გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებული ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის მხარდაჭერა შეზღუდული აქვს. საუკეთესო შედეგის მისაღწევად, გირჩევთ, გამოიყენოთ თქვენი ბრაუზერის უფრო ახალი ვერსია (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, საიტს სტილის ან JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
პროპიონის მჟავა (PPA) გამოიყენება ნეიროგანვითარების ისეთ დარღვევებში, როგორიცაა აუტიზმის სპექტრის აშლილობა, მიტოქონდრიული დისფუნქციის როლის შესასწავლად. ცნობილია, რომ PPA არღვევს მიტოქონდრიულ ბიოგენეზს, მეტაბოლიზმს და მეტაბოლიზმს. თუმცა, PPA-ს გავლენა მიტოქონდრიულ დინამიკაზე, გახლეჩასა და შერწყმაზე კვლავ პრობლემურია ამ მექანიზმების რთული დროითი ბუნების გამო. აქ ჩვენ ვიყენებთ დამატებით რაოდენობრივ ვიზუალიზაციის ტექნიკას იმის გამოსაკვლევად, თუ როგორ მოქმედებს PPA მიტოქონდრიულ ულტრასტრუქტურაზე, მორფოლოგიასა და დინამიკაზე ნეირონის მსგავს SH-SY5Y უჯრედებში. PPA-მ (5 mM) გამოიწვია მიტოქონდრიული ფართობის (p < 0.01), ფერეტის დიამეტრისა და გარშემოწერილობის (p < 0.05) და ფართობის 2-ის (p < 0.01) მნიშვნელოვანი შემცირება. მიტოქონდრიული მოვლენების ლოკატორის ანალიზმა აჩვენა გახლეჩისა და შერწყმის მოვლენების მნიშვნელოვანი ზრდა (p < 0.05), რითაც შენარჩუნებულია მიტოქონდრიული ქსელის მთლიანობა სტრესის პირობებში. გარდა ამისა, მნიშვნელოვნად შემცირდა cMYC-ის (p < 0.0001), NRF1-ის (p < 0.01), TFAM-ის (p < 0.05), STOML2-ის (p < 0.0001) და OPA1-ის (p < 0.05) mRNA ექსპრესია. (01). ეს ასახავს მიტოქონდრიული მორფოლოგიის, ბიოგენეზისა და დინამიკის რემოდელირებას სტრესულ პირობებში ფუნქციის შესანარჩუნებლად. ჩვენი მონაცემები იძლევა ახალ წარმოდგენას PPA-ს მიტოქონდრიულ დინამიკაზე ზემოქმედების შესახებ და ხაზს უსვამს ვიზუალიზაციის ტექნიკის სარგებლიანობას მიტოქონდრიულ სტრესულ რეაქციებში ჩართული რთული მარეგულირებელი მექანიზმების შესასწავლად.
მიტოქონდრიები ენერგიის წარმოებასა და ბიოსინთეზში მათი ტიპური როლების გარდა, უჯრედული ფუნქციების განუყოფელი ნაწილია. მიტოქონდრიული მეტაბოლიზმი კალციუმის სიგნალიზაციის, მეტაბოლური და რედოქს ჰომეოსტაზის, ანთებითი სიგნალიზაციის, ეპიგენეტიკური მოდიფიკაციების, უჯრედების პროლიფერაციის, დიფერენციაციის და დაპროგრამებული უჯრედების სიკვდილის ძირითადი რეგულატორია. კერძოდ, მიტოქონდრიული მეტაბოლიზმი კრიტიკულად მნიშვნელოვანია ნეირონების განვითარების, გადარჩენისა და ფუნქციონირებისთვის და ფართოდ არის ჩართული ნეიროპათოლოგიის სხვადასხვა გამოვლინებაში2,3,4.
ბოლო ათწლეულის განმავლობაში, მეტაბოლური სტატუსი ნეიროგენეზის, დიფერენციაციის, მომწიფებისა და პლასტიურობის ცენტრალურ რეგულატორად იქცა5,6. ბოლო დროს, მიტოქონდრიული მორფოლოგია და დინამიკა მიტოზის, დინამიური პროცესის, განსაკუთრებით მნიშვნელოვანი კომპონენტები გახდა, რომელიც უჯრედებში ჯანსაღი მიტოქონდრიების მარაგს ინარჩუნებს. მიტოქონდრიული დინამიკა რეგულირდება რთული ურთიერთდამოკიდებული გზებით, მიტოქონდრიული ბიოგენეზიდან და ბიოენერგეტიკიდან დაწყებული მიტოქონდრიული დაშლით, შერწყმით, ტრანსპორტითა და კლირენსით დამთავრებული7,8. ამ ინტეგრაციული მექანიზმებიდან რომელიმეს დარღვევა აფერხებს ჯანსაღი მიტოქონდრიული ქსელების შენარჩუნებას და ღრმა ფუნქციურ შედეგებს იწვევს ნეიროგანვითარებაზე9,10. მართლაც, მიტოქონდრიული დინამიკის დისრეგულაცია შეინიშნება მრავალ ფსიქიატრიულ, ნეიროდეგენერაციულ და ნეიროგანვითარების დარღვევაში, მათ შორის აუტიზმის სპექტრის აშლილობებში (ASD)11,12.
აუტიზმის სპექტრის აშლილობა (ასდ) არის ჰეტეროგენული ნეიროგანვითარების დარღვევა რთული გენეტიკური და ეპიგენეტიკური არქიტექტურით. ასდ-ის მემკვიდრეობითობა უდავოა, მაგრამ ძირითადი მოლეკულური ეტიოლოგია ჯერ კიდევ ცუდად არის შესწავლილი. პრეკლინიკური მოდელებიდან, კლინიკური კვლევებიდან და მულტიომიკური მოლეკულური მონაცემთა ნაკრებებიდან დაგროვილი მონაცემები ასდ-ში მიტოქონდრიული დისფუნქციის მზარდ მტკიცებულებას იძლევა13,14. ჩვენ ადრე ჩავატარეთ გენომის მასშტაბით დნმ-ის მეთილირების სკრინინგი ასდ-ის მქონე პაციენტების ჯგუფში და გამოვავლინეთ დიფერენცირებულად მეთილირებული გენები, რომლებიც მიტოქონდრიული მეტაბოლური გზების გასწვრივ იყო დაჯგუფებული15. შემდგომში ჩვენ გამოვაქვეყნეთ მიტოქონდრიული ბიოგენეზისა და დინამიკის ცენტრალური რეგულატორების დიფერენციალური მეთილირება, რაც ასოცირდებოდა მტდნმ-ის ასლების რაოდენობის ზრდასთან და შარდის მეტაბოლური პროფილის შეცვლასთან ასდ-ში16. ჩვენი მონაცემები სულ უფრო მეტ მტკიცებულებას იძლევა, რომ მიტოქონდრიული დინამიკა და ჰომეოსტაზი ცენტრალურ როლს თამაშობს ასდ-ის პათოფიზიოლოგიაში. ამიტომ, მიტოქონდრიულ დინამიკას, მორფოლოგიასა და ფუნქციას შორის ურთიერთობის მექანიკური გაგების გაუმჯობესება მეორადი მიტოქონდრიული დისფუნქციით დამახასიათებელი ნევროლოგიური დაავადებების მიმდინარე კვლევის მთავარი მიზანია.
მიტოქონდრიული სტრესული რეაქციების სპეციფიკური გენების როლის შესასწავლად ხშირად გამოიყენება მოლეკულური ტექნიკა. თუმცა, ეს მიდგომა შეიძლება შეზღუდული იყოს მიტოზური კონტროლის მექანიზმების მრავალმხრივი და დროითი ბუნებით. უფრო მეტიც, მიტოქონდრიული გენების დიფერენციალური ექსპრესია ფუნქციური ცვლილებების არაპირდაპირი მაჩვენებელია, განსაკუთრებით იმის გამო, რომ, როგორც წესი, მხოლოდ გენების შეზღუდული რაოდენობაა გაანალიზებული. ამიტომ, შემოთავაზებულია მიტოქონდრიული ფუნქციისა და ბიოენერგეტიკის შესწავლის უფრო პირდაპირი მეთოდები17. მიტოქონდრიული მორფოლოგია მჭიდრო კავშირშია მიტოქონდრიულ დინამიკასთან. მიტოქონდრიული ფორმა, შეკავშირება და სტრუქტურა კრიტიკულია ენერგიის წარმოებისთვის, მიტოქონდრიული და უჯრედული გადარჩენისთვის5,18. უფრო მეტიც, მიტოზის სხვადასხვა კომპონენტი ფოკუსირებულია მიტოქონდრიული მორფოლოგიის ცვლილებებზე, რაც შეიძლება მიტოქონდრიული დისფუნქციის სასარგებლო საბოლოო წერტილებად იქცეს და შემდგომი მექანიკური კვლევების საფუძველი გახდეს.
მიტოქონდრიული მორფოლოგიის პირდაპირი დაკვირვება შესაძლებელია ტრანსმისიული ელექტრონული მიკროსკოპიის (TEM) გამოყენებით, რაც საშუალებას იძლევა უჯრედული ულტრასტრუქტურის დეტალური შესწავლის. TEM პირდაპირ ვიზუალიზაციას უკეთებს მიტოქონდრიული კრისტების მორფოლოგიას, ფორმასა და სტრუქტურას ინდივიდუალური მიტოქონდრიების გარჩევადობით, იმის ნაცვლად, რომ მხოლოდ გენის ტრანსკრიფციას, ცილის ექსპრესიას ან უჯრედების პოპულაციებში მიტოქონდრიულ ფუნქციურ პარამეტრებს დაეყრდნოს17,19,20. გარდა ამისა, TEM ხელს უწყობს მიტოქონდრიებსა და სხვა ორგანელებს, როგორიცაა ენდოპლაზმური ბადე და აუტოფაგოსომები, შორის ურთიერთქმედების შესწავლას, რომლებიც მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ მიტოქონდრიულ ფუნქციასა და ჰომეოსტაზში21,22. ამრიგად, ეს TEM-ს კარგ საწყის წერტილად აქცევს მიტოქონდრიული დისფუნქციის შესასწავლად, სანამ კონკრეტულ გზებზე ან გენებზე გავამახვილებთ ყურადღებას. რადგან მიტოქონდრიული ფუნქცია სულ უფრო მნიშვნელოვანი ხდება ნეიროპათოლოგიისთვის, აშკარაა საჭიროება, რომ შესაძლებელი იყოს მიტოქონდრიული მორფოლოგიისა და დინამიკის პირდაპირი და რაოდენობრივი შესწავლა in vitro ნეირონულ მოდელებში.
