსოვილებში შეიძლება მიტოქონდრიული ბიოენერგიის მხარდაჭერას უწევდეს. (27).
(A) სითბური რუკა აჩვენებს ცილის დონის ცვლილებას მითითებული გზის მიხედვით 8 კვირის შემდეგ. (B) ანტი-PCx ანტისხეულით მონიშნული ნათხემის ნაჭრის მაგალითი (მასშტაბის ზოლი, 20 μm). ყვითელი ისარი მიუთითებს პურკინიეს უჯრედის სხეულზე. (C) ცილის ექსპრესიის დროის კურსის ანალიზი, რომელიც იდენტიფიცირებულია, როგორც ათეროსკლეროზის მნიშვნელოვანი კანდიდატი (მრავალჯერადი t-ტესტი, *FDR <5%; n = 3-5 თაგვი). (D) ზემოთ: სქემატური დიაგრამა, რომელიც აჩვენებს [1-13C]პირუვატის ტრეისერში შემავალი მონიშნული ნახშირბადის შეყვანის სხვადასხვა გზას (ანუ, PDH-ის ან ტრანსარტერიული გზით). ქვემოთ: ვიოლინოს დიაგრამა აჩვენებს ერთჯერადად მონიშნული ნახშირბადის (M1) პროცენტულ მაჩვენებელს, რომელიც გარდაიქმნება ასპარტინის მჟავად, ლიმონმჟავად და ვაშლის მჟავად [1-13C]პირუვატით მწვავე ნათხემის ნაჭრების მონიშვნის შემდეგ (დაწყვილებული t-ტესტი; ** P <0.01). (E) მითითებული გზის ყოვლისმომცველი დროის ისტორიის ანალიზი. განიხილეთ მხოლოდ ის ცილები, რომელთა P<0.05-ია 8 კვირის შემდეგ. წყვეტილი ხაზი: კორექტირების მნიშვნელობა არ არის (ვარიანსის ორმხრივი ანალიზი; * P <0.05; *** P <0.001). მონაცემები გამოხატულია საშუალო ± სტანდარტული შეფასების მეთოდით.
ჩვენს ანალიზში, BCAA კატაბოლიზმი ერთ-ერთ მთავარ აღმავალი რეგულირების გზად იქცა. ეს ფაქტი ნათლად მიუთითებს, რომ TCA ციკლში შემავალი ვენტილაციის მოცულობა შეიძლება შეიცვალოს OXPHOS-ის არმქონე პერიფერიულ ნერვულ კვანძებში. ეს შეიძლება წარმოადგენდეს ნეირონული მეტაბოლური გადაკავშირების ძირითად ფორმას, რამაც შეიძლება პირდაპირი გავლენა მოახდინოს ნეირონულ ფიზიოლოგიასა და გადარჩენაზე OXPHOS-ის მძიმე დისფუნქციის შენარჩუნების დროს. ამ ჰიპოთეზასთან შესაბამისობაში, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ მთავარი ანტიათეროსკლეროზული ფერმენტი PCx აღმავალია (Mfn2cKO/CTRL იცვლება დაახლოებით 1.5-ჯერ; სურათი 3A), რომელიც კატალიზებს პირუვატის ოქსალოაცეტატად გარდაქმნას (28), რომელიც, სავარაუდოდ, ტვინის ქსოვილშია. ექსპრესია შემოიფარგლება ასტროციტებით (29, 30). პროტეომიკის შედეგებთან შესაბამისობაში, კონფოკალურმა მიკროსკოპიამ აჩვენა, რომ PCx ექსპრესია სპეციფიკურად და მნიშვნელოვნად გაიზარდა OXPHOS-დეფიციტურ პერიფერიულ ნერვულ კვანძებში, ხოლო PCx რეაქტიულობა ძირითადად შემოიფარგლა კონტროლის მიმდებარე ბერგმანის გლიური უჯრედებით (სურათი 3B). PCx-ის დაფიქსირებული ამაღლებული რეგულაციის ფუნქციურად შესამოწმებლად, ჩვენ დავამუშავეთ მწვავე ნათხემის ნაჭრები [1-13C]პირუვატის მარკერით. როდესაც პირუვატი იჟანგებოდა პირუვატდეჰიდროგენაზათი (PDH), მისი იზოტოპური ეტიკეტი ქრება, But შედის TCA ციკლის შუალედურ პროდუქტებში, როდესაც პირუვატი მეტაბოლიზდება სისხლძარღვოვანი რეაქციებით (სურათი 3D). ჩვენი პროტეომიკის მონაცემების დასადასტურებლად, ჩვენ დავაკვირდით ამ მარკერის მარკერების დიდ რაოდენობას Mfn2cKO ნაჭრების ასპარტინის მჟავაში, ხოლო ლიმონმჟავას და ვაშლის მჟავას ასევე ჰქონდათ ზომიერი ტენდენცია, თუმცა არა მნიშვნელოვანი (სურათი 3D).
MitoPark თაგვების დოფამინის ნეირონებში, რომლებსაც აღენიშნებოდათ მიტოქონდრიული დისფუნქცია, რაც გამოწვეული იყო დოფამინის ნეირონების მიერ მიტოქონდრიული ტრანსკრიფციის ფაქტორი A გენის (Tfam) სპეციფიკურად განადგურებით (სურათი S6B), PCx ექსპრესია ასევე მნიშვნელოვნად მომატებული იყო (31), რაც მიუთითებს, რომ დაავადების გაჩენა რეგულირდება ორგანიზმში ნეირონული OXPHOS-ის დისფუნქციის დროს. აღსანიშნავია, რომ აღმოჩნდა, რომ უნიკალური ფერმენტები (32-34), რომლებიც შეიძლება ექსპრესირებული იყოს ნეირონებში, რომლებიც შეიძლება ასოცირებული იყოს არტერიოსკლეროზთან, მნიშვნელოვნად მომატებული იყო OXPHOS-ის არმქონე პერიფერიულ ნეირონებში, როგორიცაა პროპიონილ-CoA კარბოქსილაზა (PCC-A), მალონილ-CoA გარდაქმნის პროპიონილ-CoA-ს სუქცინილ-CoA-დ და მიტოქონდრიული ვაშლის ფერმენტი 3 (ME3), რომლის მთავარი როლია პირუვატის აღდგენა მალატიდან (სურათი 3, A და C) (33, 35). გარდა ამისა, ჩვენ აღმოვაჩინეთ Pdk3 ფერმენტის მნიშვნელოვანი ზრდა, რომელიც ფოსფორილებს და ამით ინაქტივირებს PDH-ს (36), მაშინ როდესაც ცვლილებები არ დაფიქსირებულა PDH-ის აქტივატორი Pdp1 ფერმენტში ან თავად PDH ფერმენტულ კომპლექსში (სურათი 3A). შესაბამისად, Mern2cKO პერიფერიულ ნეკროზებში, Ser293-ში (რომელიც ცნობილია, რომ თრგუნავს PDH-ის ფერმენტულ აქტივობას) PDH კომპლექსის პირუვატდეჰიდროგენაზას E1 კომპონენტის α1 ქვეერთეულის α (PDHE1α) ფოსფორილირება გაძლიერებული იყო (სურათი S6C) (სურათი S6C). პირუვატს არ აქვს სისხლძარღვოვანი წვდომა.
და ბოლოს, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ სერინისა და გლიცინის ბიოსინთეზის სუპერგზა, მასთან დაკავშირებული მიტოქონდრიული ფოლატის (1C) ციკლი და პროლინის ბიოსინთეზი (სურათი 1G და სურათი S5C) მნიშვნელოვნად ამაღლებულია, ანგარიშების თანახმად, აქტივაციის პროცესის დროს. მიმდებარე ქსოვილები აქტიურდება მიტოქონდრიული დისფუნქციით (5-7). კონფოკალური ანალიზი, რომელიც ადასტურებს ამ პროტეომიკურ მონაცემებს, აჩვენებს, რომ OXPHOS-ის არარსებობის მქონე პერიფერიული სკლეროზის დროს, 8 კვირის თაგვების ნათხემის ნაჭრები დაექვემდებარა სერინ ჰიდროქსიმეთილტრანსფერაზა 2-ს (SHMT2), მიტოქონდრიული ფოლატის ციკლის ძირითად ფერმენტს. მნიშვნელოვანი იმუნური პასუხი (სურათი S5D). 13 CU-გლუკოზა-ინკუბირებულ მწვავე ნათხემის ნაჭრებში, მეტაბოლური კვალის ექსპერიმენტებმა კიდევ უფრო დაადასტურა სერინისა და პროლინის ბიოსინთეზის ამაღლება, რაც მიუთითებს, რომ ნახშირბადის იზოფორმების ნაკადი სერინსა და პროლინში გაიზარდა (სურათი S5E). ვინაიდან GLS-ისა და GPT2-ის მიერ გამოწვეული რეაქციები პასუხისმგებელია გლუტამინიდან გლუტამატის სინთეზზე და გლუტამატსა და α-კეტოგლუტარატს შორის ტრანსამინაციაზე, მათი აქტივაცია მიუთითებს, რომ OXPHOS-დეფიციტურ ნეირონებს აქვთ გლუტამატის გაზრდილი მოთხოვნილება. ეს შეიძლება მიზნად ისახავდეს პროლინის გაზრდილი ბიოსინთეზის შენარჩუნებას (სურათი S5C). ამ ცვლილებებისგან განსხვავებით, PN-სპეციფიკური Mfn2cKO თაგვების ცერებრული ასტროციტების პროტეომიკურმა ანალიზმა აჩვენა, რომ ამ გზების (მათ შორის ყველა ანტიპეროქსიდაზას) ექსპრესიაში მნიშვნელოვნად არ შეცვლილა, რითაც ნაჩვენებია, რომ ეს მეტაბოლური გადამისამართება შერჩევითია დეგრადირებული PN-ის მიმართ (სურ. S6, D-დან G-მდე).
შეჯამებისთვის, ამ ანალიზებმა გამოავლინა სპეციფიკური მეტაბოლური გზების დროებითი აქტივაციის მნიშვნელოვნად განსხვავებული ნიმუშები პერიფერიულ ნეირონებში. მიუხედავად იმისა, რომ ნეირონული მიტოქონდრიული ფუნქციის დარღვევამ შეიძლება გამოიწვიოს ადრეული ათეროსკლეროზი და 1C რემოდელირება (სურათი 3E და სურათი S5C) და I და IV კომპლექსების ექსპრესიის პროგნოზირებადი ცვლილებებიც კი, სერინის de novo სინთეზის ცვლილებები მხოლოდ გვიან სტადიებზე გამოვლინდა. OXPHOS დისფუნქცია (სურათი 3E და სურათი S5C). ეს დასკვნები განსაზღვრავს თანმიმდევრულ პროცესს, რომლის დროსაც სტრესით გამოწვეული მიტოქონდრიული (1C ციკლი) და ციტოპლაზმური (სერინის ბიოსინთეზი) სინერგიულად რეაგირებს TCA ციკლში ათეროსკლეროზის ზრდასთან, ნეირონული მეტაბოლიზმის ცვლის მიზნით.
8 კვირის OXPHOS-დეფიციტური პერიფერიული ნეირონები (PN) ინარჩუნებენ მაღალი სიხშირის აგზნების აქტივობას და განიცდიან მნიშვნელოვან მეტაბოლურ ხელახლა შეერთებას მიტოქონდრიული დისფუნქციის კომპენსაციის მიზნით. ეს აღმოჩენა საინტერესო შესაძლებლობას წარმოშობს, რომ ამ ეტაპზეც კი, ამ უჯრედებს შეიძლება ასევე მიეცეთ თერაპიული ჩარევა ნეიროდეგენერაციის შეფერხების ან პრევენციის მიზნით. დაგვიანებული. ჩვენ ეს შესაძლებლობა ორი დამოუკიდებელი ჩარევით გადავწყვიტეთ. პირველ მეთოდში, ჩვენ შევქმენით Cre-დამოკიდებული ადენო-ასოცირებული ვირუსის (AAV) ვექტორი, რათა MFN2 შერჩევითად იქნას გამოხატული OXPHOS-დეფიციტურ PN-ებში in vivo (სურათი S7A). MFN2-ის კოდირების AAV და ფლუორესცენტული რეპორტიორის გენი mCherry (Mfn2-AAV) პირველად ნეირონულ კულტურებში in vitro იქნა დადასტურებული, რამაც გამოიწვია MFN2-ის Cre-დამოკიდებული ექსპრესია და გადაარჩინა მიტოქონდრიული მორფოლოგია, რითაც თავიდან აიცილეს ნეირომუტაცია Mfn2cKO ნეირონებში (სურათი S7, B, D და E). შემდეგ, ჩვენ ჩავატარეთ in vivo ექსპერიმენტები, რათა სტერეოტაქტიულად მიგვეტანა 8 კვირის Mfn2-AAV Mfn2cKO და საკონტროლო თაგვების ნათხემის ქერქში და გავაანალიზეთ 12 კვირის თაგვები (სურათი 4A). დამუშავებული Mfn2cKO თაგვები დაიღუპნენ (სურათი 1, A და B) (16). ვირუსული ტრანსდუქცია in vivo-მ გამოიწვია PN-ის შერჩევითი ექსპრესია ზოგიერთ ნათხემის წრეში (სურათი S7, G და H). მხოლოდ mCherry-ს გამომხატველი საკონტროლო AAV-ის ინექციას (Ctrl-AAV) არ მოუხდენია მნიშვნელოვანი გავლენა Mfn2cKO ცხოველებში ნეიროდეგენერაციის ხარისხზე. ამის საპირისპიროდ, Mfn2-AAV-ით ტრანსდუცირებული Mfn2cKO-ების ანალიზმა აჩვენა PN უჯრედული შრის მნიშვნელოვანი დამცავი ეფექტი (სურათი 4, B და C). კერძოდ, ნეირონების სიმკვრივე თითქმის არ განსხვავდება საკონტროლო ცხოველებისგან (სურათი 4, B და C, და სურათი S7, H და I). MFN1-ის, მაგრამ არა MFN2-ის ექსპრესია თანაბრად ეფექტურია ნეირონული სიკვდილის თავიდან ასაცილებლად (სურათი 4C და სურათი S7, C და F), რაც მიუთითებს, რომ ექტოპიური MFN1-ის ექსპრესიას შეუძლია ეფექტურად შეავსოს MFN2-ის დეფიციტი. ერთჯერადი პარენტერალური მიოკარდიუმის დონეზე შემდგომმა ანალიზმა აჩვენა, რომ Mfn2-AAV-მ დიდწილად აღადგინა მიტოქონდრიის ულტრასტრუქტურა, ნორმალიზდა mtDNA-ს დონეები და შეცვალა ანტიანგიოგენეზის მარკერის PCx-ის მაღალი ექსპრესია (სურათი 4, C-დან E-მდე). გადარჩენილი Mfn2cKO თაგვების ვიზუალურმა დათვალიერებამ მოსვენებულ მდგომარეობაში აჩვენა, რომ მათი პოზა და მოტორული სიმპტომები (მოძრაობა S1-დან S3-მდე) გაუმჯობესდა. დასკვნის სახით, ეს ექსპერიმენტები აჩვენებს, რომ MFN2-ის დაგვიანებული ხელახალი შეყვანა პარენტერალურ მიოკარდიუმებში, რომლებსაც OXPHOS-ის მწვავე დეფიციტი აქვთ, საკმარისია mtDNA-ს მოხმარების შესაცვლელად და ათეროსკლეროზის გამოსაწვევად, რითაც თავიდან აიცილებს აქსონის დეგენერაციას და ნეირონულ სიკვდილს in vivo.
