გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
ინსულინის ნანონაწილაკებმა (NPs) მაღალი დატვირთვის შემცველობით სხვადასხვა დოზირების ფორმით სხვადასხვა გამოყენება იპოვეს. ამ ნაშრომის მიზანია შეაფასოს გაყინვით გაშრობის და შესხურებით გაშრობის პროცესების გავლენა ინსულინით დატვირთული ქიტოზანის ნანონაწილაკების სტრუქტურაზე, კრიოპროტექტორის სახით მანიტოლით ან მის გარეშე. ჩვენ ასევე შევაფასეთ ამ ნანონაწილაკების ხარისხი მათი ხელახლა გახსნით. დეჰიდრატაციამდე, ქიტოზანის/ნატრიუმის ტრიპოლიფოსფატის/ინსულინის ჯვარედინად დაკავშირებული ნანონაწილაკების ნაწილაკების ზომა ოპტიმიზირებული იყო 318 ნმ-მდე, PDI იყო 0.18, ინკაფსულაციის ეფექტურობა იყო 99.4%, ხოლო დატვირთვა - 25.01%. აღდგენის შემდეგ, ყველა ნანონაწილაკმა, გარდა მანიტოლის გამოყენების გარეშე გაყინვით გაშრობის მეთოდით წარმოებული ნანონაწილაკებისა, შეინარჩუნა სფერული ნაწილაკების სტრუქტურა. შესხურებით გაუწყლოებულ მანიტოლის შემცველ ნანონაწილაკებთან შედარებით, მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამშრალმა ნანონაწილაკებმა ასევე აჩვენეს ყველაზე პატარა საშუალო ნაწილაკების ზომა (376 ნმ) და ყველაზე მაღალი დატვირთვის შემცველობა. (25.02%) მსგავსი ინკაფსულაციის სიჩქარით (98.7%) და PDI-ით (0.20) გაშრობის ან გაყინვის ტექნიკით. მანიტოლის გარეშე შესხურებით გაშრობით გამომშრალმა ნანონაწილაკებმა ასევე გამოიწვია ინსულინის ყველაზე სწრაფი გამოთავისუფლება და უჯრედული შთანთქმის ყველაზე მაღალი ეფექტურობა. ეს ნაშრომი აჩვენებს, რომ შესხურებით გაშრობას შეუძლია ინსულინის ნანონაწილაკების გაუწყლოება კრიოპროტექტორების საჭიროების გარეშე, ტრადიციულ გაყინვის მეთოდებთან შედარებით, რაც ქმნის უფრო დიდ დატვირთვის ტევადობას, დანამატების დაბალ მოთხოვნებს და მნიშვნელოვან უპირატესობას ოპერაციული ხარჯებით.
1922 წელს აღმოჩენის შემდეგ21,2,3 ინსულინმა და მისმა ფარმაცევტულმა პრეპარატებმა გადაარჩინეს 1 ტიპის დიაბეტით (T1DM) და 2 ტიპის დიაბეტით (T1DM) დაავადებული პაციენტების სიცოცხლე. თუმცა, მაღალი მოლეკულური წონის ცილის თვისებების გამო, ინსულინი ადვილად აგრეგირდება, იშლება პროტეოლიზური ფერმენტებით და გამოიყოფა პირველი გავლის ეფექტით. 1 ტიპის დიაბეტით დაავადებულ ადამიანებს ინსულინის ინექციები მთელი ცხოვრება სჭირდებათ. ბევრ პაციენტს, რომელსაც თავდაპირველად 2 ტიპის დიაბეტი დაუდგინდა, ასევე სჭირდება ინსულინის ხანგრძლივი ინექციები. ინსულინის ყოველდღიური ინექციები ყოველდღიური ტკივილისა და დისკომფორტის სერიოზული წყაროა ამ პირებისთვის, რაც უარყოფითად მოქმედებს ფსიქიკურ ჯანმრთელობაზე. შედეგად, ინსულინის მიღების სხვა ფორმები, რომლებიც ნაკლებ დისკომფორტს იწვევს, როგორიცაა ინსულინის პერორალური მიღება, ფართოდ არის შესწავლილი5, რადგან მათ აქვთ პოტენციალი, აღადგინონ მსოფლიოში დიაბეტით დაავადებული დაახლოებით 5 მილიარდი ადამიანის ცხოვრების ხარისხი.
ნანონაწილაკების ტექნოლოგიამ მნიშვნელოვანი წინსვლა მოახდინა პერორალური ინსულინის მიღების მცდელობებში4,6,7. ის ეფექტურად ახდენს ინსულინის კაფსულირებას და იცავს მას დეგრადაციისგან სხეულის კონკრეტულ ადგილებში მიზანმიმართული მიწოდებისთვის. თუმცა, ნანონაწილაკების ფორმულირებების გამოყენებას რამდენიმე შეზღუდვა აქვს, ძირითადად ნაწილაკების სუსპენზიების სტაბილურობის პრობლემების გამო. შენახვის დროს შეიძლება მოხდეს გარკვეული აგრეგაცია, რაც ამცირებს ინსულინით დატვირთული ნანონაწილაკების ბიოშეღწევადობას8. გარდა ამისა, ინსულინის ნანონაწილაკების (NPs) სტაბილურობის უზრუნველსაყოფად ასევე უნდა იქნას გათვალისწინებული ნანონაწილაკებისა და ინსულინის პოლიმერული მატრიცის ქიმიური სტაბილურობა. ამჟამად, გაყინვით გაშრობის ტექნოლოგია ოქროს სტანდარტია სტაბილური NP-ების შესაქმნელად და შენახვის დროს არასასურველი ცვლილებების თავიდან ასაცილებლად9.