ამ სტატიაში ჩვენ განვიხილავთ მიტოქონდრიულ დინამიკას აუტიზმის სპექტრის აშლილობის დროს მიტოქონდრიული დისფუნქციის ნეირონულ მოდელში. ჩვენ ადრე აღვნიშნეთ პროპიონილ-CoA კარბოქსილაზა ბეტას (PCCB) დიფერენციალური მეთილირება ASD15-ში, მიტოქონდრიული პროპიონილ-CoA კარბოქსილაზა ფერმენტ PCC-ის ქვეერთეულში. ცნობილია, რომ PCC-ის დისრეგულაცია იწვევს პროპიონილის წარმოებულების, მათ შორის პროპიონის მჟავას (PPA) ტოქსიკურ დაგროვებას23,24,25. ნაჩვენებია, რომ PPA არღვევს ნეირონულ მეტაბოლიზმს და ცვლის ქცევას in vivo და წარმოადგენს დამკვიდრებულ ცხოველურ მოდელს ASD-ში ჩართული ნეიროგანვითარების მექანიზმების შესასწავლად26,27,28. გარდა ამისა, ცნობილია, რომ PPA არღვევს მიტოქონდრიის მემბრანულ პოტენციალს, ბიოგენეზს და სუნთქვას in vitro და ფართოდ გამოიყენება ნეირონებში მიტოქონდრიული დისფუნქციის მოდელირებისთვის29,30. თუმცა, PPA-ით გამოწვეული მიტოქონდრიული დისფუნქციის გავლენა მიტოქონდრიულ მორფოლოგიასა და დინამიკაზე კვლავ ცუდად არის შესწავლილი.
ეს კვლევა იყენებს დამატებით ვიზუალიზაციის ტექნიკას, რათა რაოდენობრივად განსაზღვროს PPA-ს გავლენა მიტოქონდრიულ მორფოლოგიაზე, დინამიკასა და ფუნქციაზე SH-SY5Y უჯრედებში. პირველ რიგში, ჩვენ შევიმუშავეთ TEM მეთოდი მიტოქონდრიულ მორფოლოგიასა და ულტრასტრუქტურაში ცვლილებების ვიზუალიზაციისთვის17,31,32. მიტოქონდრიების დინამიური ბუნების გათვალისწინებით33, ჩვენ ასევე გამოვიყენეთ მიტოქონდრიული მოვლენების ლოკალიზაციის (MEL) ანალიზი, რათა რაოდენობრივად განსაზღვრულიყო ცვლილებები დაშლისა და შერწყმის მოვლენებს, მიტოქონდრიულ რაოდენობასა და მოცულობას შორის ბალანსის ცვლილებებში PPA სტრესის ქვეშ. და ბოლოს, ჩვენ შევისწავლეთ, დაკავშირებულია თუ არა მიტოქონდრიული მორფოლოგია და დინამიკა ბიოგენეზში, დაშლასა და შერწყმაში ჩართული გენების ექსპრესიის ცვლილებებთან. ერთად აღებული, ჩვენი მონაცემები ასახავს მიტოქონდრიული დინამიკის მარეგულირებელი მექანიზმების სირთულის გარკვევის გამოწვევას. ჩვენ ხაზს ვუსვამთ TEM-ის სარგებლიანობას მიტოქონდრიული მორფოლოგიის შესწავლაში, როგორც მიტოზის გაზომვადი კონვერგენტული საბოლოო წერტილი SH-SY5Y უჯრედებში. გარდა ამისა, ჩვენ ხაზს ვუსვამთ, რომ TEM მონაცემები ყველაზე მდიდარ ინფორმაციას გვაწვდის, როდესაც ის კომბინირებულია ვიზუალიზაციის ტექნიკასთან, რომელიც ასევე ასახავს დინამიურ მოვლენებს მეტაბოლური სტრესის საპასუხოდ. ნეირონული უჯრედების მიტოზის მხარდამჭერი მოლეკულური მარეგულირებელი მექანიზმების შემდგომი დახასიათება შესაძლოა მნიშვნელოვან ინფორმაციას გვაწვდიდეს ნერვული სისტემის მიტოქონდრიული კომპონენტისა და ნეიროდეგენერაციული დაავადებების შესახებ.
მიტოქონდრიული სტრესის გამოსაწვევად, SH-SY5Y უჯრედები დამუშავდა PPA-თი 3 mM და 5 mM ნატრიუმის პროპიონატის (NaP) გამოყენებით. TEM-მდე, ნიმუშები დაექვემდებარა კრიოგენულ მომზადებას მაღალი წნევის გაყინვისა და გაყინვის გამოყენებით (სურ. 1ა). ჩვენ შევიმუშავეთ მიტოქონდრიული გამოსახულების ანალიზის ავტომატური სისტემა, რათა გავზომოთ მიტოქონდრიული პოპულაციების რვა მორფოლოგიური პარამეტრი სამ ბიოლოგიურ რეპლიკატში. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ PPA-თი დამუშავებამ მნიშვნელოვნად შეცვალა ოთხი პარამეტრი: ფართობი 2, ფართობი, პერიმეტრი და ფერეტის დიამეტრი (სურ. 1ბ-ე). ფართობი 2 მნიშვნელოვნად შემცირდა როგორც 3 mM, ასევე 5 mM PPA-თი დამუშავებისას (p = 0.0183 და p = 0.002, შესაბამისად) (სურ. 1ბ), ხოლო ფართობი (p = 0.003), პერიმეტრი (p = 0.0106) და ფერეტის დიამეტრი მნიშვნელოვნად შემცირდა. მნიშვნელოვანი შემცირება (p = 0.0172) იყო 5 mM დამუშავების ჯგუფში საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (სურ. 1გ-ე). ფართობისა და გარშემოწერილობის მნიშვნელოვანმა შემცირებამ აჩვენა, რომ 5 mM PPA-თი დამუშავებულ უჯრედებს ჰქონდათ უფრო პატარა, უფრო მომრგვალებული მიტოქონდრიები და რომ ეს მიტოქონდრიები ნაკლებად წაგრძელებული იყო, ვიდრე საკონტროლო უჯრედებში. ეს ასევე შეესაბამება ფერეტის დიამეტრის მნიშვნელოვან შემცირებას, რაც დამოუკიდებელი პარამეტრია, რომელიც მიუთითებს ნაწილაკების კიდეებს შორის უდიდესი მანძილის შემცირებაზე. დაფიქსირდა კრისტების ულტრასტრუქტურის ცვლილებები: PPA სტრესის გავლენის ქვეშ კრისტები ნაკლებად გამოხატული გახდა (სურ. 1ა, პანელი B). თუმცა, ყველა სურათი ნათლად არ ასახავდა კრისტების ულტრასტრუქტურას, ამიტომ ამ ცვლილებების რაოდენობრივი ანალიზი არ ჩატარებულა. ეს TEM მონაცემები შეიძლება ასახავდეს სამ შესაძლო სცენარს: (1) PPA აძლიერებს დაშლას ან აფერხებს შერწყმას, რაც იწვევს არსებული მიტოქონდრიების ზომაში შემცირებას; (2) გაძლიერებული ბიოგენეზი ქმნის ახალ, უფრო პატარა მიტოქონდრიებს ან (3) ერთდროულად იწვევს ორივე მექანიზმს. მიუხედავად იმისა, რომ ეს პირობები TEM-ით არ გამოირჩევა, მნიშვნელოვანი მორფოლოგიური ცვლილებები მიუთითებს მიტოქონდრიული ჰომეოსტაზისა და დინამიკის ცვლილებებზე PPA სტრესის ქვეშ. შემდგომში ჩვენ შევისწავლეთ დამატებითი პარამეტრები, რათა დაგვესვათ ეს დინამიკა და მათ საფუძვლად არსებული პოტენციური მექანიზმები.
პროპიონის მჟავა (PPA) ახდენს მიტოქონდრიული მორფოლოგიის რემოდელირებას. (ა) ტრანსმისიული ელექტრონული მიკროსკოპიის (TEM) წარმომადგენლობითი გამოსახულებები აჩვენებს, რომ მიტოქონდრიის ზომა მცირდება და მიტოქონდრიები უფრო პატარა და მომრგვალებული ხდება PPA-თი დამუშავების ზრდასთან ერთად; შესაბამისად, 0 mM (დაუმუშავებელი), 3 mM და 5 mM. წითელი ისრები მიუთითებს მიტოქონდრიებზე. (ბ–ე) SH-SY5Y უჯრედები, რომლებიც დამუშავებული იყო PPA-თი 24 საათის განმავლობაში, მომზადდა TEM-ისთვის და შედეგები გაანალიზდა Fiji/ImageJ-ის გამოყენებით. რვა პარამეტრიდან ოთხმა აჩვენა მნიშვნელოვანი განსხვავებები საკონტროლო (დაუმუშავებელი, 0 mM PPA) და დამუშავებულ (3 mM და 5 mM PPA) უჯრედებს შორის. (ბ) რეგიონი 2, (გ) ფართობი, (დ) პერიმეტრი, (ე) ფერეტის დიამეტრი. მნიშვნელოვანი განსხვავებების დასადგენად გამოყენებული იქნა ვარიაციის ცალმხრივი ანალიზი (კონტროლი vs. დამუშავება) და დანეტის მრავალჯერადი შედარების ტესტი (p < 0.05). მონაცემთა წერტილები წარმოადგენს თითოეული ცალკეული უჯრედის საშუალო მიტოქონდრიულ მნიშვნელობას, ხოლო შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± SEM-ს. ნაჩვენები მონაცემები წარმოადგენს n = 3-ს, მინიმუმ 24 უჯრედს თითო რეპლიკატში; სულ გაანალიზდა 266 სურათი; * მიუთითებს p < 0.05-ზე, ** მიუთითებს p < 0.01-ზე.