(A) სქემა, რომელიც აჩვენებს MFN2-ის კოდირების AAV ინექციის ექსპერიმენტულ გრაფიკს, როდესაც მითითებული მეტაბოლური გზა გააქტიურებულია. (B) 12 კვირის ასაკის ნათხემის ნაჭრების წარმომადგენლობითი კონფოკალური გამოსახულებები, რომლებიც ტრანსდუცირებულია 8 კვირაში Mfn2cKO თაგვებში და მონიშნულია ანტი-კალბინდინის ანტისხეულით. მარჯვნივ: აქსონის ბოჭკოების მასშტაბირება. აქსონის მასშტაბის მასშტაბი არის 450 და 75 μm. (C) მარცხნივ: პურკინიეს უჯრედების სიმკვრივის რაოდენობრივი განსაზღვრა AAV ტრანსდუქციის მარყუჟში (AAV+) (ვარიანსის ცალმხრივი ანალიზი; n = 3 თაგვი). მარჯვნივ: mtDNA ფოკუსის ანალიზი ტრანსდუცირებულ PN-ში 12 კვირაში (დაუწყვილებელი t-ტესტი; n = 6 უჯრედი სამი თაგვიდან). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mfn2cKO ნათხემის მონაკვეთების PN-ების წარმომადგენლობითი ტრანსდუცირებული ელექტრონული მიკროგრაფიები, რომლებიც ტრანსდუცირებულია მითითებული ვირუსული ვექტორებით. ვარდისფერი ნიღაბი ასახავს დენდრიტების მიერ დაკავებულ ფართობს, ხოლო ყვითელი წერტილოვანი კვადრატი ასახავს მარჯვნივ მოცემულ მასშტაბირებას; n წარმოადგენს ბირთვს. მასშტაბის ზოლი, 1μm. (E) გვიჩვენებს PCx შეღებვის მაგალითს PN-ში, რომელიც ტრანსდუცირებულია 12 კვირაში. მასშტაბის ზოლი, 20μm. OE, ზედმეტად გამოხატული; FC, დაკეცვის ცვლილება.
და ბოლოს, ჩვენ გამოვიკვლიეთ პეროქსიდაზათი ინდუცირებული უჯრედების გადარჩენის მნიშვნელობა პერიფერიულ ნევროლოგიურ ნერვებში, რომლებსაც OXPHOS დისფუნქცია აღენიშნებოდათ. ჩვენ შევქმენით mCherry, რომელიც აკოდირებს AAV-shRNA-ს (მოკლე თმის სამაგრი RNA), რომელიც სპეციფიკურად მიმართულია თაგვის PCx mRNA-ზე (AAV-shPCx) და ვირუსი ან მისი შერეული კონტროლი (AAV-scr) შევიყვანეთ Mfn2cKO თაგვების ნათხემში. ინექცია ჩატარდა მეოთხე კვირაში (სურათი 5A), რათა მიღწეულიყო PCx-ის ეფექტური ნოკდაუნი იმ პერიოდში, როდესაც PCx ექსპრესია გაიზარდა (სურათი 3C) და პერიფერიული ნევროლოგიური უჯრედის შრე ჯერ კიდევ ხელუხლებელი იყო (სურათი 1A). აღსანიშნავია, რომ PCx-ის ნოკდაუნი (სურათი S8A) იწვევს პერიფერიული ნევროლოგიური სიკვდილის მნიშვნელოვან აჩქარებას, რაც შემოიფარგლება ინფიცირებული რგოლით (სურათი 5, B და C). PCx-ის ზერეგულაციით გამოწვეული მეტაბოლური ეფექტების მექანიზმის გასაგებად, ჩვენ შევისწავლეთ პერიფერიული ნეირონების რედოქს სტატუსი PCx ნოკდაუნისა და AAV-შუამავლობით ოპტიკური ბიოსენსორის Grx1-roGFP2-ის ერთდროულად ექსპრესიის შემდეგ (სურათი S8, B-დან D-მდე), რათა შეგვეფასებინა გლუტათიონის პეპტიდური რედოქს პოტენციალის ფარდობითი ცვლილება (38). შემდეგ, ჩვენ ჩავატარეთ ორფოტონიანი ფლუორესცენტული სიცოცხლის ხანგრძლივობის ვიზუალიზაციის მიკროსკოპია (FLIM) 7 კვირის Mfn2cKO-ს ან საკონტროლო ნაშიერების მწვავე ტვინის ნაჭრებში, რათა აღმოგვეჩინა ციტოპლაზმური რედოქს სტატუსის პოტენციური ცვლილებები FLIM პირობების დადასტურების შემდეგ (სურათი S8, E-დან G-მდე). ანალიზმა აჩვენა PCx ექსპრესიის არმქონე ერთი Mfn2cKO პერიფერიული ნეირონების დაჟანგვის მდგომარეობის მნიშვნელოვანი ზრდა, რაც განსხვავდება საკონტროლო ნეირონების ან Mfn2cKO პერიფერიული ნეირონებისგან, რომლებიც მხოლოდ დაშლილ shRNA-ს გამოხატავენ (სურათი 5, D და E). როდესაც PCx ექსპრესია დაქვეითდა, მაღალოქსიდაციური მდგომარეობის მქონე Mfn2cKO PN-ების პროცენტული მაჩვენებელი სამჯერ მეტჯერ გაიზარდა (სურათი 5E), რაც მიუთითებს, რომ PCx-ის ზედმეტად რეგულირება ინარჩუნებდა დეგენერირებული ნეირონების რედოქს შესაძლებლობებს.
(A) სქემა, რომელიც აჩვენებს shPCx კოდირების AAV ინექციის ექსპერიმენტულ გრაფიკს, როდესაც მითითებული მეტაბოლური გზა გააქტიურებულია. (B) Mfn2cKO თაგვების 8 კვირის ნათხემის მონაკვეთების წარმომადგენლობითი კონფოკალური ფოტოები, რომლებიც ტრანსდუცირებული და მონიშნულია ანტიკალცინურინის ანტისხეულით 4 კვირაში. მასშტაბის ზოლი, 450μm. (C) პურკინიეს უჯრედების სიმკვრივის რაოდენობრივი განსაზღვრა AAV-ტრანსდუცირებულ მარყუჟებში (ვარიანსის ცალმხრივი ანალიზი; n = 3-დან 4-მდე თაგვი). მონაცემები გამოხატულია საშუალო ± SEM; ***P<0.001. (D) წარმომადგენლობითი FLIM სურათი აჩვენებს 7 კვირის PN-ის საშუალო სიცოცხლის ხანგრძლივობას, რომელიც გამოხატავს გლუტათიონ-რედოქს სენსორს Grx1-roGFP2 მითითებულ ექსპერიმენტულ პირობებში. LUT (საძიებო ცხრილი) თანაფარდობა: გადარჩენის დროის ინტერვალი (პიკოწამებში). მასშტაბის ზოლი, 25μm. (E) ჰისტოგრამა გვიჩვენებს Grx1-roGFP2 სიცოცხლის ხანგრძლივობის მნიშვნელობების განაწილებას (D)-დან (n=158-დან 368 უჯრედამდე ორ თაგვში თითოეული პირობის გათვალისწინებით). თითოეული ჰისტოგრამის ზემოთ მოცემული წრიული დიაგრამა აჩვენებს უჯრედების რაოდენობას მნიშვნელოვნად უფრო გრძელი (წითელი, დაჟანგული) ან უფრო მოკლე (ლურჯი, შემცირებული) სიცოცხლის ხანგრძლივობის მნიშვნელობებით, რომლებიც აღემატება CTRL-AAV-scr-ში საშუალო სიცოცხლის ხანგრძლივობის 1 სტანდარტული გადახრას. (F) შემოთავაზებული მოდელი აჩვენებს ნეირონული PCx-ის ზერეგულაციის დამცავ ეფექტს.
საბოლოო ჯამში, ჩვენს მიერ მოწოდებული მონაცემები აჩვენებს, რომ MFN2-ის ხელახალი ექსპრესიით შესაძლებელია OXPHOS-ის მძიმე დეფიციტით, mtDNA-ს მძიმე გამოფიტვით და უკიდურესად ანომალიური ista-ს მსგავსი მორფოლოგიით განვითარებული შორსწასული პერიფერიული დაავადების სრულად გადარჩენა, რითაც უზრუნველყოფილია უწყვეტი პროგრესირება შორსწასული დაავადებების დროსაც კი. ნეიროდეგენერაცია წარმოადგენს უჯრედის სიკვდილამდე არსებული ეტაპის შექცევად მტკიცებულებას. მეტაბოლური მოქნილობის ამ ხარისხს კიდევ უფრო აძლიერებს ნეირონების უნარი, გამოიწვიონ ათეროსკლეროზი (TCA ციკლის გადაკეთება), რაც აფერხებს PCx ექსპრესიას OXPHOS-ის არმქონე პერიფერიულ ნერვულ უჯრედებში და აძლიერებს უჯრედების სიკვდილს, რითაც ასრულებს დამცავ როლს (სურათი 5F).
ამ კვლევაში ჩვენ წარმოვადგინეთ მტკიცებულება, რომ პერიფერიული ნეირონების რეაქცია OXPHOS დისფუნქციაზე თანდათანობით გადადის TCA ციკლის ათეროსკლეროზთან მეტაბოლური პროგრამებით გააქტიურებული დიფერენციალური აქტივაციის გზის მეშვეობით. ჩვენ დავადასტურეთ პროტეომიკური ანალიზი მრავალი დამატებითი მეთოდით და გამოვავლინეთ, რომ მძიმე მიტოქონდრიული დისფუნქციის დროს ნეირონებს აქვთ მეტაბოლური ელასტიურობის აქამდე უცნობი ფორმა. ჩვენდა გასაკვირად, მთელი გადაკავშირების პროცესი სულაც არ აღნიშნავს ნეიროდეგენერაციის თანმხლებ ტერმინალურ მეტაბოლურ მდგომარეობას თანდათანობით და შეუქცევადად, მაგრამ ჩვენი მონაცემები მიუთითებს, რომ ის შეიძლება წარმოადგენდეს შემანარჩუნებელ ნეირონს უჯრედის სიკვდილამდე სტადიაშიც კი. ფუნქციური კომპენსაციის მექანიზმი. ეს აღმოჩენა მიუთითებს, რომ ნეირონებს აქვთ მეტაბოლური პლასტიურობის მნიშვნელოვანი ხარისხი ორგანიზმში. ეს ფაქტი ადასტურებს, რომ MFN2-ის მოგვიანებით ხელახლა შეყვანას შეუძლია შეცვალოს ძირითადი მეტაბოლური მარკერების ექსპრესიის ექსპრესია და თავიდან აიცილოს პერიფერიული ნეირონების დეგენერაცია. პირიქით, ის აფერხებს ათეროსკლეროზს და აჩქარებს ნერვებს. ტრანსსექსუალი.
ჩვენი კვლევის ერთ-ერთი ყველაზე საინტერესო აღმოჩენა ის არის, რომ პერიფერიულ ნეირონებს, რომლებსაც არ აქვთ OXPHOS, შეუძლიათ TCA ციკლის მეტაბოლიზმის შეცვლა იმ ფერმენტების აქტივაციის გაძლიერებით, რომლებიც სპეციფიკურად ასტიმულირებენ არტერიოსკლეროზს. მეტაბოლური გადალაგება კიბოს უჯრედების საერთო მახასიათებელია, რომელთაგან ზოგიერთი დამოკიდებულია გლუტამინზე TCA ციკლის შუალედური პროდუქტების შესავსებად, რათა წარმოქმნან აღმდგენი ეკვივალენტები, რომლებიც ახორციელებენ სუნთქვის ჯაჭვის სტიმულირებას და ინარჩუნებენ ლიპიდური და ნუკლეოტიდური ბიოსინთეზის წინამორბედების წარმოებას (39, 40). ბოლოდროინდელმა კვლევამ აჩვენა, რომ პერიფერიულ ქსოვილებში, რომლებიც განიცდიან OXPHOS დისფუნქციას, გლუტამინის/გლუტამატის მეტაბოლიზმის ხელახალი დაკავშირება ასევე მნიშვნელოვანი მახასიათებელია (5, 41), სადაც გლუტამინის TCA ციკლში შესვლის მიმართულება დამოკიდებულია OXPHOS დაზიანების სიმძიმეზე (41). თუმცა, არ არსებობს მკაფიო მტკიცებულება ორგანიზმში ნეირონული მეტაბოლური პლასტიურობის ნებისმიერი მსგავსების და მისი შესაძლო მნიშვნელობის შესახებ დაავადების კონტექსტში. ბოლოდროინდელ in vitro კვლევაში ნაჩვენები იყო, რომ პირველადი კორტიკალური ნეირონები ახდენენ გლუტამატის აუზების მობილიზებას ნეიროტრანსმისიისთვის, რითაც ხელს უწყობენ ჟანგვით მეტაბოლიზმს და ათეროსკლეროზს მეტაბოლური სტრესის პირობებში (42). აღსანიშნავია, რომ TCA ციკლის ფერმენტ სუქცინატ დეჰიდროგენაზას ფარმაკოლოგიური ინჰიბირების დროს, პირუვატის კარბოქსილირება, სავარაუდოდ, ხელს უწყობს ოქსალოაცეტატის სინთეზის შენარჩუნებას ნათხემის გრანულების კულტივირებულ ნეირონებში (34). თუმცა, ამ მექანიზმების ფიზიოლოგიურ მნიშვნელობას ტვინის ქსოვილისთვის (სადაც, სავარაუდოდ, ათეროსკლეროზი ძირითადად ასტროციტებით შემოიფარგლება) კვლავ მნიშვნელოვანი ფიზიოლოგიური მნიშვნელობა აქვს (43). ამ შემთხვევაში, ჩვენი მონაცემები აჩვენებს, რომ ორგანიზმში OXPHOS-ით დაზიანებული პარენტერალური უჯრედები შეიძლება გადავიდეს BCAA-ს დეგრადაციასა და პირუვატის კარბოქსილირებაზე, რომლებიც TCA-ს პულის შუალედური პროდუქტების დამატების ორ მთავარ წყაროს წარმოადგენს. მიუხედავად იმისა, რომ BCAA კატაბოლიზმის სავარაუდო წვლილი ნეირონულ ენერგეტიკულ მეტაბოლიზმში იქნა შემოთავაზებული, გლუტამატისა და GABA-ს როლის გარდა ნეიროტრანსმისიისთვის (44), ჯერ კიდევ არ არსებობს მტკიცებულება ამ მექანიზმების შესახებ in vivo. ამიტომ, ადვილია ვივარაუდოთ, რომ დისფუნქციურ პარენტერალურ უჯრედებს შეუძლიათ ავტომატურად კომპენსირება მოახდინონ TCA შუალედური პროდუქტების მოხმარებისთვის, რაც გამოწვეულია ასიმილაციის პროცესით ათეროსკლეროზის გაზრდით. კერძოდ, PCx-ის აქტივაცია შესაძლოა საჭირო გახდეს ასპარტინის მჟავაზე გაზრდილი მოთხოვნილების შესანარჩუნებლად, რაც მიტოქონდრიული დისფუნქციის მქონე პროლიფერაციულ უჯრედებშია მიტოქონდრიული (45). თუმცა, ჩვენმა მეტაბოლომიკურმა ანალიზმა არ გამოავლინა ასპარტინის მჟავას სტაბილური დონის რაიმე მნიშვნელოვანი ცვლილებები Mfn2cKO PN-ებში (სურათი S6A), რაც, სავარაუდოდ, ასახავს ასპარტინის მჟავას განსხვავებულ მეტაბოლურ გამოყენებას პროლიფერაციულ უჯრედებსა და პოსტმიტოზურ ნეირონებს შორის. მიუხედავად იმისა, რომ დისფუნქციურ ნეირონებში PCx-ის აქტივაციის ზუსტი მექანიზმი in vivo ჯერ კიდევ დასახასიათებელია, ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ ეს ნაადრევი რეაქცია მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ნეირონების რედოქს მდგომარეობის შენარჩუნებაში, რაც ნაჩვენები იყო FLIM ექსპერიმენტებში ნათხემის ნაჭრებზე. კერძოდ, PN-ების მიერ PCx-ის აქტივაციის აქტივაციის თავიდან აცილებამ შეიძლება გამოიწვიოს უფრო დაჟანგული მდგომარეობა და დააჩქაროს უჯრედების სიკვდილი. BCAA-ს დეგრადაციის გააქტიურება და პირუვატის კარბოქსილირება არ არის მიტოქონდრიული დისფუნქციის პერიფერიული ქსოვილების დასახასიათებლად (7). ამიტომ, როგორც ჩანს, ისინი OXPHOS-დეფიციტური ნეირონების პრიორიტეტულ მახასიათებლად გვევლინებიან, თუმცა არა ერთადერთ მახასიათებლად, რაც მნიშვნელოვანია ნეიროდეგენერაციისთვის.
ცერებრული დაავადება ნეიროდეგენერაციული დაავადების ჰეტეროგენული ტიპია, რომელიც ჩვეულებრივ ატაქსიის სახით ვლინდება და ხშირად აზიანებს პერიფერიულ ნეირონებს (46). ნეირონების ეს პოპულაცია განსაკუთრებით მგრძნობიარეა მიტოქონდრიული დისფუნქციის მიმართ, რადგან მათი შერჩევითი დეგენერაცია თაგვებში საკმარისია ადამიანის სპინოცერებელარული ატაქსიისთვის დამახასიათებელი მრავალი მოტორული სიმპტომის რეპროდუცირებისთვის (16, 47, 48). ცნობების თანახმად, მუტანტური გენის მქონე ტრანსგენური თაგვის მოდელი ასოცირდება ადამიანის სპინოცერებელურ ატაქსიასთან და აქვს მიტოქონდრიული დისფუნქცია (49, 50), რაც ხაზს უსვამს პერიფერიულ ნეირონ ... მიუხედავად იმისა, რომ სხვა ტიპის უჯრედების (განსაკუთრებით ზრდასრული ქსოვილების) დაბინძურების აბსოლუტური არარსებობის მიღწევა თითქმის შეუძლებელია, ჩვენ ეფექტური დისოციაციის ეტაპი გავაერთიანეთ FACS-თან, რათა მიგვეღო საკმარისი რაოდენობის სიცოცხლისუნარიანი ნეირონები შემდგომი პროტეომიკის ანალიზისთვის და გვქონდა საკმაოდ მაღალი ცილოვანი დაფარვა (დაახლოებით 3000 ცილა) მთელი ნათხემის არსებულ მონაცემთა ნაკრებთან შედარებით (51). მთლიანი უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობის შენარჩუნებით, აქ წარმოდგენილი მეთოდი საშუალებას გვაძლევს არა მხოლოდ შევამოწმოთ მიტოქონდრიებში მეტაბოლური გზების ცვლილებები, არამედ შევამოწმოთ მისი ციტოპლაზმური ანალოგების ცვლილებები, რაც ავსებს მიტოქონდრიული მემბრანის ტეგების გამოყენებას უჯრედის ტიპის გასამდიდრებლად რთულ ქსოვილებში მიტოქონდრიების რაოდენობის ახალი მეთოდით (52, 53). ჩვენს მიერ აღწერილი მეთოდი არა მხოლოდ პურკინიეს უჯრედების შესწავლას უკავშირდება, არამედ მისი მარტივად გამოყენება შესაძლებელია ნებისმიერი ტიპის უჯრედზე დაავადებულ ტვინში მეტაბოლური ცვლილებების მოსაგვარებლად, მათ შორის მიტოქონდრიული დისფუნქციის სხვა მოდელების ჩათვლით.
და ბოლოს, ამ მეტაბოლური გადალაგების პროცესში ჩვენ გამოვავლინეთ თერაპიული ფანჯარა, რომელსაც შეუძლია სრულად შეცვალოს უჯრედული სტრესის ძირითადი ნიშნები და თავიდან აიცილოს ნეირონების დეგენერაცია. ამიტომ, აქ აღწერილი გადაკავშირების ფუნქციური შედეგების გაგებამ შეიძლება ფუნდამენტური წარმოდგენა შეგვიქმნას მიტოქონდრიული დისფუნქციის დროს ნეირონების სიცოცხლისუნარიანობის შენარჩუნების შესაძლო მკურნალობის მეთოდებზე. საჭიროა სამომავლო კვლევები, რომლებიც მიზნად ისახავს ენერგიის მეტაბოლიზმის ცვლილებების ანალიზს სხვა ტიპის ტვინის უჯრედებში, რათა სრულად გამოვლინდეს ამ პრინციპის სხვა ნევროლოგიური დაავადებების მიმართ გამოყენებადობა.
MitoPark თაგვები ადრეც იყო აღწერილი (31). C57BL/6N თაგვები loxP-ის გვერდითი Mfn2 გენებით ადრეც იყო აღწერილი (18) და შეჯვარებული L7-Cre თაგვებთან (23). შედეგად მიღებული ორმაგი ჰეტეროზიგოტური შთამომავლობა შემდეგ შეჯვარდა ჰომოზიგოტურ Mfn2loxP/Mfn2loxP თაგვებთან, რათა წარმოქმნილიყო Mfn2-ისთვის პურკინიეს სპეციფიკური გენის ნოკაუტები (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). შეჯვარების ქვეჯგუფში, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP ალელი (stop-mtYFP) შეყვანილი იქნა დამატებითი შეჯვარებების გზით (20). ცხოველებზე ჩატარებული ყველა პროცედურა ჩატარდა ევროპული, ეროვნული და ინსტიტუციური სახელმძღვანელო პრინციპების შესაბამისად და დამტკიცებული იყო გერმანიის ჩრდილოეთ რაინ-ვესტფალიის ოლქის ბუნებისა და ურმის ტერიტორიის მიერ. ცხოველებზე ჩატარებული კვლევები ასევე მიჰყვება ევროპის ლაბორატორიული ცხოველების მეცნიერებათა ასოციაციების ფედერაციის მითითებებს.
ორსული ქალის საშვილოსნოს ყელის ამოვარდნილობის ანესთეზირების შემდეგ, თაგვის ემბრიონი იზოლირებულია (E13). ქერქი დაშლილი იქნა ჰენკსის დაბალანსებულ მარილიან ხსნარში (HBSS), რომელიც შეიცავდა 10 mM Hepes-ს და გადატანილი იქნა Dulbecco-ს მოდიფიცირებულ Eagle's გარემოში, რომელიც შეიცავდა პაპაინს (20 U/მლ) და ცისტეინს (1μg/მლ). ქსოვილი ინკუბირებულია DMEM-ში და დისოცირებულია ფერმენტული დაშლით (Ml) 37°C ტემპერატურაზე 20 წუთის განმავლობაში, შემდეგ კი მექანიკურად დაფქულია DMEM-ში, რომელიც შეიცავდა 10% ნაყოფის ძროხის შრატს. უჯრედები დათესეს პოლილიზინით დაფარულ შუშის საფარებზე 2×106 სიმკვრივით 6 სმ კულტურის ჭურჭელზე ან 0.5×105 უჯრედი/სმ2 სიმკვრივით ვიზუალიზაციის ანალიზისთვის. 4 საათის შემდეგ, გარემო შეიცვალა Neurobasal-ის შრატისგან თავისუფალი გარემოთი, რომელიც შეიცავდა 1% B27 დანამატს და 0.5 mM GlutaMax-ს. შემდეგ ნეირონები მთელი ექსპერიმენტის განმავლობაში ინახებოდა 37°C ტემპერატურაზე და 5%-იან CO2-ზე და იკვებებოდა კვირაში ერთხელ. რეკომბინაციის ინ ვიტრო ინ ვიტრო რეკომბინაციის გამოსაწვევად, ნეირონების დასამუშავებლად მეორე დღეს ინ ვიტრო გამოყენებული იქნა შემდეგი AAV9 ვირუსის ვექტორის 3μl (24-ჭეჭიანი კულტივაციის ჭურჭელი) ან 0.5μl (24-ჭეჭიანი ფირფიტა): AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, კატალოგის ნომერი 105530-AAV9) და AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, კატალოგის ნომერი 105545-AAV9).
თაგვის Mfn1 და Mfn2 კომპლემენტარული დნმ (მიღებული Addgene პლაზმიდიდან #23212 და #23213, შესაბამისად) მონიშნულია V5 თანმიმდევრობით (GKPIPNPLLGLDST) C-ბოლოში და შერწყმულია mCherry-სთან ჩარჩოში T2A თანმიმდევრობის მეშვეობით. Grx1-roGFP2 არის საჩუქარი Heidelberg TP Dick DFKZ-ისგან (Deutsches Krebsforschungszentrum). tdTomato კასეტის ჩვეულებრივი კლონირების მეთოდების გამოყენებით ჩანაცვლებით, კასეტა სუბკლონირებული იქნა pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ჩონჩხში (Addgene საცნობარო ნომერი 28306), რათა წარმოიქმნას pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 და pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ვექტორები. მსგავსი სტრატეგია გამოყენებული იქნა საკონტროლო ვექტორის pAAV-CAG-FLEX-mCherry გენერირებისთვის. AAV-shPCx კონსტრუქტის გენერირებისთვის საჭიროა პლაზმიდური AAV ვექტორი (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), რომელიც შეიცავს თაგვის PCx-ის სამიზნე shRNA-ს კოდირების დნმ-ის თანმიმდევრობას (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). U6 პრომოტორის კონტროლის ქვეშ, mCherry გამოიყენება CMV პრომოტორის კონტროლის ქვეშ. დამხმარე AAV ვექტორების წარმოება განხორციელდა მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად (Cell Biolabs). მოკლედ, გამოიყენეთ mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) შემცველი ტრანსფერული პლაზმიდი. 293AAV უჯრედების - T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ან Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) კოდირების გენის, ასევე AAV1 კაფსიდური ცილის და დამატებითი ცილის შეფუთვის პლაზმიდური პლაზმიდის კოდირების გენ, კალციუმის ფოსფატის მეთოდის გამოყენებით, ტრანსფექცია. ვირუსის ნედლი სუპერნატანტი მიღებული იქნა გაყინვა-დათბობის ციკლებით მშრალი ყინულის/ეთანოლის აბაზანაში და უჯრედების ლიზირება მოხდა ფოსფატ-ბუფერულ ფიზიოლოგიურ ხსნარში (PBS). AAV ვექტორი გაიწმინდა წყვეტილი იოდიქსანოლის გრადიენტის ულტრაცენტრიფუგირებით (24 საათი 32,000 ბრ/წთ-ზე და 4°C ტემპერატურაზე) და კონცენტრირებული იქნა Amicon ultra-15 ცენტრიდანული ფილტრის გამოყენებით. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 გენომის ასლი (GC)/მლ], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/მლ), AAV1-CAG-FLEX გენომის ტიტრი განხორციელდა ადრე აღწერილი მეთოდით (54), გაზომილი რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/მლ) და AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/მლ) მეთოდით.