მიტოქონდრიული დინამიკის PPA-ზე რეაგირების შემდგომი დასახასიათებლად, მიტოქონდრიები შევღებეთ ტეტრამეთილროდამინის ეთილის ეთერით (TMRE) და გამოვიყენეთ დროის შენელების მიკროსკოპია და MEL ანალიზი მიტოქონდრიების ლოკალიზაციისა და რაოდენობრივი განსაზღვრის მიზნით 24 საათის შემდეგ 3 და 5 mM PPA-ზე. დაშლისა და შერწყმის მოვლენების დამუშავება. (სურ. 2ა). MEL ანალიზის შემდეგ, მიტოქონდრიები დამატებით გაანალიზდა მიტოქონდრიული სტრუქტურების რაოდენობისა და მათი საშუალო მოცულობის რაოდენობრივი განსაზღვრის მიზნით. ჩვენ დავაკვირდით დაშლის მოვლენების რაოდენობის მცირე, მაგრამ მნიშვნელოვან ზრდას 3 mM-ზე [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] და შერწყმის [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] და შერწყმის [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] და შერწყმის [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] მოვლენები მნიშვნელოვნად გაიზარდა 5 mM-ზე საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (სურ. 3ბ). მიტოქონდრიების რაოდენობა მნიშვნელოვნად გაიზარდა როგორც 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)], ასევე 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)]-ზე (სურ. 3გ), მაშინ როდესაც თითოეული მიტოქონდრიული სტრუქტურის საშუალო მოცულობა უცვლელი დარჩა (სურ. 3გ). 3დ). ერთად აღებული, ეს იმაზე მიუთითებს, რომ მიტოქონდრიული დინამიკის რემოდელირება კომპენსატორულ პასუხს წარმოადგენს, რომელიც წარმატებით ინარჩუნებს მიტოქონდრიული ქსელის მთლიანობას. 3 mM PPA-ზე დაშლის მოვლენების რაოდენობის ზრდა იმაზე მიუთითებს, რომ მიტოქონდრიების რაოდენობის ზრდა ნაწილობრივ განპირობებულია მიტოქონდრიული დაშლით, მაგრამ იმის გათვალისწინებით, რომ მიტოქონდრიის საშუალო მოცულობა არსებითად უცვლელი რჩება, ბიოგენეზი, როგორც დამატებითი კომპენსატორული პასუხი, არ შეიძლება გამოირიცხოს. თუმცა, ეს მონაცემები შეესაბამება TEM-ით დაფიქსირებულ უფრო პატარა, მრგვალ მიტოქონდრიულ სტრუქტურებს და ასევე აჩვენებს PPA-თი ინდუცირებულ მიტოქონდრიულ დინამიკაში მნიშვნელოვან ცვლილებებს.
პროპიონის მჟავა (PPA) იწვევს დინამიურ მიტოქონდრიულ რემოდელირებას ქსელის მთლიანობის შესანარჩუნებლად. SH-SY5Y უჯრედები კულტივირებული იქნა, დამუშავდა 3 და 5 mM PPA-თი 24 საათის განმავლობაში და შეღებილი იქნა TMRE-ით და Hoechst 33342-ით, რასაც მოჰყვა MEL ანალიზი. (ა) წარმომადგენლობითი დროის შენელებული მიკროსკოპიის გამოსახულებები, რომლებიც ასახავს ფერს და ბინარულ მაქსიმალური ინტენსივობის პროექციებს მე-2 დროს (t2) თითოეული პირობისთვის. თითოეულ ბინარულ სურათზე მითითებული შერჩეული რეგიონები გაძლიერებულია და ნაჩვენებია 3D-ში სამ სხვადასხვა დროის ჩარჩოში (t1-t3) დროთა განმავლობაში დინამიკის საილუსტრაციოდ; შერწყმის მოვლენები მონიშნულია მწვანე ფერში; დაშლის მოვლენები მონიშნულია მწვანე ფერში. ნაჩვენებია წითლად. (ბ) დინამიური მოვლენების საშუალო რაოდენობა თითოეულ მდგომარეობაში. (გ) მიტოქონდრიული სტრუქტურების საშუალო რაოდენობა უჯრედზე. (დ) თითოეული მიტოქონდრიული სტრუქტურის საშუალო მოცულობა (µm3) უჯრედზე. ნაჩვენები მონაცემები წარმოადგენს n = 15 უჯრედს თითოეულ სამკურნალო ჯგუფში. ნაჩვენები შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± SEM-ს, მასშტაბის ზოლი = 10 μm, * p < 0.05.
პროპიონის მჟავა (PPA) იწვევს მიტოქონდრიულ დინამიკასთან დაკავშირებული გენების ტრანსკრიფციულ დათრგუნვას. SH-SY5Y უჯრედები დამუშავდა 3 და 5 mM PPA-თი 24 საათის განმავლობაში. გენის ფარდობითი რაოდენობრივი განსაზღვრა ჩატარდა RT-qPCR-ის გამოყენებით და ნორმალიზებული იქნა B2M-მდე. მიტოქონდრიული ბიოგენეზის გენები (ა) cMYC, (ბ) TFAM, (გ) NRF1 და (დ) NFE2L2. მიტოქონდრიული შერწყმისა და დაშლის გენები (ე) STOML2, (ვ) OPA1, (ზ) MFN1, (თ) MFN2 და (ი) DRP1. მნიშვნელოვანი განსხვავებები (p < 0.05) შემოწმდა ცალმხრივი ANOVA-ს (კონტროლი vs. მკურნალობა) და დანეტის მრავლობითი შედარების ტესტის გამოყენებით: * მიუთითებს p < 0.05, ** მიუთითებს p < 0.01, ხოლო **** მიუთითებს p < 0.0001. სვეტები წარმოადგენს საშუალო ექსპრესიას ± SEM. ნაჩვენები მონაცემები წარმოადგენს n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) და n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) ბიოლოგიურ რეპლიკატს.
TEM და MEL ანალიზების ერთობლივი მონაცემები მიუთითებს, რომ PPA ცვლის მიტოქონდრიის მორფოლოგიასა და დინამიკას. თუმცა, ეს ვიზუალიზაციის ტექნიკა არ იძლევა ამ პროცესების მამოძრავებელი ძირითადი მექანიზმების შესახებ ინფორმაციის მიღების საშუალებას. ამიტომ, ჩვენ შევისწავლეთ მიტოქონდრიის დინამიკის, ბიოგენეზისა და მიტოზის ცხრა ძირითადი რეგულატორის mRNA ექსპრესია PPA-თი მკურნალობის საპასუხოდ. ჩვენ რაოდენობრივად განვსაზღვრეთ უჯრედული მიელომის ონკოგენი (cMYC), ბირთვული რესპირატორული ფაქტორი (NRF1), მიტოქონდრიული ტრანსკრიფციის ფაქტორი 1 (TFAM), NFE2-ის მსგავსი ტრანსკრიფციის ფაქტორი BZIP (NFE2L2), გასტრინის მსგავსი ცილა 2 (STOML2), მხედველობის ნერვის ატროფია 1 (OPA1), მიტოფუსინი 1 (MFN1), მიტოფუსინი 2 (MFN2) და დინამინის მსგავსი ცილა 1 (DRP1) 3 mM და 5 mM PPA-თი მკურნალობის 24 საათის შემდეგ. ჩვენ დავაკვირდით 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 და p < 0.0001, შესაბამისად) და 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA მკურნალობას. (სურ. 3a–c). mRNA ექსპრესიის შემცირება დოზადამოკიდებული იყო: cMYC, NRF1 და TFAM-ის ექსპრესია შემცირდა შესაბამისად 5.7, 2.6 და 1.9-ჯერ 3 mM-ზე და 11.2, 3 და 2.2-ჯერ 5 mM-ზე. ამის საპირისპიროდ, ცენტრალური რედოქს ბიოგენეზის გენი NFE2L2 არ შეცვლილა PPA-ს არცერთი კონცენტრაციის დროს, თუმცა დაფიქსირდა ექსპრესიის შემცირების მსგავსი დოზადამოკიდებული ტენდენცია (სურ. 3d).
ჩვენ ასევე შევისწავლეთ კლასიკური გენების ექსპრესია, რომლებიც მონაწილეობენ დაშლისა და შერწყმის რეგულირებაში. STOML2, სავარაუდოდ, მონაწილეობს შერწყმაში, მიტოფაგიასა და ბიოგენეზში და მისი ექსპრესია მნიშვნელოვნად შემცირდა (p < 0.0001) 3 mM-ით (2.4-ჯერადი ცვლილება) და 5 mM-ით (2.8-ჯერადი ცვლილება) PPA-თი (სურ. 1). 3d). ანალოგიურად, OPA1 შერწყმის გენის ექსპრესია შემცირდა 3 mM-ით (1.6-ჯერადი ცვლილება) და 5 mM-ით (1.9-ჯერადი ცვლილება) PPA-თი (p = 0.006 და p = 0.0024, შესაბამისად) (სურ. 3f). თუმცა, ჩვენ ვერ აღმოვაჩინეთ მნიშვნელოვანი განსხვავებები შერწყმის გენების MFN1, MFN2 ან დაშლის გენის DRP1 ექსპრესიაში 24-საათიანი PPA სტრესის ქვეშ (სურ. 3g–i). გარდა ამისა, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ოთხი შერწყმისა და დაშლის ცილის (OPA1, MFN1, MFN2 და DRP1) დონეები ერთსა და იმავე პირობებში არ შეცვლილა (სურ. 4ა–დ). მნიშვნელოვანია აღინიშნოს, რომ ეს მონაცემები ასახავს დროის ერთ წერტილს და შესაძლოა არ ასახავდეს ცილის ექსპრესიის ან აქტივობის დონის ცვლილებებს PPA სტრესის ადრეულ ეტაპებზე. თუმცა, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 და OPA1 ექსპრესიის მნიშვნელოვანი შემცირება მიუთითებს მიტოქონდრიული მეტაბოლიზმის, ბიოგენეზისა და დინამიკის მნიშვნელოვან ტრანსკრიფციულ დისრეგულაციაზე. გარდა ამისა, ეს მონაცემები ხაზს უსვამს ვიზუალიზაციის ტექნიკის სარგებლიანობას მიტოქონდრიული ფუნქციის საბოლოო მდგომარეობის ცვლილებების უშუალოდ შესასწავლად.