პირველადი ნეირონები გაფხეკილი იქნა ყინულივით ცივ 1x PBS-ში, დაპრესილი იქნა და შემდეგ ჰომოგენიზირებული იქნა 0.5%-იან Triton X-100 / 0.5% ნატრიუმის დეოქსიქოლატის/PBS ლიზისის ბუფერში, რომელიც შეიცავდა ფოსფატაზას და პროტეაზას ინჰიბიტორს (Roche). ცილის რაოდენობრივი განსაზღვრა ჩატარდა ბიცინქონინის მჟავის ანალიზის გამოყენებით (Thermo Fisher Scientific). შემდეგ ცილები გამოიყო SDS-პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზით და შემდეგ გადაიტანეს პოლივინილიდენის ფტორიდის მემბრანაზე (GE Healthcare). დაბლოკეთ არასპეციფიკური ადგილები და ინკუბაცია მოახდინეთ პირველად ანტისხეულთან (დეტალებისთვის იხილეთ ცხრილი S1) 5%-იან რძეში TBST-ში (Tris-ბუფერული მარილიანი ხსნარი Tween-ით), გარეცხვის ეტაპები და მეორადი ანტისხეული TBST ინკუბატში. ინკუბაცია მოახდინეთ პირველად ანტისხეულთან მთელი ღამით +4°C-ზე. გარეცხვის შემდეგ, მეორადი ანტისხეული წაუსვით ოთახის ტემპერატურაზე 2 საათის განმავლობაში. შემდგომში, იგივე ბლოტის ანტი-β-აქტინის ანტისხეულთან ინკუბაციით, დადასტურდა იგივე დატვირთვა. აღმოჩენა ქემილუმინესცენციაზე გადაყვანით და ქემილუმინესცენციის გაძლიერებით (GE Healthcare).
მინის საფარველებზე ადრე დათესილი ნეირონები ფიქსირებული იქნა 4%-იანი პარაფორმალდეჰიდით (PFA)/PBS-ით მითითებულ დროს, ოთახის ტემპერატურაზე 10 წუთის განმავლობაში. საფარველები თავდაპირველად გაჟღენთილია 0.1%-იანი Triton X-100/PBS-ით 5 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე, შემდეგ კი ბლოკირების ბუფერში [3% მსხვილფეხა რქოსანი პირუტყვის შრატის ალბუმინი (BSA)/PBS]. მეორე დღეს, საფარველი გაირეცხა ბლოკირების ბუფერით და ინკუბირებული იქნა შესაბამის ფლუოროფორთან კონიუგირებული მეორადი ანტისხეულით 2 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე; და ბოლოს, ნიმუშები საფუძვლიანად გაირეცხა PBS-ში 4′,6-დიამიდინო-2-ფენილინდოლით (DAPI), რომელიც შეღებილი იყო და შემდეგ დაფიქსირებული იქნა მიკროსკოპის სლაიდზე Aqua-Poly/Mount-ით.
თაგვებს (მამრებს და მდედრებს) ანესთეზია ჩაუტარდათ კეტამინის (130 მგ/კგ) და ქსილაზინის (10 მგ/კგ) ინტრაპერიტონეალური ინექციით და კანქვეშ შეუყვანეს კარპროფენის ანალგეტიკი (5 მგ/კგ). შემდეგ მოათავსეს სტერეოტაქსიურ ინსტრუმენტში (Kopf), რომელიც აღჭურვილია თბილი საფენით. გამოაშკარავეს თავის ქალა და სტომატოლოგიური ბურღით გაათხელეს ნათხემის ქერქის ის ნაწილი, რომელიც შეესაბამება მის ძვალს (ლამბდადან: კუდი 1.8, გვერდითი 1, რომელიც შეესაბამება IV და V ლობულებს). მოხრილი შპრიცის ნემსის გამოყენებით ფრთხილად გააკეთეთ პატარა ხვრელი თავის ქალაში, რათა თავიდან აიცილოთ ქვემოთ მდებარე სისხლძარღვოვანი სისტემის დარღვევა. შემდეგ თხელი დახაზული შუშის კაპილარი ნელა შეჰყავთ მიკროხვრელში (-1.3-დან -1-მდე მაგარი გარსის ვენტრალურ მხარეს) და 200-დან 300 ნლ AAV შეჰყავთ მიკროინექტორში (Narishige) ხელით შპრიცებით (Narishige) რამდენჯერმე დაბალი წნევით 10-დან 20 წუთის ინტერვალით. ინფუზიის შემდეგ, კაპილარი კიდევ 10 წუთით მოათავსეთ, რათა ვირუსი სრულად გავრცელდეს. კაპილარების ამოღების შემდეგ, კანი ფრთხილად იკერება ჭრილობის ანთების მინიმიზაციისა და ცხოველის გამოჯანმრთელების მიზნით. ოპერაციიდან რამდენიმე დღის განმავლობაში ცხოველებს ტკივილგამაყუჩებლებით (კასპოფენი) მკურნალობდნენ, რომლის დროსაც მათი ფიზიკური მდგომარეობა ყურადღებით კონტროლდებოდა და შემდეგ მითითებულ დროს ევთანაზია ჩაუტარდათ. ყველა პროცედურა ჩატარდა ევროპული, ეროვნული და ინსტიტუციური სახელმძღვანელო პრინციპების შესაბამისად და დამტკიცებული იყო გერმანიის ჩრდილოეთ რაინ-ვესტფალიის ბუნებისა და კულტურული მემკვიდრეობის ფედერალური სააგენტოს (LandesamtfürNatur) მიერ.
ცხოველებს ანესთეზია ჩაუტარდათ კეტამინით (100 მგ/კგ) და ქსილაზინით (10 მგ/კგ), გულში კი ჯერ 0.1 M PBS-ით, შემდეგ კი 4%-იანი PFA-თი PBS-ში. ქსოვილი დისექციას და ფიქსირებას ჩაუტარდა 4%-იან PFA/PBS-ში მთელი ღამით 4°C ტემპერატურაზე. PBS-ში ფიქსირებული ტვინიდან საგიტალური კვეთების (50 მკმ სისქის) მოსამზადებლად გამოყენებული იქნა ვიბრაციული დანა (Leica Microsystems GmbH, ვენა, ავსტრია). თუ სხვა რამ არ არის მითითებული, თავისუფლად მცურავი კვეთების შეღებვა ჩატარდა ზემოთ აღწერილი მეთოდით (13) ოთახის ტემპერატურაზე და მორევა. მოკლედ, პირველ რიგში, მიღებული ნაჭრები გამტარიანობის 0.5%-იანი Triton X-100/PBS-ით 15 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე; ზოგიერთი ეპიტოპისთვის (Pcx და Shmt2), tris-EDTA ბუფერში 80°C-ზე (PH 9) გაცხელების შემდეგ, ნაჭრები ამ ეტაპის ნაცვლად 25 წუთის განმავლობაში გააცხელეთ. შემდეგ, სექციები ინკუბირებული იქნა პირველად ანტისხეულთან (იხ. ცხრილი S1) ბლოკირების ბუფერში (3% BSA/PBS) 4°C ტემპერატურაზე მთელი ღამის განმავლობაში მორევის ქვეშ. მეორე დღეს, სექციები გაირეცხა ბლოკირების ბუფერით და ინკუბირებული იქნა შესაბამის ფლუოროფორთან კონიუგირებულ მეორად ანტისხეულთან 2 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე; და ბოლოს, სექციები საფუძვლიანად გაირეცხა PBS-ში, შეღებილი იქნა DAPI-ით და შემდეგ დაფიქსირებული იქნა AquaPolymount-ით მიკროსკოპის სლაიდზე.
ნიმუშის გამოსახულების მისაღებად გამოყენებული იქნა ლაზერული სკანირების კონფოკალური მიკროსკოპი (TCS SP8-X ან TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), რომელიც აღჭურვილი იყო თეთრი სინათლის ლაზერით და 405 დიოდური ულტრაიისფერი ლაზერით. ფლუოროფორის აგზნებით და სიგნალის ჰიბრიდული დეტექტორით (HyDs) შეგროვებით, LAS-X პროგრამული უზრუნველყოფა გამოყენებული იქნა ნაიკვისტის შერჩევის შესაბამისად დაწყობილი სურათების შესაგროვებლად თანმიმდევრულ რეჟიმში: არარაოდენობრივი პანელებისთვის, ეს არის მაღალდინამიური სიგნალები (მაგალითად, სომატურ უჯრედებსა და დენდრიტებში) mtYFP (HyD გამოიყენება PN-ების რაოდენობის დასადგენად BrightR რეჟიმში). ფონის შესამცირებლად გამოიყენება 0.3-დან 6 ns-მდე გეითინგი.
დახარისხებული უჯრედების რეალურ დროში ვიზუალიზაცია. Neurobasal-A გარემოში, რომელიც შეიცავდა 1% B27 დანამატს და 0.5 mM GlutaMax-ს, დახარისხების შემდეგ, უჯრედები დაუყოვნებლივ დაითესა პოლი-l-ლიზინით დაფარულ მინის სლაიდებზე (μ-Slide8 Well, იქვე, კატალოგის ნომერი 80826), შემდეგ კი 1 საათის განმავლობაში შეინახეს 37°C ტემპერატურაზე და 5% CO2-ზე, რათა უჯრედები დალექილიყო. რეალურ დროში ვიზუალიზაცია ჩატარდა Leica SP8 ლაზერული სკანირების კონფოკალურ მიკროსკოპზე, რომელიც აღჭურვილი იყო თეთრი ლაზერით, HyD-ით, 63×[1.4 რიცხვითი აპერტურით (NA)] ზეთის ობიექტივით და გამათბობელი ეტაპით.
თაგვს სწრაფად ჩაუტარდა ანესთეზია ნახშირორჟანგით და თავი მოკვეთეს, ტვინი სწრაფად ამოიღეს თავის ქალიდან და დაჭრეს 200 მკმ სისქის (13C მარკირების ექსპერიმენტისთვის) ან 275 მკმ სისქის (ორი ფოტონის ექსპერიმენტისთვის) საგიტალურ მონაკვეთად, რომელიც შევსებულია შემდეგი მასალებით: ნაყინი (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, გერმანია) შევსებულია შემდეგი ნივთიერებებით: 125 მმ ყინულივით ცივი, ნახშირბადით გაჯერებული (95% O2 და 5% CO2) დაბალი Ca2 + ხელოვნური ცერებროსპინალური სითხე (ACSF) NaCl, 2.5 მმ KCl, 1.25 მმ ნატრიუმის ფოსფატის ბუფერი, 25 მმ NaHCO3, 25 მმ გლუკოზა, 0.5 მმ CaCl2 და 3.5 მმ MgCl2 (ოსმოსური წნევა 310-დან 330 მმოლამდე). მიღებული ტვინის ნაჭრები გადაიტანეთ წინასწარ ინკუბაციურ კამერაში, რომელიც შეიცავს უფრო მაღალი Ca2 + ACSF შემცველობას (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ნატრიუმის ფოსფატის ბუფერი, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-გლუკოზა, 1.0 mM CaCl2 და 2.0 mM MgCl2) გარემოში (pH 7.4 და 310-დან 320 მმოლამდე).
ვიზუალიზაციის პროცესის დროს, ნაჭრები გადაიტანეს სპეციალურად გამოყოფილ ვიზუალიზაციის ოთახში და ექსპერიმენტი ჩატარდა უწყვეტი ACSF პერფუზიის ქვეშ, 32°-დან 33°C-მდე მუდმივ ტემპერატურაზე. ნაჭრების ვიზუალიზაციისთვის გამოყენებული იქნა მულტიფოტონური ლაზერული სკანირების მიკროსკოპი (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), რომელიც აღჭურვილი იყო Leica 25x ობიექტივით (NA 0.95, წყალი), Ti: Sapphire ლაზერით (Chameleon Vision II, Coherent). FLIM მოდული (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2-ის FLIM. PN-ების ციტოპლაზმური რედოქს მდგომარეობის ცვლილებები გაიზომა ორფოტონიანი FLIM-ით საგიტალურ ტვინის ნაჭრებში, სადაც Grx1-roGFP2 ბიოსენსორი PN-ებს უმიზნებდა. PN ფენაში, შეგროვების ველი შერჩეულია ნაჭრის ზედაპირიდან დაახლოებით 50-დან 80 მკმ-მდე, რათა უზრუნველყოფილი იყოს სიცოცხლისუნარიანი PN (ანუ დენდრიტების გასწვრივ მძივებიანი სტრუქტურის ან ნეირონული მორფოლოგიური ცვლილებების არარსებობა) და ორმაგი დადებითი roGFP2 სენსორი და AAV, რომელიც აკოდირებს shRNA PCx-ს ან მის საკონტროლო თანმიმდევრობას (თითოეული თანაგამოხატავს mCherry-ს). ერთჯერადი სურათების შეგროვება 2x ციფრული ზუმით [აგზნების ტალღის სიგრძე: 890 ნმ; 512 ნმ 512 პიქსელი]. აღმოჩენა: შიდა HyD, ფლუორესცეინის იზოთიოციანატის (FITC) ფილტრის ჯგუფი] და გამოსახულების საშუალოდ გამოთვლა 2-3 წუთის განმავლობაში გამოიყენება იმის უზრუნველსაყოფად, რომ საკმარისი ფოტონები შეგროვდეს (სულ 1000 ფოტონი) მრუდის მორგებისთვის. Grx1-roGFP2 ზონდის მგრძნობელობა და FLIM პირობების ვერიფიკაცია განხორციელდა roGFP2-ის სიცოცხლის ხანგრძლივობის მონიტორინგით, როდესაც პერფუზიულ ACSF-ში დაემატა ეგზოგენური 10 mM H2O2 (დაჟანგვის მაქსიმიზაციისთვის, რაც იწვევს სიცოცხლის ხანგრძლივობის გაზრდას) და შემდეგ დაემატა 2 mM დითიოთრეიტოლი (შემცირებულია შემცირების ხარისხი, რაც იწვევს სიცოცხლის ხანგრძლივობის შემცირებას) (სურათი S8, D-დან G-მდე). მიღებული შედეგების გასაანალიზებლად გამოიყენეთ FLIMfit 5.1.1 პროგრამული უზრუნველყოფა, მოარგეთ მთელი გამოსახულების ერთიანი ექსპონენციალური დაშლის მრუდი გაზომილ IRF-ს (ინსტრუმენტის რეაქციის ფუნქცია) და χ2 დაახლოებით 1-ის ტოლია. ერთი PN-ის სიცოცხლის ხანგრძლივობის გამოსათვლელად, ნერვული სხეულის გარშემო ნიღაბი ხელით იქნა დახატული და თითოეულ ნიღაბში საშუალო სიცოცხლის ხანგრძლივობა გამოყენებული იქნა რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის.
მიტოქონდრიული პოტენციალის ანალიზი. მას შემდეგ, რაც მწვავე კვეთა 30 წუთის განმავლობაში ინკუბირებული იქნა პერფუზირებულ ACSF-ში პირდაპირ დამატებული 100 ნმ TMRM-ით, პერიფერიული მიტოქონდრიული პოტენციალის ცვლილებები გაიზომა ორფოტონიანი მიკროსკოპით. TMRM ვიზუალიზაცია ჩატარდა ზონდის 920 ნმ-ზე აგზნებით და სიგნალების შესაგროვებლად შიდა HyD-ის (ტეტრამეთილროდამინის იზოთიოციანატი: 585/40 ნმ) გამოყენებით; mtYFP-ის გამოსახულების მისაღებად იგივე აგზნების ტალღის სიგრძის გამოყენებით, მაგრამ განსხვავებული შიდა HyD-ის (FITC: 525/50) გამოყენებით. მიტოქონდრიული პოტენციალის შესაფასებლად გამოიყენეთ ImageJ-ის Image Calculator დანამატი ერთუჯრედიან დონეზე. მოკლედ, დანამატის განტოლება: სიგნალი = წთ (mtYFP, TMRM) გამოიყენება მიტოქონდრიული რეგიონის იდენტიფიცირებისთვის, რომელიც აჩვენებს TMRM სიგნალს პურკინიეს სომალში შესაბამისი არხის ერთსტეიკ კონფოკალურ გამოსახულებაში. შემდეგ მიღებულ ნიღაბში პიქსელის ფართობი რაოდენობრივად განისაზღვრება და ნორმალიზდება mtYFP არხის შესაბამის ზღურბლურ ერთსტეიკიან გამოსახულებაზე, რათა მივიღოთ მიტოქონდრიული პოტენციალის ამსახველი მიტოქონდრიული ფრაქცია.
სურათის დეკონვოლუცია განხორციელდა Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით. ფილების სკანირებული სურათებისთვის, ერთი ფილის მონტაჟი ხორციელდება LAS-X პროგრამული უზრუნველყოფის მიერ მოწოდებული ავტომატური შეერთების ალგორითმის გამოყენებით. სურათის კალიბრაციის შემდეგ, გამოსახულების შემდგომი დამუშავებისა და სიკაშკაშისა და კონტრასტის თანაბრად რეგულირებისთვის გამოიყენეთ ImageJ და Adobe Photoshop. გრაფიკული მომზადებისთვის გამოიყენეთ Adobe Illustrator.
mtDNA ფოკუსის ანალიზი. mtDNA დაზიანებების რაოდენობა განისაზღვრა კონფოკალური მიკროსკოპით დნმ-ის საწინააღმდეგო ანტისხეულებით მონიშნულ ნათხემის მონაკვეთებზე. თითოეული სამიზნე არე შეიქმნა თითოეული უჯრედის სხეულისა და ბირთვისთვის და შესაბამისი ფართობი გამოითვალა Multi Measure დანამატის (ImageJ პროგრამული უზრუნველყოფა) გამოყენებით. ციტოპლაზმური ფართობის მისაღებად უჯრედის სხეულის ფართობიდან გამოაკელით ბირთვის ფართობი. დაბოლოს, Analyze Particles დანამატი (ImageJ პროგრამული უზრუნველყოფა) გამოყენებული იქნა ზღურბლურ გამოსახულებაზე mtDNA-ზე მითითებული ციტოპლაზმური დნმ წერტილების ავტომატურად რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის და მიღებული შედეგები ნორმალიზებული იქნა CTRL თაგვების PN საშუალო მაჩვენებელთან. შედეგები გამოხატულია უჯრედზე ნუკლეოზიდების საშუალო რაოდენობით.
ცილის ექსპრესიის ანალიზი. გამოიყენეთ ImageJ-ის Image Calculator დანამატი PN-ში ცილის ექსპრესიის შესაფასებლად ერთუჯრედიან დონეზე. მოკლედ, შესაბამისი არხის ერთშრიან კონფოკალურ გამოსახულებაში, განტოლების მეშვეობით: სიგნალი = წთ (mtYFP, ანტისხეული), იდენტიფიცირებულია მიტოქონდრიული რეგიონი, რომელიც ავლენს იმუნორეაქტიულობას პურკინაში მოცემული გარკვეული ანტისხეულის მიმართ. შემდეგ ხდება მიღებულ ნიღაბში პიქსელის ფართობის რაოდენობრივი განსაზღვრა და შემდეგ ნორმალიზება mtYFP არხის შესაბამის ზღურბლიან ერთსტეპის გამოსახულებაზე, რათა მივიღოთ ნაჩვენები ცილის მიტოქონდრიული ფრაქცია.
პურკინიეს უჯრედების სიმკვრივის ანალიზი. ImageJ-ის Cell Counter დანამატი გამოყენებული იქნა პურკინიეს სიმკვრივის შესაფასებლად, დათვლილი პურკინიეს უჯრედების რაოდენობის დათვლილი უჯრედების მიერ დაკავებული ნათხემიური რგოლის სიგრძეზე გაყოფით.
ნიმუშის მომზადება და შეგროვება. საკონტროლო ჯგუფის და Mfn2cKO თაგვების ტვინი ფიქსირდებოდა 2%-იან PFA/2.5%-იან გლუტარალდეჰიდში 0.1 M ფოსფატურ ბუფერში (PB), შემდეგ კი კორონალური კვეთები მომზადდა წამწამების გამოყენებით (Leica Mikrosysteme GmbH, ვენა, ავსტრია) (სისქე 50-დან 60 მკმ-მდე). შემდეგ ფიქსირდებოდა PB ბუფერში 1%-იან ოსტეო ტეტრაოქსიდსა და 1.5%-იან კალიუმის ფეროციანიდში ოთახის ტემპერატურაზე 1 საათის განმავლობაში. კვეთები სამჯერ გაირეცხა გამოხდილი წყლით, შემდეგ კი შეღებილი იქნა 70%-იანი ეთანოლით, რომელიც შეიცავდა 1%-იან ურანილის აცეტატს 20 წუთის განმავლობაში. შემდეგ კვეთები გაუწყლოდათ კლასიფიცირებულ სპირტში და ჩაასხეს Durcupan ACM (Araldite casting resin M) ეპოქსიდური ფისში (Electron Microscopy Sciences, კატალოგის ნომერი 14040) სილიციუმით დაფარულ მინის სლაიდებს შორის და ბოლოს 60°C ტემპერატურაზე პოლიმერიზდებოდა ღუმელში 48 საათის განმავლობაში. ნათხემის ქერქის არე შეირჩა და 50 ნმ სისქის ულტრათხელი მონაკვეთები Leica Ultracut-ზე (Leica Mikrosysteme GmbH, ვენა, ავსტრია) ამოიჭრა და პოლისტიროლის აპკით დაფარულ 2×1 მმ სპილენძის ჭრილის ბადეზე აიკრიფა. მონაკვეთები 10 წუთის განმავლობაში შეიღება 4%-იანი ურანილის აცეტატის ხსნარით H2O-ში, რამდენჯერმე გაირეცხა H2O-ით, შემდეგ 10 წუთის განმავლობაში რეინოლდსის ტყვიის ციტრატით H2O-ში და შემდეგ რამდენჯერმე გაირეცხა H2O-თი. მიკროფოტოები გადაღებულია Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, უოლტჰემი, მასაჩუსეტსი, აშშ) გამტარი ელექტრონული მიკროსკოპით, TVIPS (Tietz ვიდეო და გამოსახულების დამუშავების სისტემა) TemCam-F416 ციფრული კამერის (TVIPS GmbH, გაუტინგი, აშშ) გამოყენებით. გერმანია).
AAV-ით ინფიცირებული თაგვების ტვინი გამოეყო და 1 მმ სისქის საგიტალურ კვეთად და ნათხემი ფლუორესცენტული მიკროსკოპით იქნა გამოკვლეული AAV-ინფიცირებული რგოლის (ანუ mCherry-ის ექსპრესიის) იდენტიფიცირებისთვის. გამოყენებულია მხოლოდ ის ექსპერიმენტები, რომლებშიც AAV ინექცია იწვევს პურკინიეს უჯრედული შრის (ანუ თითქმის მთელი შრის) ძალიან მაღალ ტრანსდუქციურ ეფექტურობას სულ მცირე ორ ზედიზედ ნათხემის რგოლში. AAV-ტრანსდუცირებული მარყუჟი მიკროდისექციას ჩაუტარდა ღამის შემდგომი ფიქსაციისთვის (4% PFA და 2.5% გლუტარალდეჰიდი 0.1 M კოკოატის ბუფერში) და შემდგომ დამუშავდა. EPON-ის ჩასმისთვის, ფიქსირებული ქსოვილი გაირეცხა 0.1 M ნატრიუმის კოკოატის ბუფერით (Applichem) და ინკუბირებული იქნა 2% OsO4-ით (os, Science Services; Caco) 0.1 M ნატრიუმის კოკოატის ბუფერში (Applichem) 4 საათის განმავლობაში, შემდეგ გაირეცხა 2 საათის განმავლობაში. გაიმეორეთ 3-ჯერ 0.1 M კოკამიდის ბუფერით. შემდგომში, ეთანოლის აღმავალი სერია გამოყენებული იქნა თითოეული ეთანოლის ხსნარის 4°C ტემპერატურაზე 15 წუთის განმავლობაში ინკუბაციისთვის ქსოვილის გასაშრობად. ქსოვილი გადატანილი იქნა პროპილენოქსიდში და ინკუბირებული იქნა მთელი ღამით EPON-ში (Sigma-Aldrich) 4°C ტემპერატურაზე. ქსოვილი მოათავსეთ ახალ EPON-ში ოთახის ტემპერატურაზე 2 საათის განმავლობაში, შემდეგ კი ჩადეთ 62°C ტემპერატურაზე 72 საათის განმავლობაში. ულტრამიკროტომის (Leica Microsystems, UC6) და ალმასის დანის (Diatome, Biel, შვეიცარია) გამოყენებით 70 ნმ ულტრათხელი მონაკვეთების დასაჭრელად და შეღებეთ 1.5%-იანი ურანილის აცეტატით 15 წუთის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე და შეღებეთ ტყვიის ციტრატის ხსნარით 4 წუთის განმავლობაში. ელექტრონული მიკროგრაფიები გადაღებულია JEM-2100 Plus გამტარი ელექტრონული მიკროსკოპის (JEOL) გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილია Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) და DigitalMicrograph პროგრამული უზრუნველყოფით (Gatan). ანალიზისთვის, ელექტრონული მიკროგრაფიები გადაღებულია 5000× ან 10,000× ციფრული ზუმით.
მიტოქონდრიების მორფოლოგიური ანალიზი. ყველა ანალიზისთვის, ცალკეული მიტოქონდრიების კონტურები ხელით გამოიკვეთა ციფრულ სურათებში ImageJ პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით. გაანალიზებულია სხვადასხვა მორფოლოგიური პარამეტრი. მიტოქონდრიული სიმკვრივე გამოისახება პროცენტულად, რომელიც მიიღება თითოეული უჯრედის მიტოქონდრიული ფართობის ციტოპლაზმის ფართობზე (ციტოპლაზმის ფართობი = უჯრედის ფართობი - უჯრედის ბირთვის ფართობი) × 100 გაყოფით. მიტოქონდრიების სიმრგვალე გამოითვლება ფორმულით [4π∙(ფართობი/პერიმეტრი 2)]. მიტოქონდრიების ამა თუ იმ მორფოლოგია გაანალიზდა და დაიყო ორ კატეგორიად („მილისებრი“ და „ბუშტუკი“) მათი ძირითადი ფორმების მიხედვით.
აუტოფაგოსომის/ლიზოსომის რაოდენობისა და სიმკვრივის ანალიზი. ImageJ პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით, ციფრულ გამოსახულებაში ხელით გამოკვეთეთ თითოეული აუტოფაგოსომის/ლიზოსომის კონტურები. აუტოფაგოსომის/ლიზოსომის ფართობი გამოისახება პროცენტულად, რომელიც გამოითვლება თითოეული უჯრედის აუტოფაგოსომის/ლიზოსომის სტრუქტურის მთლიანი ფართობის ციტოპლაზმის ფართობზე (ციტოპლაზმის ფართობი = უჯრედის ფართობი - ბირთვის ფართობი) × 100 გაყოფით. აუტოფაგოსომების/ლიზოსომების სიმკვრივე გამოითვლება საერთო რაოდენობის უჯრედში აუტოფაგოსომის/ლიზოსომის სტრუქტურების რაოდენობაზე გაყოფით (ციტოპლაზმური ფართობის მიხედვით) (ციტოპლაზმური ფართობი = უჯრედის ფართობი - ბირთვის ფართობი).