შერწყმისა და დაშლის ფაქტორის ცილის დონეები პროპიონის მჟავათი (PPA) დამუშავების შემდეგ არ შეცვლილა. SH-SY5Y უჯრედები დამუშავდა 3 და 5 mM PPA-თი 24 საათის განმავლობაში. ცილის დონეები განისაზღვრა Western blot ანალიზით და ექსპრესიის დონეები ნორმალიზებული იყო საერთო ცილის მიმართ. ნაჩვენებია ცილის საშუალო ექსპრესია და სამიზნე და საერთო ცილის წარმომადგენლობითი Western blots. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. სვეტები წარმოადგენს საშუალო ± SEM-ს, ხოლო ნაჩვენები მონაცემები წარმოადგენს n = 3 ბიოლოგიურ რეპლიკატს. მრავალჯერადი შედარებები (p < 0.05) ჩატარდა ვარიაციის ცალმხრივი ანალიზისა და დანეტის ტესტის გამოყენებით. ორიგინალური გელი და ბლოტი ნაჩვენებია ნახაზ S1-ში.
მიტოქონდრიული დისფუნქცია დაკავშირებულია მულტისისტემურ დაავადებებთან, დაწყებული მეტაბოლური, გულ-სისხლძარღვთა და კუნთოვანი დაავადებებით და დამთავრებული ნევროლოგიური დაავადებებით1,10. მრავალი ნეიროდეგენერაციული და ნეიროდეგენერაციული დაავადება დაკავშირებულია მიტოქონდრიულ დისფუნქციასთან, რაც ხაზს უსვამს ამ ორგანელების მნიშვნელობას ტვინის სიცოცხლის მთელი პერიოდის განმავლობაში. ამ დაავადებებს მიეკუთვნება პარკინსონის დაავადება, ალცჰაიმერის დაავადება და ASD3,4,18. თუმცა, ამ დაავადებების შესასწავლად ტვინის ქსოვილზე წვდომა რთულია, განსაკუთრებით მექანისტურ დონეზე, რაც უჯრედულ მოდელის სისტემებს აუცილებელ ალტერნატივად აქცევს. ამ კვლევაში, ჩვენ ვიყენებთ უჯრედულ მოდელის სისტემას, რომელიც იყენებს PPA-თი დამუშავებულ SH-SY5Y უჯრედებს, რათა გავიხსენოთ ნეირონულ დაავადებებში, განსაკუთრებით აუტიზმის სპექტრის აშლილობებში დაფიქსირებული მიტოქონდრიული დისფუნქცია. ამ PPA მოდელის გამოყენება ნეირონებში მიტოქონდრიული დინამიკის შესასწავლად შეიძლება ASD-ის ეტიოლოგიის შესახებ ინფორმაციის მოძიების საშუალება მოგვცეს.
ჩვენ შევისწავლეთ TEM-ის გამოყენების შესაძლებლობა მიტოქონდრიული მორფოლოგიის ცვლილებების დასათვალიერებლად. მნიშვნელოვანია აღინიშნოს, რომ TEM-ის გამოყენება სწორად უნდა მოხდეს მისი ეფექტურობის მაქსიმიზაციისთვის. კრიო-ნიმუშების მომზადება საშუალებას იძლევა ნეირონული სტრუქტურების უკეთ შენარჩუნების უჯრედული კომპონენტების ერთდროულად დაფიქსირებით და არტეფაქტების წარმოქმნის შემცირებით34. ამასთან შესაბამისობაში, ჩვენ დავაკვირდით, რომ ნეირონის მსგავს SH-SY5Y უჯრედებს ჰქონდათ ხელუხლებელი სუბუჯრედოვანი ორგანელები და წაგრძელებული მიტოქონდრიები (სურ. 1ა). ეს ხაზს უსვამს კრიოგენული მომზადების ტექნიკის სარგებლიანობას ნეირონული უჯრედების მოდელებში მიტოქონდრიული მორფოლოგიის შესასწავლად. მიუხედავად იმისა, რომ რაოდენობრივი გაზომვები კრიტიკულია TEM მონაცემების ობიექტური ანალიზისთვის, ჯერ კიდევ არ არსებობს კონსენსუსი იმის შესახებ, თუ რა კონკრეტული პარამეტრები უნდა გაიზომოს მიტოქონდრიული მორფოლოგიური ცვლილებების დასადასტურებლად. მიტოქონდრიული მორფოლოგიის რაოდენობრივად შესწავლილი დიდი რაოდენობით კვლევების საფუძველზე17,31,32, ჩვენ შევიმუშავეთ მიტოქონდრიული გამოსახულების ანალიზის ავტომატური სისტემა, რომელიც ზომავს რვა მორფოლოგიურ პარამეტრს, კერძოდ: ფართობი, ფართობი2, ასპექტის თანაფარდობა, პერიმეტრი, წრიულობა, ხარისხი, ფერეტის დიამეტრი და სიმრგვალე.
მათ შორის, PPA-მ მნიშვნელოვნად შეამცირა ფართობი 2, ფართობი, პერიმეტრი და ფერეტის დიამეტრი (სურ. 1ბ-ე). ამან აჩვენა, რომ მიტოქონდრიები უფრო პატარა და მომრგვალებული გახდა, რაც შეესაბამება წინა კვლევებს, რომლებიც აჩვენებდნენ მიტოქონდრიის ფართობის შემცირებას PPA30-ით გამოწვეული მიტოქონდრიული სტრესის 72 საათის შემდეგ. ეს მორფოლოგიური მახასიათებლები შეიძლება მიუთითებდეს მიტოქონდრიულ დაშლაზე, რაც აუცილებელი პროცესია მიტოქონდრიული ქსელიდან დაზიანებული კომპონენტების გამოყოფისთვის, რათა ხელი შეუწყოს მათ დეგრადაციას მიტოფაგიის გზით35,36,37. მეორეს მხრივ, მიტოქონდრიის საშუალო ზომის შემცირება შეიძლება დაკავშირებული იყოს ბიოგენეზის ზრდასთან, რაც იწვევს მცირე ზომის ახლადშექმნილი მიტოქონდრიების ფორმირებას. დაშლის ან ბიოგენეზის გაზრდა წარმოადგენს კომპენსატორულ პასუხს მიტოქონდრიული სტრესის წინააღმდეგ მიტოზის შესანარჩუნებლად. თუმცა, არ შეიძლება გამოირიცხოს მიტოქონდრიის ზრდის შემცირება, შერწყმის დარღვევა ან სხვა პირობები.
მიუხედავად იმისა, რომ TEM-ით შექმნილი მაღალი გარჩევადობის სურათები საშუალებას იძლევა განისაზღვროს მორფოლოგიური მახასიათებლები ინდივიდუალური მიტოქონდრიების დონეზე, ეს მეთოდი იძლევა ორგანზომილებიან სურათებს დროის ერთ მომენტში. მეტაბოლურ სტრესზე დინამიური რეაქციების შესასწავლად, ჩვენ შევღებეთ მიტოქონდრიები TMRE-ით და გამოვიყენეთ დროის შენელების მიკროსკოპია MEL ანალიზით, რაც საშუალებას იძლევა მიტოქონდრიულ ქსელში ცვლილებების მაღალი გამტარუნარიანობის 3D ვიზუალიზაციისა დროთა განმავლობაში33,38. ჩვენ დავაკვირდით მიტოქონდრიულ დინამიკის დახვეწილ, მაგრამ მნიშვნელოვან ცვლილებებს PPA სტრესის ქვეშ (სურ. 2). 3 mM-ზე, დაშლის მოვლენების რაოდენობა მნიშვნელოვნად გაიზარდა, ხოლო შერწყმის მოვლენები იგივე დარჩა, რაც საკონტროლო ჯგუფში. როგორც დაშლის, ასევე შერწყმის მოვლენების რაოდენობის ზრდა დაფიქსირდა 5 mM PPA-ზე, მაგრამ ეს ცვლილებები დაახლოებით პროპორციული იყო, რაც მიუთითებს, რომ დაშლისა და შერწყმის კინეტიკა წონასწორობას აღწევს უფრო მაღალი კონცენტრაციების დროს (სურ. 2ბ). მიტოქონდრიის საშუალო მოცულობა უცვლელი დარჩა როგორც 3, ასევე 5 mM PPA-ზე, რაც მიუთითებს, რომ მიტოქონდრიული ქსელის მთლიანობა შენარჩუნებულია (სურ. 2დ). ეს ასახავს დინამიური მიტოქონდრიული ქსელების უნარს, უპასუხონ მსუბუქ მეტაბოლურ სტრესს და ეფექტურად შეინარჩუნონ ჰომეოსტაზი ქსელის ფრაგმენტაციის გამოწვევის გარეშე. 3 mM PPA-ზე, დაშლის ზრდა საკმარისია ახალ წონასწორობაზე გადასვლის ხელშესაწყობად, მაგრამ PPA-ს უფრო მაღალი კონცენტრაციით გამოწვეული სტრესის საპასუხოდ საჭიროა უფრო ღრმა კინეტიკური რემოდელირება.
მიტოქონდრიების რაოდენობა გაიზარდა PPA სტრესის ორივე კონცენტრაციის დროს, მაგრამ მიტოქონდრიის საშუალო მოცულობა მნიშვნელოვნად არ შეცვლილა (სურ. 2გ). ეს შეიძლება გამოწვეული იყოს ბიოგენეზის ზრდით ან დაყოფის ზრდით; თუმცა, მიტოქონდრიის საშუალო მოცულობის მნიშვნელოვანი შემცირების არარსებობის შემთხვევაში, უფრო სავარაუდოა, რომ ბიოსინთეზი იზრდება. თუმცა, ნახაზ 2-ში მოცემული მონაცემები ადასტურებს ორი კომპენსატორული მექანიზმის არსებობას: დაშლის მოვლენების რაოდენობის ზრდა, რაც შეესაბამება მიტოქონდრიის დაშლის აქტივაციის ზრდას, და მოვლენების რაოდენობის ზრდა, რაც შეესაბამება მიტოქონდრიის ბიოგენეზს. საბოლოო ჯამში, მსუბუქი სტრესის დინამიური კომპენსაცია შეიძლება შედგებოდეს ერთდროული პროცესებისგან, რომლებიც მოიცავს დაშლას, შერწყმას, ბიოგენეზს და მიტოფაგიას. მიუხედავად იმისა, რომ წინა ავტორებმა აჩვენეს, რომ PPA აძლიერებს მიტოზს30,39 და მიტოფაგიას29, ჩვენ წარმოგიდგენთ მტკიცებულებებს მიტოქონდრიის დაშლისა და შერწყმის დინამიკის რემოდელირების შესახებ PPA-ს საპასუხოდ. ეს მონაცემები ადასტურებს TEM-ით დაფიქსირებულ მორფოლოგიურ ცვლილებებს და იძლევა დამატებით წარმოდგენას PPA-თი გამოწვეული მიტოქონდრიული დისფუნქციის მექანიზმების შესახებ.
რადგან არც TEM-ის და არც MEL ანალიზმა არ მოგვცა პირდაპირი მტკიცებულება დაკვირვებული მორფოლოგიური ცვლილებების საფუძვლად მყოფი გენის მარეგულირებელი მექანიზმების შესახებ, ჩვენ შევისწავლეთ მიტოქონდრიულ მეტაბოლიზმში, ბიოგენეზსა და დინამიკაში ჩართული გენების რნმ-ექსპრესია. cMYC პროტოონკოგენი არის ტრანსკრიფციის ფაქტორი, რომელიც მონაწილეობს მიტოქონდრიების, გლიკოლიზის, ამინომჟავების და ცხიმოვანი მჟავების მეტაბოლიზმის რეგულირებაში40. გარდა ამისა, ცნობილია, რომ cMYC არეგულირებს მიტოქონდრიულ ტრანსკრიფციაში, ტრანსლაციასა და კომპლექსების აწყობაში ჩართული თითქმის 600 მიტოქონდრიული გენის ექსპრესიას, მათ შორის NRF1-სა და TFAM41-ს. NRF1 და TFAM მიტოზის ორი ცენტრალური რეგულატორია, რომლებიც მოქმედებენ PGC-1α-ს ქვემოთ, რათა გაააქტიურონ mtDNA-ს რეპლიკაცია. ეს გზა აქტიურდება cAMP-სა და AMPK სიგნალიზაციით და მგრძნობიარეა ენერგიის ხარჯვისა და მეტაბოლური სტრესის მიმართ. ჩვენ ასევე შევისწავლეთ NFE2L2, მიტოქონდრიული ბიოგენეზის რედოქს რეგულატორი, იმის დასადგენად, შეიძლება თუ არა PPA-ს ეფექტები განპირობებული იყოს ოქსიდაციური სტრესით.
მიუხედავად იმისა, რომ NFE2L2 ექსპრესია უცვლელი დარჩა, ჩვენ აღმოვაჩინეთ cMYC, NRF1 და TFAM ექსპრესიის დოზადამოკიდებული შემცირება 3 mM და 5 mM PPA-თი 24-საათიანი მკურნალობის შემდეგ (სურ. 3a–c). cMYC ექსპრესიის დაქვეითების შესახებ ადრეც იყო ინფორმაცია, როგორც მიტოქონდრიული სტრესის საპასუხო რეაქცია42, და პირიქით, cMYC ექსპრესიის დაქვეითების შემთხვევაში შესაძლებელია მიტოქონდრიული დისფუნქციის გამოწვევა მიტოქონდრიული მეტაბოლიზმის, ქსელური კავშირის და მემბრანული პოლარიზაციის რემოდელირებით43. საინტერესოა, რომ cMYC ასევე მონაწილეობს მიტოქონდრიული დაშლისა და შერწყმის რეგულაციაში42,43 და ცნობილია, რომ ზრდის DRP1 ფოსფორილირებას და მიტოქონდრიულ ლოკალიზაციას უჯრედების დაყოფის დროს44, ასევე ნეირონულ ღეროვან უჯრედებში მიტოქონდრიულ მორფოლოგიურ რემოდელირებას45. მართლაც, cMYC-დეფიციტური ფიბრობლასტები ავლენენ მიტოქონდრიის შემცირებულ ზომას, რაც შეესაბამება PPA43 სტრესით გამოწვეულ ცვლილებებს. ეს მონაცემები ასახავს საინტერესო, მაგრამ ჯერ კიდევ გაურკვეველ კავშირს cMYC-სა და მიტოქონდრიულ დინამიკას შორის, რაც საინტერესო სამიზნეს წარმოადგენს PPA სტრესით გამოწვეული რემოდელირების მომავალი კვლევებისთვის.
NRF1-ისა და TFAM-ის შემცირება შეესაბამება cMYC-ის, როგორც მნიშვნელოვანი ტრანსკრიფციული აქტივატორის როლს. ეს მონაცემები ასევე შეესაბამება ადამიანის მსხვილი ნაწლავის კიბოს უჯრედებზე ჩატარებულ წინა კვლევებს, რომლებიც აჩვენებს, რომ PPA ამცირებს NRF1 mRNA-ს ექსპრესიას 22 საათში, რაც ასოცირდება ATP-ის გამოფიტვასთან და ROS46-ის ზრდასთან. ამ ავტორებმა ასევე აღნიშნეს, რომ TFAM-ის ექსპრესია იზრდება 8.5 საათში, მაგრამ 22 საათში საწყის დონეს უბრუნდება. ამის საპირისპიროდ, კიმმა და სხვ. (2019) აჩვენეს, რომ TFAM mRNA-ს ექსპრესია მნიშვნელოვნად შემცირდა SH-SY5Y უჯრედებში PPA სტრესის 4 საათის შემდეგ; თუმცა, 72 საათის შემდეგ, TFAM ცილის ექსპრესია მნიშვნელოვნად გაიზარდა და mtDNA-ს ასლების რაოდენობა მნიშვნელოვნად გაიზარდა. ამრიგად, მიტოქონდრიული ბიოგენეზის გენების რაოდენობის შემცირება, რომელიც ჩვენ 24 საათის შემდეგ დავაკვირდით, არ გამორიცხავს იმ შესაძლებლობას, რომ მიტოქონდრიების რაოდენობის ზრდა დაკავშირებულია ბიოგენეზის აქტივაციასთან უფრო ადრეულ დროს. წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ PPA მნიშვნელოვნად ამაღლებს PGC-1α mRNA-ს და ცილას SH-SY5Y უჯრედებში 4 საათსა და 30 წუთში, მაშინ როდესაც პროპიონის მჟავა აძლიერებს მიტოქონდრიულ ბიოგენეზს ხბოს ჰეპატოციტებში PGC-1α-ს მეშვეობით 12 საათსა და 39 წუთში. საინტერესოა, რომ PGC-1α არა მხოლოდ NRF1-ისა და TFAM-ის პირდაპირი ტრანსკრიფციული რეგულატორია, არამედ ასევე არეგულირებს MFN2-ისა და DRP1-ის აქტივობას დაშლისა და შერწყმის რეგულირებით47. ერთად აღებული, ეს ხაზს უსვამს PPA-ს მიერ გამოწვეული მიტოქონდრიული კომპენსატორული რეაქციების მარეგულირებელი მექანიზმების მჭიდრო კავშირს. უფრო მეტიც, ჩვენი მონაცემები ასახავს ბიოგენეზისა და მეტაბოლიზმის ტრანსკრიფციული რეგულირების მნიშვნელოვან დისრეგულაციას PPA სტრესის ქვეშ.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 და DRP1 გენები მიტოქონდრიის დაშლის, შერწყმისა და დინამიკის ცენტრალურ რეგულატორებს შორისაა37,48,49. მიტოქონდრიულ დინამიკაში მრავალი სხვა გენი მონაწილეობს, თუმცა, ადრე აღმოჩნდა, რომ STOML2, OPA1 და MFN2 დიფერენცირებულად მეთილირდება ASD კოჰორტებში,16 და რამდენიმე დამოუკიდებელმა კვლევამ აჩვენა ამ ტრანსკრიფციის ფაქტორების ცვლილებები მიტოქონდრიული სტრესის საპასუხოდ50,51. 52. როგორც OPA1-ის, ასევე STOML2-ის ექსპრესია მნიშვნელოვნად შემცირდა 3 mM და 5 mM PPA დამუშავებით (სურ. 3e, f). OPA1 არის მიტოქონდრიული შერწყმის ერთ-ერთი კლასიკური რეგულატორი MFN1-თან და 2-თან პირდაპირი ურთიერთქმედების გზით და მნიშვნელოვან როლს ასრულებს კრისტაების რემოდელირებასა და მიტოქონდრიულ მორფოლოგიაში53. STOML2-ის ზუსტი როლი მიტოქონდრიულ დინამიკაში გაურკვეველი რჩება, მაგრამ მტკიცებულებები მიუთითებს, რომ ის მნიშვნელოვან როლს ასრულებს მიტოქონდრიულ შერწყმაში, ბიოგენეზსა და მიტოფაგიაში.