მწვავე ჭრილობის ეტიკეტირება და ნიმუშის მომზადება. ექსპერიმენტებისთვის, რომლებიც გლუკოზის ეტიკეტირებას საჭიროებენ, მწვავე ტვინის ნაჭრები გადაიტანეთ წინასწარ ინკუბაციურ კამერაში, რომელიც შეიცავს ნაჯერ ნახშირბადს (95% O2 და 5% CO2), მაღალი Ca2 + ACSF შემცველობით (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ნატრიუმის ფოსფატის ბუფერი, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-გლუკოზა, 1.0 mM CaCl2 და 2.0 mM MgCl2, pH 7.4-მდე და 310-დან 320 mOsm-მდე მორგებული), რომელშიც გლუკოზა არის 13C6- გლუკოზის ჩანაცვლება (Eurisotop, კატალოგის ნომერი CLM-1396). ექსპერიმენტებისთვის, რომლებიც პირუვატით მარკირებას საჭიროებს, მწვავე ტვინის ნაჭრები გადაიტანეთ უფრო მაღალი Ca2 + ACSF შემცველობის მქონე ხსნარში (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ნატრიუმის ფოსფატის ბუფერი, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-გლუკოზა, 1.0 mM CaCl2 და დაამატეთ 2.0 mM MgCl2, დაარეგულირეთ pH 7.4-მდე და 310-დან 320 mOsm-მდე) და დაამატეთ 1 mM 1-[1-13C]პირუვატი (Eurisotop, კატალოგის ნომერი CLM-1082). ნაჭრები ინკუბირებულია 90 წუთის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე. ექსპერიმენტის დასასრულს, ნაჭრები სწრაფად გაირეცხა წყალხსნარით (pH 7.4), რომელიც შეიცავდა 75 mM ამონიუმის კარბონატს, შემდეგ კი ჰომოგენიზირებული იქნა 40:40:20 (v:v:v) აცეტონიტრილში (ACN): მეთანოლი: წყალი. მას შემდეგ, რაც სექციები ყინულზე 30 წუთის განმავლობაში ინკუბირებული იქნა, ნიმუშები ცენტრიფუგირდა 21,000 გ-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე და გამჭვირვალე ზედაპირული სითხე გაშრა SpeedVac კონცენტრატორში. შედეგად მიღებული გამხმარი მეტაბოლიტის ნალექი ანალიზამდე ინახებოდა -80°C ტემპერატურაზე.
13 C-ით მონიშნული ამინომჟავების თხევადი ქრომატოგრაფიულ-მას-სპექტრომეტრიული ანალიზი. თხევადი ქრომატოგრაფიულ-მას-სპექტრომეტრიული (LC-MS) ანალიზისთვის, მეტაბოლიტის ნალექი ხელახლა სუსპენდირებული იქნა 75 μl LC-MS კლასის წყალში (Honeywell). 4°C ტემპერატურაზე 21,000 გ-ზე 5 წუთის განმავლობაში ცენტრიფუგირების შემდეგ, ამინომჟავების ნაკადის ანალიზისთვის გამოყენებული იქნა გასუფთავებული ზედაპირული ნივთიერების 20 μl, ხოლო ექსტრაქტის დარჩენილი ნაწილი დაუყოვნებლივ გამოყენებული იქნა ანიონური ანალიზისთვის (იხილეთ ქვემოთ). ამინომჟავების ანალიზი ჩატარდა ადრე აღწერილი ბენზოილ ქლორიდის დერივატიზაციის პროტოკოლის გამოყენებით (55, 56). პირველ ეტაპზე, მეტაბოლიტის ექსტრაქტის 20 μl-ს დაემატა 10 μl 100 mM ნატრიუმის კარბონატი (Sigma-Aldrich), შემდეგ კი LC კლასის ACN-ს დაემატა 10 μl 2%-იანი ბენზოილ ქლორიდი (Sigma-Aldrich). ნიმუში ხანმოკლედ ურიეს და შემდეგ დაცენტრიფუგირდა 21,000 გ-ზე 5 წუთის განმავლობაში 20°C ტემპერატურაზე. გასუფთავებული ზედა ფენა გადაიტანეს 2 მლ ავტოსემპლერის ფლაკონში კონუსური მინის ჩანართით (მოცულობა 200 μl). ნიმუშები გაანალიზდა Acquity iClass ულტრამაღალი ეფექტურობის LC სისტემის (Waters) გამოყენებით, რომელიც დაკავშირებულია Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) მაღალი გარჩევადობის ზუსტი მას-სპექტრომეტრთან (Thermo Fisher Scientific). ანალიზისთვის, დერივატიზებული ნიმუშის 2 μl შეიყვანეს 100×1.0 მმ მაღალი სიმტკიცის სილიციუმის T3 სვეტში (Waters), რომელიც შეიცავდა 1.8 μm ნაწილაკებს. ნაკადის სიჩქარეა 100 μl/წთ, ხოლო ბუფერული სისტემა შედგება ბუფერ A-სგან (10 mM ამონიუმის ფორმატი და 0.15% ჭიანჭველმჟავა წყალში) და ბუფერ B-სგან (ACN). გრადიენტი შემდეგია: 0%B 0 წუთში; 0%B. 0-დან 15%-მდე B 0-დან 0.1 წუთამდე; 15-დან 17%-მდე B 0.1-დან 0.5 წუთამდე; B 17-დან 55%-მდე 0.5-დან 14 წუთამდე; B 55-დან 70%-მდე 14-დან 14.5 წუთამდე; 14.5-დან 70-მდე 100%-მდე B 18 წუთში; 100% B 18-დან 19 წუთამდე; 100-დან 0%-მდე B 19-დან 19.1 წუთამდე; 0% B 19.1-დან 28 წუთამდე (55, 56). QE-HF მას-სპექტრომეტრი მუშაობს დადებითი იონიზაციის რეჟიმში, მასის დიაპაზონით m/z (მასა/მუხტის თანაფარდობა) 50-დან 750-მდე. გამოყენებული გარჩევადობაა 60,000, მიღებული გაძლიერების კონტროლის (AGC) იონური სამიზნე არის 3×106, ხოლო მაქსიმალური იონური დროა 100 მილიწამი. გაცხელებული ელექტროშესხურების იონიზაციის (ESI) წყარო მუშაობს 3.5 კვ შესხურების ძაბვაზე, 250°C კაპილარულ ტემპერატურაზე, 60 AU (თვითნებური ერთეულები) გარსის ჰაერის ნაკადზე და 20 AU (თვითნებური ერთეულები) დამხმარე ჰაერის ნაკადზე. S ლინზა დაყენებულია 60 AU-ზე.
13C-ით მონიშნული ორგანული მჟავების ანიონური ქრომატოგრაფიულ-MS ანალიზი. დარჩენილი მეტაბოლიტის ნალექი (55μl) გაანალიზდა Dionex-ის იონური ქრომატოგრაფიის სისტემის (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) გამოყენებით, რომელიც დაკავშირებული იყო QE-HF მას-სპექტრომეტრთან (Thermo Fisher Scientific). მოკლედ, მეტაბოლიტის ექსტრაქტის 5μl შეიყვანეს Dionex IonPac AS11-HC სვეტში, რომელიც აღჭურვილი იყო HPLC-ით (2 მმ×250 მმ, ნაწილაკების ზომა 4μm, Thermo Fisher Scientific) შეყვანის ნაწილობრივი მარყუჟის რეჟიმში 1-ის შევსების კოეფიციენტით. Dionex IonPac AG11-HC დამცავი სვეტი (2 მმ x 50 მმ, 4μm, Thermo Fisher Scientific). სვეტის ტემპერატურა შენარჩუნებულია 30°C-ზე, ხოლო ავტოსემპლერი დაყენებულია 6°C-ზე. ელუენტის გენერატორის მეშვეობით კალიუმის ჰიდროქსიდის გრადიენტის გენერირებისთვის გამოიყენეთ დეიონიზებული წყლით აღჭურვილი კალიუმის ჰიდროქსიდის კარტრიჯი. მეტაბოლიტების გამოყოფა 380 μl/წთ ნაკადის სიჩქარით, შემდეგი გრადიენტის გამოყენებით: 0-დან 3 წუთამდე, 10 mM KOH; 3-დან 12 წუთამდე, 10-დან 50 mM KOH; 12-დან 19 წუთამდე, 50-დან 100 mM KOH; 19-დან 21 წუთამდე, 100 mM KOH; 21-დან 21.5 წუთამდე, 100-დან 10 mM KOH. სვეტი ხელახლა დაბალანსდა 10 mM KOH-ის ქვეშ 8.5 წუთის განმავლობაში.
ელუირებული მეტაბოლიტები სვეტის შემდეგ ერწყმის 150 μl/min იზოპროპანოლის დანამატის ნაკადს და შემდეგ იგზავნება მაღალი გარჩევადობის მას-სპექტრომეტრში, რომელიც მუშაობს უარყოფითი იონიზაციის რეჟიმში. MS აკონტროლებს მასის დიაპაზონს m/z 50-დან 750-მდე 60,000 გარჩევადობით. AGC დაყენებულია 1×106-ზე, ხოლო მაქსიმალური იონური დრო შენარჩუნებულია 100 ms-ზე. გაცხელებული ESI წყარო მუშაობდა 3.5 კვ შესხურების ძაბვაზე. იონური წყაროს სხვა პარამეტრებია: კაპილარული ტემპერატურა 275°C; გარსის გაზის ნაკადი, 60 AU; დამხმარე გაზის ნაკადი, 20 AU 300°C-ზე და S ლინზის დაყენება 60 AU-ზე.
13C-ით მონიშნული მეტაბოლიტების მონაცემთა ანალიზი. იზოტოპური თანაფარდობის მონაცემთა ანალიზისთვის გამოიყენეთ TraceFinder პროგრამული უზრუნველყოფა (ვერსია 4.2, Thermo Fisher Scientific). თითოეული ნაერთის იდენტურობა დადასტურდა საიმედო საცნობარო ნაერთით და დამოუკიდებლად გაანალიზდა. იზოტოპური გამდიდრების ანალიზის ჩასატარებლად, თითოეული 13C იზოტოპის (Mn) ექსტრაგირებული იონური ქრომატოგრამის (XIC) ფართობი ექსტრაგირებული იქნა [M + H]+-დან, სადაც n არის სამიზნე ნაერთის ნახშირბადის ნომერი, რომელიც გამოიყენება ამინომჟავების ანალიზისთვის ან [MH]+ გამოიყენება ანიონების ანალიზისთვის. XIC-ის მასის სიზუსტე მილიონზე ხუთ ნაწილად ნაკლებია, ხოლო RT-ის სიზუსტე 0.05 წუთია. გამდიდრების ანალიზი ტარდება თითოეული აღმოჩენილი იზოტოპის შესაბამისი ნაერთის ყველა იზოტოპის ჯამთან თანაფარდობის გამოთვლით. ეს თანაფარდობები მოცემულია თითოეული იზოტოპის პროცენტული მნიშვნელობების სახით, ხოლო შედეგები გამოიხატება გამდიდრების მოლური პროცენტით (MPE), როგორც ადრე იყო აღწერილი (42).
გაყინული ნეირონების ნალექი ჰომოგენიზებული იქნა ყინულივით ცივ 80%-იან მეთანოლში (v/v), მორევივით და ინკუბირებული იქნა -20°C ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში. ნიმუში კვლავ მორევივით და აურიეთ +4°C ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში. ნიმუში ცენტრიფუგირებული იქნა 21,000 გ-ზე 5 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე, შემდეგ მიღებული ზედა ფენა შეგროვდა და გაშრა SpeedVac კონცენტრატორის გამოყენებით 25°C ტემპერატურაზე შემდგომი ანალიზისთვის. როგორც ზემოთ იყო აღწერილი, LC-MS ანალიზი ჩატარდა დახარისხებული უჯრედების ამინომჟავებზე. TraceFinder-ის (ვერსია 4.2, Thermo Fisher Scientific) გამოყენებით, მონაცემთა ანალიზი ჩატარდა თითოეული ნაერთის მონოიზოტოპური მასის გამოყენებით. მეტაბოლიტების მონაცემების კვანტილური ნორმალიზაცია ჩატარდა preprocessCore პროგრამული პაკეტის (57) გამოყენებით.
ნაჭრის მომზადება. თაგვს სწრაფად ჩაუტარდა ანესთეზია ნახშირორჟანგით და თავი მოკვეთეს, ტვინი სწრაფად ამოიღეს თავის ქალადან და ყინულით სავსე ვიბრაციული დანით (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, გერმანია) მისი 300-დან 375 მკმ-მდე საგიტალურ ნაჭრებად დასაჭრელად გამოიყენეს. ცივი ნახშირბადის გაზიფიკაცია (95% O2 და 5% CO2). დაბალი Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ნატრიუმის ფოსფატის ბუფერი, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-გლუკოზა, 1.0 mM CaCl2 და 6.0 mM MgCl2. pH-ის 7.4 და 310-დან 330 mOsm-მდე რეგულირება). მიღებული ტვინის ნაჭრები გადაიტანეთ კამერაში, რომელიც შეიცავს უფრო მაღალი Ca2 + ACSF შემცველობას (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ნატრიუმის ფოსფატის ბუფერი, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-გლუკოზა, 4.0 mM CaCl2 და mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 და 310-დან 320 mOsm-მდე). შეინახეთ ნაჭრები 20-30 წუთის განმავლობაში, რათა მათი აღდგენა მოხდეს ჩაწერამდე.
ჩანაწერი. ყველა ჩანაწერისთვის გამოყენებული იქნა მიკროსკოპის სცენა, რომელიც აღჭურვილი იყო ფიქსირებული ჩამწერი კამერით და 20x წყალში ჩაძირვის ობიექტივით (Scientifica). სავარაუდო პურკინიეს უჯრედები იდენტიფიცირებული იქნა (i) სხეულის ზომით, (ii) ნათხემის ანატომიური მდებარეობით და (iii) ფლუორესცენტული mtYFP რეპორტიორის გენის ექსპრესიით. 5-დან 11 მეგოჰმამდე წვერის წინაღობის მქონე პაჩ-პიპეტი ამოღებულია ბოროსილიკატური მინის კაპილარით (GB150-10, 0.86 მმ × 1.5 მმ × 100 მმ, Science Products, Hofheim, გერმანია) და ჰორიზონტალური პიპეტით Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). ყველა ჩანაწერი შესრულდა ELC-03XS npi პაჩ-კლიპის გამაძლიერებლით (npi electronic GmbH, Tam, გერმანია), რომელიც კონტროლდებოდა პროგრამული უზრუნველყოფის Signal-ით (ვერსია 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, დიდი ბრიტანეთი). ექსპერიმენტი ჩაიწერა 12.5 kHz სემპლირების სიხშირით. სიგნალი იფილტრება ორი მოკლევადიანი ბესელის ფილტრით, რომელთა გამყოფი სიხშირეები შესაბამისად 1.3 და 10 კჰც-ია. მემბრანისა და პიპეტის ტევადობა კომპენსირდება გამაძლიერებლის გამოყენებით კომპენსაციის წრედით. ყველა ექსპერიმენტი ჩატარდა Orca-Flash 4.0 კამერის (Hamamatsu, Gerden, გერმანია) კონტროლის ქვეშ, რომელიც კონტროლდებოდა Hokawo პროგრამული უზრუნველყოფით (ვერსია 2.8, Hamamatsu, Gerden, გერმანია).