STOML2 მონაწილეობს მიტოქონდრიული რესპირატორული შეერთების შენარჩუნებასა და რესპირატორული ჯაჭვის კომპლექსების ფორმირებაში54,55 და ნაჩვენებია, რომ ის მნიშვნელოვნად ცვლის კიბოს უჯრედების მეტაბოლურ მახასიათებლებს56. კვლევებმა აჩვენა, რომ STOML2 ხელს უწყობს მიტოქონდრიული მემბრანული პოტენციალის და ბიოგენეზის განვითარებას BAN-თან და კარდიოლიპინთან ურთიერთქმედების გზით55, 57, 58. გარდა ამისა, დამოუკიდებელმა კვლევებმა აჩვენა, რომ STOML2-სა და PINK1-ს შორის ურთიერთქმედება არეგულირებს მიტოფაგიას59,60. აღსანიშნავია, რომ STOML2, როგორც აღინიშნა, პირდაპირ ურთიერთქმედებს MFN2-თან და ასტაბილურებს მას და ასევე მნიშვნელოვან როლს ასრულებს გრძელი OPA1 იზოფორმების სტაბილიზაციაში OPA1 დეგრადაციაზე პასუხისმგებელი პროტეაზას ინჰიბირებით53,61,62. PPA რეაქციებში დაფიქსირებულმა STOML2 ექსპრესიის შემცირებამ შესაძლოა ეს შერწყმის ცილები უფრო მგრძნობიარე გახადოს დეგრადაციის მიმართ უბიქვიტინ- და პროტეაზომ-დამოკიდებული გზებით48. მიუხედავად იმისა, რომ STOML2-ისა და OPA1-ის ზუსტი როლი PPA-ზე დინამიურ რეაქციაში გაურკვეველია, ამ შერწყმის გენების ექსპრესიის შემცირებამ (სურათი 3) შესაძლოა დაარღვიოს ბალანსი დაშლასა და შერწყმას შორის და გამოიწვიოს მიტოქონდრიის ზომის შემცირება (სურათი 3). 1).
მეორე მხრივ, OPA1 ცილის ექსპრესია 24 საათის შემდეგ უცვლელი დარჩა, ხოლო MFN1, MFN2 ან DRP1-ის mRNA და ცილის დონეები მნიშვნელოვნად არ შეცვლილა PPA-თი დამუშავების შემდეგ (სურ. 3g-i, სურ. 4). ეს შეიძლება მიუთითებდეს, რომ მიტოქონდრიულ შერწყმასა და დაშლაში ჩართული ამ ფაქტორების რეგულაციაში ცვლილებები არ შეინიშნება. თუმცა, აღსანიშნავია, რომ ამ ოთხი გენიდან თითოეული ასევე რეგულირდება პოსტტრანსკრიფციული მოდიფიკაციებით (PTMs), რომლებიც აკონტროლებენ ცილის აქტივობას. OPA1-ს აქვს რვა ალტერნატიული სპლაისინგის ვარიანტი, რომლებიც პროტეოლიზურად იშლება მიტოქონდრიებში ორი განსხვავებული იზოფორმის წარმოსაქმნელად 63. გრძელ და მოკლე იზოფორმებს შორის ბალანსი საბოლოოდ განსაზღვრავს OPA1-ის როლს მიტოქონდრიულ შერწყმასა და მიტოქონდრიული ქსელის შენარჩუნებაში 64. DRP1 აქტივობა რეგულირდება კალციუმ/კალმოდულინდამოკიდებული ცილოვანი კინაზა II (CaMKII) ფოსფორილირებით, ხოლო DRP1 დეგრადაცია რეგულირდება უბიკვიტინაციით და SUMOილირებით 65. და ბოლოს, როგორც DRP1, ასევე MFN1/2 არის GTPაზები, ამიტომ აქტივობაზე შესაძლოა გავლენა იქონიოს მიტოქონდრიაში GTP-ის წარმოების სიჩქარემ 66. ამიტომ, მიუხედავად იმისა, რომ ამ ცილების ექსპრესია მუდმივი რჩება, ეს შეიძლება არ ასახავდეს ცილის უცვლელ აქტივობას ან ლოკალიზაციას 67,68. მართლაც, არსებული PTM ცილის რეპერტუარები ხშირად წარმოადგენს თავდაცვის პირველ ხაზს, რომელიც პასუხისმგებელია მწვავე სტრესული რეაქციების შუამავლობაზე. ჩვენს მოდელში ზომიერი მეტაბოლური სტრესის არსებობისას, სავარაუდოა, რომ PTM ხელს უწყობს შერწყმისა და დაშლის ცილების აქტივობის ზრდას მიტოქონდრიული მთლიანობის საკმარისად აღსადგენად, ამ გენების დამატებითი აქტივაციის საჭიროების გარეშე mRNA-ზე ან ცილის დონეზე.
ზემოაღნიშნული მონაცემები ერთად აღებული ხაზს უსვამს მიტოქონდრიული მორფოლოგიის რთულ და დროზე დამოკიდებულ რეგულირებას და ამ მექანიზმების გარკვევის სირთულეებს. გენის ექსპრესიის შესასწავლად, პირველ რიგში, აუცილებელია გენის გზაში კონკრეტული სამიზნე გენების იდენტიფიცირება. თუმცა, ჩვენი მონაცემები აჩვენებს, რომ ერთი და იგივე გზაში მყოფი გენები ერთნაირად არ რეაგირებენ ერთსა და იმავე სტრესზე. სინამდვილეში, წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ ერთი და იგივე გზაში მყოფმა სხვადასხვა გენებმა შეიძლება აჩვენონ განსხვავებული დროითი რეაქციის პროფილები30,46. გარდა ამისა, არსებობს რთული პოსტტრანსკრიფციული მექანიზმები, რომლებიც არღვევენ ტრანსკრიფციასა და გენის ფუნქციას შორის ურთიერთობას. პროტეომიკურ კვლევებს შეუძლიათ PTM-ებისა და ცილის ფუნქციის გავლენის შესახებ ინფორმაციის მოწოდება, მაგრამ ისინი ასევე წარმოადგენენ გამოწვევებს, მათ შორის დაბალი გამტარუნარიანობის მეთოდებს, სიგნალ-ხმაურის მაღალ თანაფარდობას და დაბალ გარჩევადობას.
ამ კონტექსტში, მიტოქონდრიული მორფოლოგიის შესწავლას TEM-ისა და MEL-ის გამოყენებით დიდი პოტენციალი აქვს, რათა უპასუხოს ფუნდამენტურ კითხვებს მიტოქონდრიულ დინამიკასა და ფუნქციას შორის ურთიერთობის შესახებ და თუ როგორ მოქმედებს ეს დაავადებაზე. რაც მთავარია, TEM უზრუნველყოფს პირდაპირ მეთოდს მიტოქონდრიული მორფოლოგიის გასაზომად, როგორც მიტოქონდრიული დისფუნქციისა და დინამიკის კონვერგენტული საბოლოო წერტილისა51. MEL ასევე უზრუნველყოფს პირდაპირ მეთოდს დაშლისა და შერწყმის მოვლენების სამგანზომილებიან უჯრედულ გარემოში ვიზუალიზაციისთვის, რაც საშუალებას იძლევა დინამიური მიტოქონდრიული რემოდელირების რაოდენობრივი განსაზღვრისა გენის ექსპრესიის ცვლილებების არარსებობის შემთხვევაშიც კი33. აქ ჩვენ ხაზს ვუსვამთ მიტოქონდრიული ვიზუალიზაციის ტექნიკის სარგებლიანობას მეორადი მიტოქონდრიული დაავადებების დროს. ეს დაავადებები, როგორც წესი, ხასიათდება ქრონიკული მსუბუქი მეტაბოლური სტრესით, რომელიც ხასიათდება მიტოქონდრიული ქსელების დახვეწილი რემოდელირებით და არა მწვავე მიტოქონდრიული დაზიანებით. თუმცა, ქრონიკული სტრესის ქვეშ მიტოზის შესანარჩუნებლად საჭირო მიტოქონდრიულ კომპენსაციას აქვს ღრმა ფუნქციური შედეგები. ნეირომეცნიერების კონტექსტში, ამ კომპენსატორული მექანიზმების უკეთ გაგებამ შეიძლება მოგვაწოდოს მნიშვნელოვანი ინფორმაცია მიტოქონდრიულ დისფუნქციასთან დაკავშირებული პლეიოტროპული ნეიროპათოლოგიის შესახებ.
საბოლოო ჯამში, ჩვენი მონაცემები ხაზს უსვამს ვიზუალიზაციის ტექნიკის სარგებლიანობას გენის ექსპრესიას, ცილის მოდიფიკაციებსა და ნეირონული მიტოქონდრიული დინამიკის მაკონტროლებელ ცილის აქტივობას შორის კომპლექსური ურთიერთქმედების ფუნქციური შედეგების გასაგებად. ჩვენ გამოვიყენეთ PPA მიტოქონდრიული დისფუნქციის მოდელირებისთვის ნეირონული უჯრედის მოდელში, რათა გაგვეგო ASD-ის მიტოქონდრიული კომპონენტის შესახებ. PPA-თი დამუშავებულმა SH-SY5Y უჯრედებმა აჩვენეს მიტოქონდრიული მორფოლოგიის ცვლილებები: მიტოქონდრიები გახდა პატარა და მრგვალი, ხოლო კრისტები ცუდად იყო განსაზღვრული TEM-ით დაკვირვებისას. MEL ანალიზი აჩვენებს, რომ ეს ცვლილებები ხდება დაშლისა და შერწყმის მოვლენების ზრდასთან ერთად, რათა შენარჩუნდეს მიტოქონდრიული ქსელი მსუბუქი მეტაბოლური სტრესის საპასუხოდ. გარდა ამისა, PPA მნიშვნელოვნად არღვევს მიტოქონდრიული მეტაბოლიზმისა და ჰომეოსტაზის ტრანსკრიფციულ რეგულირებას. ჩვენ გამოვავლინეთ cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 და OPA1, როგორც ძირითადი მიტოქონდრიული რეგულატორები, რომლებიც დარღვეულია PPA სტრესით და შეიძლება თამაშობდნენ როლს მიტოქონდრიული მორფოლოგიისა და ფუნქციის PPA-ით გამოწვეული ცვლილებების შუამავლობაში. საჭიროა მომავალი კვლევები, რათა უკეთ დახასიათდეს PPA-ით გამოწვეული გენის ექსპრესიისა და ცილის აქტივობის, ლოკალიზაციისა და ტრანსლაციური მოდიფიკაციების დროებითი ცვლილებები. ჩვენი მონაცემები ხაზს უსვამს მიტოქონდრიული სტრესული რეაქციის შუამავლობის მარეგულირებელი მექანიზმების სირთულესა და ურთიერთდამოკიდებულებას და აჩვენებს TEM-ის და სხვა ვიზუალიზაციის ტექნიკის სარგებლიანობას უფრო მიზანმიმართული მექანიკური კვლევებისთვის.
SH-SY5Y უჯრედული ხაზი (ECACC, 94030304-1VL) შეძენილი იქნა Sigma-Aldrich-ისგან. SH-SY5Y უჯრედები გაიზარდა Dulbecco-ს მოდიფიცირებულ Eagle-ის გარემოში/F-12 საკვები ნივთიერებების ნარევში (DMEM/F-12) და L-გლუტამინში (SC09411, ScienCell) 25 სმ2 კოლბებში, რომლებიც დამატებული იყო 20%-იანი ნაყოფის ძროხის შრატით (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) და 1%-იანი პენიცილინ-სტრეპტომიცინით (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) 37°C ტემპერატურაზე, 5% CO2-ით. უჯრედები სუბკულტივირებული იქნა 80%-იან შეერთებამდე 0.05% ტრიპსინ-EDTA-ს (15400054, ThermoFisher Scientific) გამოყენებით, დაცენტრიფუგირებული იქნა 300 გ-ზე და დაფქული იქნა დაახლოებით 7 × 105 უჯრედი/მლ სიმკვრივით. ყველა ექსპერიმენტი ჩატარდა არადიფერენცირებულ SH-SY5Y უჯრედებზე 19–22 პასაჟებს შორის. PPA შეჰყავთ NaP-ის სახით. NaP ფხვნილი (CAS No. 137-40-6, ქიმიური ფორმულა C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) გახსენით თბილ MilliQ წყალში 1 M კონცენტრაციამდე და შეინახეთ 4°C ტემპერატურაზე. დამუშავების დღეს, ეს ხსნარი გააზავეთ 1 M PPA-თი 3 mM და 5 mM PPA-მდე შრატისგან თავისუფალ გარემოში (DMEM/F-12 L-გლუტამინით). ყველა ექსპერიმენტის დამუშავების კონცენტრაციები იყო PPA-ს გარეშე (0 mM, კონტროლი), 3 mM და 5 mM PPA. ექსპერიმენტები ჩატარდა მინიმუმ სამ ბიოლოგიურ რეპლიკატში.
SH-SY5Y უჯრედები დაითესა 25 სმ5 ზომის კოლბებში 5.5 × 105 უჯრედი/მლ სიჩქარით და გაიზარდა 24 საათის განმავლობაში. PPA დამუშავება კოლბაში დაემატა 24 საათიანი ინკუბაციის წინ. უჯრედების გრანულები შეგროვდა ძუძუმწოვრების ქსოვილის სუბკულტურის ნორმალური პროტოკოლების მიხედვით (აღწერილი ზემოთ). უჯრედების გრანულა ხელახლა სუსპენზირდა 100 მკლ 2.5%-იან გლუტარალდეჰიდში, 1× PBS-ში და შეინახეთ 4°C ტემპერატურაზე დამუშავებამდე. SH-SY5Y უჯრედები ხანმოკლედ დაცენტრიფუგდა უჯრედების დასაგროვებლად და 2.5% გლუტარალდეჰიდის, 1× PBS-ის ხსნარის მოსაშორებლად. ნალექი ხელახლა სუსპენზირდა გამოხდილ წყალში მომზადებულ 4%-იან აგაროზის გელში (აგაროზისა და ნალექის მოცულობის თანაფარდობაა 1:1). აგაროზის ნაჭრები მოათავსეს ბადეებზე ბრტყელ ფირფიტებზე და დაფარული იყო 1-ჰექსადეცენით მაღალი წნევის გაყინვამდე. ნიმუშები გაიყინა 100%-იან მშრალ აცეტონში -90°C ტემპერატურაზე 24 საათის განმავლობაში. შემდეგ ტემპერატურა -80°C-მდე აწიეს და დაემატა 1%-იანი ოსმიუმის ტეტროქსიდისა და 0.1%-იანი გლუტარალდეჰიდის ხსნარი. ნიმუშები ინახებოდა -80°C-ზე 24 საათის განმავლობაში. ამის შემდეგ, ტემპერატურა თანდათან იზრდებოდა ოთახის ტემპერატურამდე რამდენიმე დღის განმავლობაში: -80°C-დან -50°C-მდე 24 საათის განმავლობაში, -30°C-მდე 24 საათის განმავლობაში, -10°C-მდე 24 საათის განმავლობაში და ბოლოს ოთახის ტემპერატურამდე.
კრიოგენული მომზადების შემდეგ, ნიმუშები გაჟღენთილი იყო ფისით და ულტრათხელი მონაკვეთები (∼100 ნმ) დამზადდა Leica Reichert UltracutS ულტრამიკროტომის (Leica Microsystems) გამოყენებით. მონაკვეთები შეღებილი იყო 2%-იანი ურანილის აცეტატით და ტყვიის ციტრატით. ნიმუშები დაკვირვებული იქნა FEI Tecnai 20 გამტარი ელექტრონული მიკროსკოპის (ThermoFisher (ყოფილი FEI), ეინდჰოვენი, ნიდერლანდები) გამოყენებით, რომელიც მუშაობდა 200 კვ-ზე (Lab6 გადამცემი) და Gatan CCD კამერის (Gatan, დიდი ბრიტანეთი) გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო Tridiem ენერგიის ფილტრით.
თითოეულ ტექნიკურ რეპლიკაში მიღებული იქნა სულ მცირე 24 ერთუჯრედიანი გამოსახულება, სულ 266 გამოსახულება. ყველა გამოსახულება გაანალიზდა ინტერესის რეგიონის (ROI) მაკროსა და მიტოქონდრიის მაკროს გამოყენებით. მიტოქონდრიული მაკრო დაფუძნებულია გამოქვეყნებულ მეთოდებზე17,31,32 და საშუალებას იძლევა TEM სურათების ნახევრად ავტომატიზირებული პარტიული დამუშავების ფიჯის/ImageJ69 ენაზე. მოკლედ: გამოსახულება ინვერსირებული და ინვერსირებულია მოძრავი ბურთის ფონის გამოკლების (60 პიქსელის რადიუსი) და FFT ზოლის გამტარობის ფილტრის (შესაბამისად 60 და 8 პიქსელის ზედა და ქვედა საზღვრების გამოყენებით) და ვერტიკალური ხაზის დათრგუნვის გამოყენებით 5% ორიენტაციის ტოლერანტობით. დამუშავებული გამოსახულება ავტომატურად ზღურბლდება მაქსიმალური ენტროპიის ალგორითმის გამოყენებით და გენერირდება ორობითი ნიღაბი. ნედლ TEM სურათებში ხელით შერჩეულ ROI-ებთან დაკავშირებული გამოსახულების რეგიონები ამოღებული იქნა მიტოქონდრიების დასახასიათებლად და პლაზმური მემბრანისა და სხვა მაღალი კონტრასტის რეგიონების გამოკლებით. თითოეული ამოღებული ROI-სთვის გაანალიზდა 600 პიქსელზე მეტი ზომის ბინარული ნაწილაკები და ნაწილაკების ფართობი, პერიმეტრი, მთავარი და მცირე ღერძები, ფერეტის დიამეტრი, სიმრგვალე და წრიული სისქე გაიზომა Fiji/ImageJ-ის ჩაშენებული საზომი ფუნქციების გამოყენებით. Merrill, Flippo და Strack (2017)-ის მიხედვით, ამ მონაცემებიდან გამოითვალა ფართობი 2, ნაწილაკების ასპექტის თანაფარდობა (ძირითადი და მცირე ღერძის თანაფარდობა) და ფორმის კოეფიციენტი (FF), სადაც FF = პერიმეტრი 2/4pi x ფართობი. პარამეტრული ფორმულის განმარტება შეგიძლიათ იხილოთ Merrill, Flippo და Strack (2017)-ში. ნახსენები მაკროები ხელმისაწვდომია GitHub-ზე (იხილეთ მონაცემთა ხელმისაწვდომობის განცხადება). საშუალოდ, PPA დამუშავების თითოეული მეთოდით გაანალიზდა დაახლოებით 5,600 ნაწილაკი, სულ დაახლოებით 17,000 ნაწილაკი (მონაცემები არ არის ნაჩვენები).