მთელი უჯრედის რუტინული კონფიგურაცია და ანალიზი. ჩაწერის წინ, პიპეტი შეავსეთ შემდეგი ნივთიერებების შემცველი შიდა ხსნარით: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM კალიუმის გლუკონატი, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM გუანოზინტრიფოსფატი (GTP) (Na) და 10.0 mM კრეატინინის ფოსფატი, pH 7.25-მდე დაარეგულირეს, ხოლო ოსმოსური წნევა 290 mOsm (საქაროზა) იყო. მემბრანის გახეთქვისთვის 0 pA ძალის გამოყენებისთანავე, გაიზომა მოსვენების მემბრანული პოტენციალი. შემავალი წინააღმდეგობა იზომება -40, -30, -20 და -10 pA ჰიპერპოლარიზებული დენების გამოყენებით. გაზომეთ ძაბვის რეაქციის სიდიდე და შემავალი წინააღმდეგობის გამოსათვლელად გამოიყენეთ ოჰმის კანონი. სპონტანური აქტივობა 5 წუთის განმავლობაში დაფიქსირდა ძაბვის დამჭერით და sPSC იდენტიფიცირებული და გაზომილი იქნა Igor Pro-ში (ვერსია 32 7.01, WaveMetrics, ოსვეგოს ტბა, ორეგონი, აშშ) ნახევრად ავტომატური ამოცნობის სკრიპტის გამოყენებით. IV მრუდი და სტაციონარული დენი იზომება აკუმულატორის სხვადასხვა პოტენციალზე (დაწყებული -110 mV-დან) და ძაბვის 5 mV საფეხურით გაზრდით. AP-ის წარმოება შემოწმდა დეპოლარიზაციის დენის გამოყენებით. უჯრედი დაამაგრეთ -70 mV-ზე დეპოლარიზაციის დენის იმპულსის გამოყენებისას. თითოეული ჩამწერი ერთეულის საფეხურის ზომა ცალ-ცალკე დაარეგულირეთ (10-დან 60 pA-მდე). გამოთვალეთ AP მაქსიმალური სიხშირე იმ პულსის პიკების ხელით დათვლით, რომლებიც იწვევენ AP ყველაზე მაღალ სიხშირეს. AP ზღურბლი გაანალიზებულია დეპოლარიზაციის იმპულსის მეორე წარმოებულის გამოყენებით, რომელიც პირველი იწვევს ერთ ან რამდენიმე AP-ს.
პერფორირებული პლაცრის კონფიგურაცია და ანალიზი. პერფორირებული პლაცრის ჩანაწერის ჩატარება სტანდარტული პროტოკოლების გამოყენებით. გამოიყენეთ ATP-ის და GTP-ის გარეშე პიპეტი, რომელიც არ შეიცავს შემდეგ ინგრედიენტებს: 128 mM გლუკონატი K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA და 2 mM MgCl2 და დაარეგულირეთ pH 7.2-მდე (KOH-ის გამოყენებით). ATP და GTP გამოტოვებულია უჯრედშიდა ხსნარიდან უჯრედის მემბრანის უკონტროლო გამტარიანობის თავიდან ასაცილებლად. პლაცრის პიპეტი ივსება ამფოტერიცინის შემცველი შიდა ხსნარით (დაახლოებით 200-დან 250 მკგ/მლ-მდე; G4888, Sigma-Aldrich) პერფორირებული პლაცრის ჩანაწერის მისაღებად. ამფოტერიცინი გახსნილი იყო დიმეთილსულფოქსიდში (საბოლოო კონცენტრაცია: 0.1-დან 0.3%-მდე; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). გამოყენებულ DMSO-ს კონცენტრაციას მნიშვნელოვანი გავლენა არ მოუხდენია შესწავლილ ნეირონებზე. დარტყმის პროცესის დროს, არხის წინაღობა (Ra) მუდმივად კონტროლდებოდა და ექსპერიმენტი დაიწყო Ra-სა და AP-ის ამპლიტუდის სტაბილიზაციის შემდეგ (20-40 წუთი). სპონტანური აქტივობა იზომება ძაბვის და/ან დენის დამჭერით 2-დან 5 წუთის განმავლობაში. მონაცემთა ანალიზი ჩატარდა Igor Pro-ს (ვერსია 7.05.2, WaveMetrics, აშშ), Excel-ის (ვერსია 2010, Microsoft Corporation, რედმონდი, აშშ) და GraphPad Prism-ის (ვერსია 8.1.2, GraphPad Software Inc., ლა ჯოლა, კალიფორნია) გამოყენებით. სპონტანური AP-ების იდენტიფიცირებისთვის გამოიყენება IgorPro-ს NeuroMatic v3.0c დანამატი. ავტომატურად იდენტიფიცირება AP-ების მოცემული ზღურბლის გამოყენებით, რომელიც ინდივიდუალურად რეგულირდება თითოეული ჩანაწერისთვის. პიკის ინტერვალის გამოყენებით, განსაზღვრეთ პიკის სიხშირე მაქსიმალური მყისიერი პიკის სიხშირით და პიკის საშუალო სიხშირით.
პნ იზოლაცია. ადრე გამოქვეყნებული პროტოკოლის შესაბამისად, პნ გაიწმინდა თაგვის ნათხემიდან განსაზღვრულ ეტაპზე (58). მოკლედ, ნათხემი დაიშალა და დაქუცმაცდა ყინულივით ცივ დისოციაციის გარემოში [HBSS Ca2+ და Mg2+-ის გარეშე, დამატებული 20 mM გლუკოზით, პენიცილინით (50 U/მლ) და სტრეპტომიცინით (0.05 მგ/მლ)], შემდეგ კი გარემო დაიშალა პაპაინში [HBSS, დამატებული 1-ცისტეინ·HCl (1 მგ/მლ), პაპაინით (16 U/მლ) და დეოქსირიბონუკლეაზა I-ით (DNase I; 0.1 მგ/მლ)]. დაამუშავეთ 30 წუთის განმავლობაში 30°C ტემპერატურაზე. ფერმენტული დაშლის თავიდან ასაცილებლად, ქსოვილები თავდაპირველად ოთახის ტემპერატურაზე გარეცხეთ HBSS გარემოში, რომელიც შეიცავს კვერცხის ლორწოს (10 მგ/მლ), BSA-ს (10 მგ/მლ) და DNase-ს (0.1 მგ/მლ), შემდეგ კი 20 mM გლუკოზის შემცველ HBSS გარემოში ნაზად დაფქვით პენიცილინი (50 ერთ/მლ), სტრეპტომიცინი (0.05 მგ/მლ) და DNase (0.1 მგ/მლ) გამოყოფს ერთუჯრედიან უჯრედებს. მიღებული უჯრედული სუსპენზია გაფილტრული იქნა 70 μm უჯრედული საწურით, შემდეგ უჯრედები დაჯგუფდა ცენტრიფუგირებით (11-10 ბრ/წთ, 5 წუთი, 4°C) და ხელახლა შესუპენზირებული იქნა დახარისხების გარემოში [HBSS, დამატებული 20 mM გლუკოზით, 20% ნაყოფის ძროხის შრატით, პენიცილინი (50 ერთ/მლ) და სტრეპტომიცინი (0.05 მგ/მლ)]; შეაფასეთ უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა პროპიდიუმის იოდიდით და დაარეგულირეთ უჯრედების სიმკვრივე 1×106-დან 2×106 უჯრედ/მლ-მდე. ნაკადური ციტომეტრიის ჩატარებამდე, სუსპენზია გაფილტრული იყო 50 μm უჯრედული ფილტრით.
ნაკადური ციტომეტრი. უჯრედების დახარისხება ჩატარდა 4°C ტემპერატურაზე FACSAria III აპარატის (BD Biosciences) და FACSDiva პროგრამული უზრუნველყოფის (BD Biosciences, ვერსია 8.0.1) გამოყენებით. უჯრედული სუსპენზია დახარისხდა 100 μm საქშენის გამოყენებით 20 psi წნევის ქვეშ, ~2800 მოვლენის/წმ სიჩქარით. ვინაიდან ტრადიციული კარიბჭის კრიტერიუმები (უჯრედის ზომა, ბიმოდალური დისკრიმინაცია და გაფანტვის მახასიათებლები) ვერ უზრუნველყოფს PN-ის სწორ იზოლაციას სხვა ტიპის უჯრედებისგან, კარიბჭის სტრატეგია დადგენილია YFP ინტენსივობისა და ავტოფლუორესცენციის პირდაპირი შედარების საფუძველზე mitoYFP+ ​​​​და საკონტროლო mitoYFP − თაგვებში. YFP აღიგზნება ნიმუშის 488 ნმ ლაზერული ხაზით დასხივებით და სიგნალი დგინდება 530/30 ნმ ზოლის გამტარი ფილტრის გამოყენებით. mitoYFP+ ​​​​თაგვებში, Rosa26-mitoYFP რეპორტიორი გენის ფარდობითი სიძლიერე ასევე გამოიყენება ნეირონული სხეულისა და აქსონის ფრაგმენტების გასარჩევად. 7-AAD აღიგზნება 561 ნმ ყვითელი ლაზერით და დგინდება 675/20 ნმ ზოლის გამტარი ფილტრით მკვდარი უჯრედების გამოსარიცხად. ასტროციტების ერთდროულად გამოსაყოფად, უჯრედული სუსპენზია შეიღება ACSA-2-APC-ით, შემდეგ ნიმუში დასხივდა 640 ნმ ლაზერული ხაზით და სიგნალის აღმოსაჩენად გამოყენებული იქნა 660/20 ნმ ზოლის გამტარი ფილტრი.
შეგროვებული უჯრედები დაქუცმაცდა ცენტრიფუგირებით (1110 ბრ/წთ, 5 წუთი, 4°C) და გამოყენებამდე შეინახეს -80°C ტემპერატურაზე. Mfn2cKO თაგვები და მათი ნაშიერი ლეკვები კლასიფიცირდნენ ერთსა და იმავე დღეს, რათა მინიმუმამდე დაეყვანათ პროცედურული ცვალებადობა. FACS მონაცემების პრეზენტაცია და ანალიზი ჩატარდა FlowJo პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (FlowJo LLC, აშლენდი, ორეგონი, აშშ).
როგორც ზემოთ აღინიშნა (59), დახარისხებული ნეირონებიდან დნმ-ის იზოლირებისთვის გამოიყენება რეალურ დროში პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR) შემდგომი მიტოქონდრიული დნმ-ის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის. ხაზოვანება და ზღურბლის მგრძნობელობა თავდაპირველად შემოწმდა qPCR-ის ჩატარებით უჯრედების სხვადასხვა რაოდენობაზე. მოკლედ, შეგროვდა 300 PN ლიზისის ბუფერში, რომელიც შედგება 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA-სგან, 0.5% Tween 20-ისა და პროტეინაზა K-სგან (200 ნგ/მლ) და ინკუბირებული იქნა 55°C ტემპერატურაზე 120 წუთის განმავლობაში. უჯრედები შემდგომ ინკუბირებული იქნა 95°C ტემპერატურაზე 10 წუთის განმავლობაში, რათა უზრუნველყოფილიყო პროტეინაზა K-ს სრული ინაქტივაცია. mt-Nd1-ისთვის სპეციფიკური TaqMan ზონდის (Thermo Fisher) გამოყენებით, მიტოქონდრიული დნმ გაიზომა ნახევრად რაოდენობრივი პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის მეთოდით 7900HT რეალურ დროში პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის სისტემაში (Thermo Fisher Scientific). Science, კატალოგის ნომერი Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, კატალოგის ნომერი AIVI3E8) და 18S (Thermo Fisher Scientific, კატალოგის ნომერი Hs99999901_s1) გენები.
პროტეომის ნიმუშის მომზადება. ხსნარის 95°C ტემპერატურაზე 10 წუთის განმავლობაში გაცხელებით და ულტრაბგერითი დამუშავებით ლიზისის ბუფერში [6 M გუანიდინის ქლორიდი, 10 mM ტრის(2-კარბოქსიეთილ) ფოსფინის ჰიდროქლორიდი, 10 mM ქლორაცეტამიდი და 100 mM ტრის-ლიზის გაყინული ნეირონების გრანულები HCl-ში]. Bioruptor-ზე (Diagenode) 10 წუთის განმავლობაში (30 წამიანი იმპულსი / 30 წამიანი პაუზის პერიოდი). ნიმუში განზავდა 1:10 თანაფარდობით 20 mM ტრის-HCl-ში (pH 8.0), შეერია 300 ნგ ტრიფსინ ოქროსთან (Promega) და ინკუბირებული იყო მთელი ღამით 37°C ტემპერატურაზე სრული მონელების მისაღწევად. მეორე დღეს, ნიმუში დაცენტრიფუგდა 20,000 გ-ზე 20 წუთის განმავლობაში. ზედა ფენა განზავდა 0.1%-იანი ჭიანჭველმჟავით და ხსნარი გაუმარილდა თვითნაკეთი StageTips-ებით. ნიმუში გაშრეს SpeedVac ინსტრუმენტში (Eppendorf concentrator plus 5305) 45°C ტემპერატურაზე, შემდეგ კი პეპტიდი სუსპენზირდა 0.1%-იან ჭიანჭველმჟავაში. ყველა ნიმუში ერთდროულად მომზადდა ერთი და იგივე პირის მიერ. ასტროციტების ნიმუშების ანალიზისთვის, 4 მკგ უმარილო პეპტიდი მონიშნული იქნა ტანდემური მასის მონიშვნით (TMT10plex, კატალოგის ნომერი 90110, Thermo Fisher Scientific) პეპტიდისა და TMT რეაგენტის 1:20 თანაფარდობით. TMT მონიშვნისთვის, TMT რეაგენტის 0.8 მგ ხელახლა სუსპენზირებული იქნა 70 მკლ უწყლო ACN-ში და გამხმარი პეპტიდი ხელახლა იქნა აღდგენილი 9 მკლ 0.1 M TEAB-ში (ტრიეთილამონიუმის ბიკარბონატი), რომელსაც დაემატა 7 მკლ TMT რეაგენტი ACN-ში. კონცენტრაცია იყო 43.75%. 60 წუთიანი ინკუბაციის შემდეგ, რეაქცია ჩაქრა 2 მკლ 5%-იანი ჰიდროქსილამინით. მონიშნული პეპტიდები შეგროვდა, გაშრა, ხელახლა სუსპენზირებული იქნა 200 μl 0.1%-იან ჭიანჭველმჟავაში (FA), გაიყო ორად და შემდეგ გაუმარილება მოხდა თვითნაკეთი StageTips-ის გამოყენებით. UltiMate 3000 ულტრამაღალი ეფექტურობის თხევადი ქრომატოგრაფის გამოყენებით (UltiMate 3000 ულტრამაღალი ეფექტურობის თხევადი ქრომატოგრაფი), ორი ნახევრიდან ერთი დაიყო 1 მმ x 150 მმ Acquity ქრომატოგრაფიულ სვეტზე, რომელიც შევსებულია 130 Å1.7 μm C18 ნაწილაკებით (Waters, კატალოგის ნომერი SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). გამოყავით პეპტიდები 30 μl/წთ ნაკადის სიჩქარით, გამოყავით 1%-დან 50%-მდე ბუფერ B-დან 85 წუთის განმავლობაში ეტაპობრივი გრადიენტით 96 წუთის განმავლობაში, 50%-დან 95%-მდე ბუფერ B-მდე 3 წუთის განმავლობაში, შემდეგ 8 წუთი 95%-იანი ბუფერ B-სთვის; ბუფერი A შედგება 5% ACN-ისა და 10 mM ამონიუმის ბიკარბონატისგან (ABC), ხოლო ბუფერი B - 80% ACN-ისა და 10 mM ABC-ისგან. ფრაქციები შეაგროვეთ ყოველ 3 წუთში ერთხელ და გააერთიანეთ ისინი ორ ჯგუფად (1 + 17, 2 + 18 და ა.შ.) და გააშრეთ ვაკუუმ ცენტრიფუგაში.
LC-MS/MS ანალიზი. მას-სპექტრომეტრიისთვის, პეპტიდები (რიცხვი r119.aq) გამოიყო 25 სმ, 75 μm შიდა დიამეტრის PicoFrit ანალიტიკურ სვეტზე (ახალი ობიექტივი, ნაწილის ნომერი PF7508250), რომელიც აღჭურვილი იყო 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ საშუალებით (Dr. Maisch, mat), EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, გერმანია). სვეტი შენარჩუნებული იყო 50°C ტემპერატურაზე. ბუფერები A და B შეადგენს შესაბამისად 0.1% ჭიანჭველმჟავას წყალში და 0.1% ჭიანჭველმჟავას 80% ACN-ში. პეპტიდები გამოიყო 6%-დან 31%-მდე ბუფერ B-დან 65 წუთის განმავლობაში და 31%-დან 50%-მდე ბუფერ B-დან 5 წუთის განმავლობაში 200 ნლ/წთ გრადიენტით. ელუირებული პეპტიდები გაანალიზდა Orbitrap Fusion მას-სპექტრომეტრზე (Thermo Fisher Scientific). პეპტიდური წინამორბედის m/z გაზომვა ხორციელდება 120,000 გარჩევადობით 350-დან 1500 მ/ზ დიაპაზონში. 27%-იანი ნორმალიზებული შეჯახების ენერგიის გამოყენებით, მაღალი ენერგიის C ხაფანგის დისოციაციის (HCD) დაშლისთვის შეირჩევა ყველაზე ძლიერი წინამორბედი 2-დან 6-მდე დამუხტვის მდგომარეობით. ციკლის დრო დაყენებულია 1 წმ-ზე. პეპტიდური ფრაგმენტის m/z მნიშვნელობა გაიზომა იონურ ხაფანგში ყველაზე პატარა AGC სამიზნის 5×104 და მაქსიმალური ინექციის დროის 86 მილიწამის გამოყენებით. ფრაგმენტაციის შემდეგ, წინამორბედი მოთავსდა დინამიურ გამორიცხვის სიაში 45 წამის განმავლობაში. TMT-ით მონიშნული პეპტიდები გამოეყო 50 სმ, 75 μm Acclaim PepMap სვეტზე (Thermo Fisher Scientific, კატალოგის ნომერი 164942), ხოლო მიგრაციის სპექტრები გაანალიზდა Orbitrap Lumos Tribrid მას-სპექტრომეტრზე (Thermo Fisher Scientific), რომელიც აღჭურვილია მაღალი ველის ასიმეტრიული ტალღის ფორმის იონებით (FAIMS) აღჭურვილობით (Thermo Fisher Scientific), რომელიც მუშაობს ორ კომპენსაციის ძაბვაზე -50 და -70 ვოლტზე. სინქრონიზაციის წინამორბედის საფუძველზე შერჩეული MS3 გამოიყენება TMT ანგარიშის იონური სიგნალის გაზომვისთვის. პეპტიდის გამოყოფა განხორციელდა EASY-nLC 1200-ზე, 90%-იანი ხაზოვანი გრადიენტული ელუციის გამოყენებით, ბუფერის კონცენტრაციით 6%-დან 31%-მდე; ბუფერი A იყო 0.1% FA, ხოლო ბუფერი B - 0.1% FA და 80% ACN. ანალიტიკური სვეტი მუშაობს 50°C ტემპერატურაზე. გამოიყენეთ FreeStyle (ვერსია 1.6, Thermo Fisher Scientific) ორიგინალი ფაილის FAIMS კომპენსაციის ძაბვის მიხედვით გასაყოფად.
ცილის იდენტიფიკაცია და რაოდენობრივი განსაზღვრა. ინტეგრირებული Andromeda საძიებო სისტემის გამოყენებით, ორიგინალური მონაცემები გაანალიზდა MaxQuant ვერსიის 1.5.2.8-ის გამოყენებით (https://maxquant.org/). Aequorea victoria-დან მიღებული Cre რეკომბინაზას და YFP თანმიმდევრობების გარდა, პეპტიდური ფრაგმენტების სპექტრები მოიძებნა თაგვის საცნობარო პროტეომის კანონიკური თანმიმდევრობისა და იზოფორმის თანმიმდევრობისთვის (Proteome ID UP000000589, გადმოწერილი UniProt-დან 2017 წლის მაისში). მეთიონინის დაჟანგვა და ცილის N-ტერმინალური აცეტილირება დაყენებული იყო ცვლად მოდიფიკაციებად; ცისტეინის კარბამოილ მეთილირება დაყენებული იყო ფიქსირებულ მოდიფიკაციებად. მონელების პარამეტრები დაყენებულია „სპეციფიკურობაზე“ და „ტრიფსინ/P“-ზე. ცილის იდენტიფიკაციისთვის გამოყენებული პეპტიდებისა და ბრჭყვიალა პეპტიდების მინიმალური რაოდენობაა 1; უნიკალური პეპტიდების მინიმალური რაოდენობაა 0. პეპტიდური რუკის შესაბამისობის პირობებში, ცილის იდენტიფიკაციის მაჩვენებელი იყო 0.01. ჩართულია „მეორე პეპტიდის“ ოფცია. წარმატებული იდენტიფიკაციების სხვადასხვა ორიგინალურ ფაილებს შორის გადასატანად გამოიყენეთ „შესაბამისობა გაშვებებს შორის“ ოფცია. ეტიკეტის გარეშე რაოდენობრივი შეფასებისთვის (LFQ) გამოიყენეთ LFQ მინიმალური თანაფარდობის რაოდენობა 1 (60). LFQ ინტენსივობა იფილტრება მინიმუმ ორი ვალიდური მნიშვნელობისთვის მინიმუმ ერთ გენოტიპურ ჯგუფში თითოეულ დროის წერტილში და ექსტრაპოლირდება ნორმალური განაწილებიდან 0.3 სიგანით და ქვევით 1.8-ით გადაადგილდება. LFQ შედეგების გასაანალიზებლად გამოიყენეთ Perseus-ის გამოთვლითი პლატფორმა (https://maxquant.net/perseus/) და R (https://r-project.org/). დიფერენციალური ექსპრესიის ანალიზისთვის გამოყენებული იქნა limma პროგრამული პაკეტიდან ორმხრივი ზომიერი t ტესტი (61). საძიებო მონაცემების ანალიზი ხორციელდება ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally და pheatmap-ის გამოყენებით. TMT-ზე დაფუძნებული პროტეომიკის მონაცემები გაანალიზდა MaxQuant 1.6.10.43 ვერსიის გამოყენებით. ნედლი პროტეომიკის მონაცემები მოძებნეთ UniProt-ის ადამიანის პროტეომიკის მონაცემთა ბაზიდან, რომელიც გადმოწერილი იქნა 2018 წლის სექტემბერში. ანალიზი მოიცავს მწარმოებლის მიერ მოწოდებულ იზოტოპის სისუფთავის კორექციის ფაქტორს. დიფერენციალური ექსპრესიის ანალიზისთვის გამოიყენეთ limma R-ში. ორიგინალი მონაცემები, მონაცემთა ბაზის ძიების შედეგები და მონაცემთა ანალიზის სამუშაო პროცესი და შედეგები ინახება ProteomeXchange ალიანსში PRIDE პარტნიორი საცავის მეშვეობით, მონაცემთა ნაკრების იდენტიფიკატორით PXD019690.
ფუნქციური ანოტაციები ამდიდრებს ანალიზს. 8 კვირის შემდეგ მონაცემთა ნაკრების ფუნქციური ანოტაციის ტერმინების სიმდიდრის დასადგენად გამოყენებული იქნა Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ინსტრუმენტი (სურათი 1). მოკლედ, LC-MS/MS (ტანდემური მას-სპექტრომეტრია) მონაცემთა ანალიზიდან მიღებული ცილების რაოდენობრივი სია გამოიყენება შემდეგი ფილტრის კრიტერიუმებით: Mus musculus შერჩეულია სახეობად და ფონად, ხოლო კატეგორია აჩვენებს, რომ Benjamini-ს მიერ კორექტირებული P მნიშვნელობა 0.05 ან უფრო დაბალი გამდიდრებისთვის მნიშვნელოვნად ითვლება. ამ გრაფიკისთვის ნაჩვენებია თითოეულ კლასტერში ხუთი ყველაზე მაღალი კატეგორია კორექტირებული P მნიშვნელობის საფუძველზე. მრავალჯერადი t-ტესტის გამოყენებით, Benjamini-ს, Krieger-ის და Yekutieli-ს ორეტაპიანი ხაზოვანი ბუსტის პროგრამის გამოყენებით (Q = 5%), ცილის ექსპრესიის დროის კურსის ანალიზი ტარდება თითოეულ კატეგორიაში იდენტიფიცირებულ მნიშვნელოვან კანდიდატებზე და თითოეული რიგი ცალ-ცალკე გაანალიზებულია. არ არის საჭირო თანმიმდევრული სტანდარტული გადახრის მიღება.
ამ კვლევის შედეგების გამოქვეყნებულ მონაცემთა ბაზებთან შესადარებლად და ნახაზ 1-ზე მოცემული ვენის დიაგრამის გენერირებისთვის, ჩვენ გავაერთიანეთ ცილების რაოდენობრივი სია MitoCarta 2.0 ანოტაციებთან (24). დიაგრამის გენერირებისთვის გამოვიყენეთ ონლაინ ინსტრუმენტი Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
პროტეომიკის ანალიზისთვის გამოყენებული სტატისტიკური პროცედურების შესახებ დეტალური ინფორმაციისთვის, გთხოვთ, იხილოთ მასალებისა და მეთოდების შესაბამისი განყოფილება. ყველა სხვა ექსპერიმენტისთვის დეტალური ინფორმაცია შეგიძლიათ იხილოთ შესაბამის ლეგენდაში. თუ სხვა რამ არ არის მითითებული, ყველა მონაცემი გამოხატულია საშუალო ± SEM-ის სახით და ყველა სტატისტიკური ანალიზი ჩატარდა GraphPad Prism 8.1.2 პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.
ამ სტატიის დამატებითი მასალებისთვის იხილეთ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
ეს არის ღია წვდომის სტატია, რომელიც გავრცელებულია Creative Commons Attribution-Non-Commercial License-ის პირობებით, რომელიც იძლევა გამოყენების, გავრცელებისა და რეპროდუცირების საშუალებას ნებისმიერ მედიაში, იმ პირობით, რომ საბოლოო გამოყენება არ არის კომერციული სარგებლის მისაღებად და წინაპირობაა, რომ ორიგინალი ნამუშევარი სწორია. წყარო.
შენიშვნა: ჩვენ მხოლოდ თქვენი ელექტრონული ფოსტის მისამართის მითითებას გთხოვთ, რათა გვერდზე თქვენს მიერ რეკომენდაციის გაწევრიანებულმა პირმა იცოდეს, რომ გსურთ, რომ მათ ელ.წერილი ნახონ და რომ ის სპამი არ არის. ჩვენ არ შევინახავთ ელექტრონული ფოსტის მისამართებს.
ეს კითხვა გამოიყენება იმის შესამოწმებლად, ხართ თუ არა ვიზიტორი და ავტომატური სპამის გაგზავნის თავიდან ასაცილებლად.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ლარსონი
დისფუნქციური ნეირონების პროტეომიკურმა ანალიზმა აჩვენა, რომ მეტაბოლური პროგრამები აქტიურდება ნეიროდეგენერაციის საწინააღმდეგოდ.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ლარსონი
დისფუნქციური ნეირონების პროტეომიკურმა ანალიზმა აჩვენა, რომ მეტაბოლური პროგრამები აქტიურდება ნეიროდეგენერაციის საწინააღმდეგოდ.
©2020 ამერიკის ასოციაცია მეცნიერების წინსვლისთვის. ყველა უფლება დაცულია. AAAS არის HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef და COUNTER-ის პარტნიორი. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.