SH-SH5Y უჯრედები მოთავსდა 8-კამერიან კულტურულ ჭურჭელში (ThermoFisher, #155411) ადჰეზიის უზრუნველსაყოფად მთელი ღამით და შემდეგ ინკუბირებული იქნა TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) და Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) შეღებვით. სურათები მიღებული იქნა 405 ნმ და 561 ნმ ლაზერების გამოყენებით 10 წუთიანი გარემოს განმავლობაში, ხოლო ნედლი სურათები მიღებული იქნა z-დასტების სახით, რომლებიც შეიცავდა 10 გამოსახულების მიკროგრაფს 0.2 μm az ნაბიჯით გამოსახულების კადრებს შორის 12 თანმიმდევრულ დროის წერტილში. სურათები შეგროვდა Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 სუპერ-გარჩევადობის პლატფორმის (Carl Zeiss, Oberkochen, გერმანია) გამოყენებით LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 ლინზის გამოყენებით. სურათები გაანალიზდა ImageJ-ში ადრე აღწერილი მილსადენისა და ImageJ დანამატის გამოყენებით, რათა გაზომილიყო შერწყმისა და დაშლის მოვლენები, მიტოქონდრიული სტრუქტურების საშუალო რაოდენობა და უჯრედზე მიტოქონდრიის საშუალო მოცულობა33. MEL მაკროები ხელმისაწვდომია GitHub-ზე (იხილეთ მონაცემთა ხელმისაწვდომობის განცხადება).
SH-SY5Y უჯრედები გაიზარდა ექვსჭედიან ფირფიტებში 0.3 × 106 უჯრედი/მლ სიმკვრივით დამუშავებამდე 24 საათის განმავლობაში. რნმ ექსტრაქცია განხორციელდა Quick-RNA™ Miniprep პროტოკოლის (ZR R1055, Zymo Research) გამოყენებით მცირედი ცვლილებებით: ამოღებამდე თითოეულ ჭაში დაამატეთ 300 μl რნმ ლიზისის ბუფერი და საბოლოო ეტაპზე თითოეული ნიმუში ლიზირდება 30 μl DNase/RNase ელუირების გარეშე წყლით. ყველა ნიმუში შემოწმდა რაოდენობისა და ხარისხის მიხედვით NanoDrop ND-1000 UV-Vis სპექტროფოტომეტრის გამოყენებით. უჯრედული ლიზატებიდან მიღებული ცილის საერთო რაოდენობა მიღებული იქნა 200 μl RIPA ლიზისის ბუფერის გამოყენებით, ხოლო ცილის კონცენტრაცია განისაზღვრა ბრედფორდის ცილის ანალიზის გამოყენებით70.
cDNA სინთეზი ჩატარდა Tetro™ cDNA სინთეზის ნაკრების (BIO-65043, Meridian Bioscience) გამოყენებით, მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად, გარკვეული ცვლილებებით. cDNA სინთეზირებული იქნა 20 μl რეაქციებში, 0.7-დან 1 μg-მდე რნმ-ის გამოყენებით. პრაიმერები შეირჩა ადრე გამოქვეყნებული ნაშრომებიდან 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (ცხრილი S1) და თანმხლები ზონდები შეიქმნა Integrated DNA Technologies-ის PrimerQuest ინსტრუმენტის გამოყენებით. ყველა საინტერესო გენი ნორმალიზებული იყო ბირთვული B2M გენისთვის. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC და OPA1 გენის ექსპრესია გაიზომა RT-qPCR-ით. მასტერ-ნაზავი მოიცავდა LUNA Taq პოლიმერაზას (M3003L, New England Biolabs), 10 μM პირდაპირი და უკუ პრაიმერებს, cDNA-ს და PCR კლასის წყალს, რათა თითოეული რეაქციისთვის საბოლოო მოცულობა 10 μL მიგვეღო. გაყოფისა და დაშლის გენების (DRP1, MFN1/2) ექსპრესია გაიზომა TaqMan მულტიპლექსური ანალიზების გამოყენებით. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) გამოყენებული იქნა მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად, მცირედი ცვლილებებით. მულტიპლექსური RT-qPCR მასტერ-ნაზავი მოიცავს 1X LUNA Taq პოლიმერაზას, 10 μM პირდაპირი და უკუ პრაიმერებს, 10 μM ზონდს, cDNA-ს და PCR კლასის წყალს, რის შედეგადაც თითოეული რეაქციისთვის საბოლოო მოცულობა 20 μL იყო. RT-qPCR ჩატარდა Rotor-Gene Q 6-plex-ის (QIAGEN RG—სერიული ნომერი: R0618110) გამოყენებით. ციკლური პირობები ნაჩვენებია ცხრილში S1. ყველა cDNA ნიმუში ამპლიფიცირებული იქნა სამჯერ და სტანდარტული მრუდი გენერირებული იქნა ათჯერადი განზავების სერიის გამოყენებით. ანალიზიდან ამოღებული იქნა ციკლის ზღურბლის სტანდარტული გადახრის (Ct) >0.5 მქონე სამმაგი ნიმუშების გამონაკლისი მაჩვენებლები მონაცემების რეპროდუცირების უზრუნველსაყოფად30,72. ფარდობითი გენის ექსპრესია გამოითვალა 2-ΔΔCt79 მეთოდის გამოყენებით.
ცილის ნიმუშები (60 მკგ) შეერია Laemmli-ს დატვირთვის ბუფერს 2:1 თანაფარდობით და გაუშვა 12%-იან უფერო ცილოვან გელზე (Bio-Rad #1610184). ცილები გადაიტანეს PVDF (პოლივინილიდენფტორიდის) მემბრანაში (#170-84156, Bio-Rad) Trans-Blot Turbo სისტემის (#170-4155, Bio-Rad) გამოყენებით. მემბრანა დაიბლოკა და ინკუბირებული იქნა შესაბამის პირველად ანტისხეულებთან (OPA1, MFN1, MFN2 და DRP1) (განზავებული 1:1000) 48 საათის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა მეორადი ანტისხეულებით (1:10,000) ინკუბაცია 1 საათის განმავლობაში. შემდეგ მემბრანები გამოსახული იქნა Clarity Western ECL Substrate-ის (#170-5061, Bio-Rad) გამოყენებით და ჩაიწერა Bio-Rad ChemiDoc MP სისტემის გამოყენებით. Western blot ანალიზისთვის გამოყენებული იქნა ImageLab ვერსია 6.1. ორიგინალი გელი და ბლოტი ნაჩვენებია ნახაზ S1-ზე. ანტისხეულების შესახებ ინფორმაცია მოცემულია ცხრილ S2-ში.
მონაცემთა ნაკრებები წარმოდგენილია, როგორც მინიმუმ სამი დამოუკიდებელი ნიმუშის საშუალო მნიშვნელობისა და საშუალო მნიშვნელობის სტანდარტული შეცდომის (SEM). მონაცემთა ნაკრებები შემოწმდა ნორმალურობაზე შაპირო-ვილკსის ტესტის გამოყენებით (თუ სხვა რამ არ არის მითითებული), გაუსის განაწილებისა და თანაბარი სტანდარტული გადახრების დაშვებამდე და ანალიზების გაგრძელებამდე. მნიშვნელობის დასადგენად მონაცემთა ნაკრების ანალიზის გარდა, გამოყენებული იქნა ფიშერის MEL LSD (p < 0.05), ცალმხრივი ANOVA (მკურნალობისა და კონტროლის საშუალო) და დანეტის მრავალჯერადი შედარების ტესტი (p < 0.05). მნიშვნელოვანი p მნიშვნელობები გრაფიკზე ნაჩვენებია შემდეგნაირად: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. ყველა სტატისტიკური ანალიზი და გრაფიკი შესრულდა და გენერირებული იქნა GraphPad Prism 9.4.0-ის გამოყენებით.
TEM გამოსახულების ანალიზისთვის განკუთვნილი Fiji/ImageJ მაკროები საჯაროდ ხელმისაწვდომია GitHub-ზე: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. მიტოქონდრიული მოვლენების ლოკატორის (MEL) მაკრო საჯაროდ ხელმისაწვდომია GitHub-ზე: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
მეილიანა ა., დევი ნ.მ. და ვიჯაია ა. მიტოქონდრია: მეტაბოლიზმის, ჰომეოსტაზის, სტრესის, დაბერებისა და ეპიგენეტიკის მთავარი რეგულატორები. ინდონეზიური. ბიოსამედიცინო მეცნიერება. J. 13, 221–241 (2021).
ბენ-შაჩარი, დ. შიზოფრენიის დროს მიტოქონდრიული მრავალმხრივი დისფუნქცია, I კომპლექსი, როგორც შესაძლო პათოლოგიური სამიზნე. შიზოფრენია. რესურსი. 187, 3–10 (2017).
ბოუსი, ა. და ბილი, მ.ფ. მიტოქონდრიული დისფუნქცია პარკინსონის დაავადების დროს. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
შარმა ვ.კ., სინგჰი თ.გ. და მეჰტა ვ. სტრესის ქვეშ მყოფი მიტოქონდრიები: ალცჰაიმერის დაავადების შეჭრის სამიზნეები. მიტოქონდრია 59, 48–57 (2021).
ბელენგუერი პ., დუარტე ჯ.მ.ნ., შუკი პ.ფ. და ფერეირა გ.კ. მიტოქონდრია და ტვინი: ბიოენერგეტიკა და სხვა. ნეიროტოქსინები. რესურსი. 36, 219–238 (2019).
რანგარაჯუ, ვ. და სხვ. პლეიოტროპული მიტოქონდრიები: მიტოქონდრიების გავლენა ნეირონების განვითარებასა და დაავადებებზე. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
კარდანიო-რამოსი, კ. და მორაისი, ვ.ა. მიტოქონდრიული ბიოგენეზი ნეირონებში: როგორ და სად. საერთაშორისოობა. ჯ. მორი. მეცნიერება. 22, 13059 (2021).
იუ, რ., ლენდალი, უ., ნისტერი, მ. და ჟაო, ჯ. ძუძუმწოვრების მიტოქონდრიული დინამიკის რეგულირება: შესაძლებლობები და გამოწვევები. front. endocrine. (ლოზანა) 11, 374 (2020).
ხაჩო, მ. და სლეკი, რს. მიტოქონდრიული დინამიკა ნეიროგენეზის რეგულაციაში: განვითარებადი ტვინიდან ზრდასრულ ტვინამდე. განვითარება. დინამიკა. 247, 47–53 (2018).