თუმცა, გაყინვით გაშრობა მოითხოვს კრიოპროტექტორების დამატებას, რათა თავიდან იქნას აცილებული ნანონაწილაკების სფერული სტრუქტურის ყინულის კრისტალების მექანიკური სტრესით ზემოქმედება. ეს მნიშვნელოვნად ამცირებს ინსულინის ნანონაწილაკების დატვირთვას ლიოფილიზაციის შემდეგ, რადგან კრიოპროტექტორი იკავებს წონის თანაფარდობის უმეტეს ნაწილს. ამიტომ, წარმოებული ინსულინის ნანონაწილაკები ხშირად არ არის შესაფერისი მშრალი ფხვნილის ფორმულირებების, როგორიცაა პერორალური ტაბლეტები და პერორალური აპკები, წარმოებისთვის, ინსულინის თერაპიული ფანჯრის მისაღწევად დიდი რაოდენობით მშრალი ნანონაწილაკების საჭიროების გამო.
შესხურებით გაშრობა ფარმაცევტულ ინდუსტრიაში თხევადი ფაზებიდან მშრალი ფხვნილების წარმოებისთვის ცნობილი და იაფი სამრეწველო მასშტაბის პროცესია10,11. ნაწილაკების ფორმირების პროცესის კონტროლი საშუალებას იძლევა რამდენიმე ბიოაქტიური ნაერთის სათანადო ინკაფსულირების12, 13. გარდა ამისა, ის გახდა ეფექტური ტექნიკა პერორალური მიღებისთვის ინკაფსულირებული ცილების მოსამზადებლად. შესხურებით გაშრობის დროს წყალი ძალიან სწრაფად აორთქლდება, რაც ხელს უწყობს ნაწილაკების ბირთვის დაბალ ტემპერატურას11,14, რაც შესაძლებელს ხდის მის გამოყენებას სითბოსადმი მგრძნობიარე კომპონენტების ინკაფსულირებისთვის. შესხურებით გაშრობამდე, საფარის მასალა საფუძვლიანად უნდა იყოს ჰომოგენიზებული ინკაფსულირებული ინგრედიენტების შემცველი ხსნარით11,14. ლიოფილიზაციით გაშრობისგან განსხვავებით, შესხურებით გაშრობისას ინკაფსულაციამდე ჰომოგენიზაცია აუმჯობესებს ინკაფსულაციის ეფექტურობას დეჰიდრატაციის დროს. ვინაიდან შესხურებით გაშრობის ინკაფსულაციის პროცესი არ საჭიროებს კრიოპროტექტორებს, შესხურებით გაშრობა შეიძლება გამოყენებულ იქნას მაღალი დატვირთვის შემცველობის მქონე გამხმარი ნანონაწილაკების მისაღებად.
კვლევაში აღწერილია ინსულინით დატვირთული ნანონაწილაკების წარმოება ქიტოზანისა და ნატრიუმის ტრიპოლიფოსფატის ჯვარედინი შეერთებით იონური გელის მეთოდის გამოყენებით. იონური გელის წარმოქმნა არის მომზადების მეთოდი, რომელიც საშუალებას იძლევა ნანონაწილაკების წარმოებისა ორ ან მეტ იონურ სახეობას შორის ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედების გზით გარკვეულ პირობებში. ოპტიმიზებული ქიტოზანის/ნატრიუმის ტრიპოლიფოსფატის/ინსულინის ჯვარედინი შეკავშირებული ნანონაწილაკების დეჰიდრატაციისთვის გამოყენებული იქნა როგორც გაყინვით გაშრობის, ასევე შესხურებით გაშრობის ტექნიკა. დეჰიდრატაციის შემდეგ, მათი მორფოლოგია გაანალიზდა SEM-ის მეთოდით. ​​მათი რეკომბინაციის უნარი შეფასდა მათი ზომის განაწილების, ზედაპირული მუხტის, PDI-ის, ინკაფსულაციის ეფექტურობის და დატვირთვის შემცველობის გაზომვით. სხვადასხვა დეჰიდრატაციის მეთოდით წარმოებული ხელახლა გახსნილი ნანონაწილაკების ხარისხი ასევე შეფასდა მათი ინსულინის დაცვის, გამოთავისუფლების ქცევის და უჯრედული შთანთქმის ეფექტურობის შედარებით.
შერეული ხსნარის pH და ქიტოზანისა და ინსულინის თანაფარდობა ორი ძირითადი ფაქტორია, რომლებიც გავლენას ახდენენ საბოლოო ნანონაწილაკების ნაწილაკების ზომასა და კაფსულაციის ეფექტურობაზე (EE), რადგან ისინი პირდაპირ გავლენას ახდენენ იონოტროპული გელის წარმოქმნის პროცესზე. შერეული ხსნარის pH მაღალ კორელაციაშია ნაწილაკების ზომასთან და კაფსულაციის ეფექტურობასთან (სურ. 1ა). როგორც ნაჩვენებია სურ. 1ა-ზე, როდესაც pH გაიზარდა 4.0-დან 6.0-მდე, საშუალო ნაწილაკების ზომა (ნმ) შემცირდა და EE მნიშვნელოვნად გაიზარდა, ხოლო როდესაც pH გაიზარდა 6.5-მდე, საშუალო ნაწილაკების ზომა დაიწყო ზრდა და EE უცვლელი დარჩა. როდესაც ქიტოზანისა და ინსულინის თანაფარდობა იზრდება, საშუალო ნაწილაკების ზომაც იზრდება. გარდა ამისა, EE-ში ცვლილება არ დაფიქსირებულა, როდესაც ნანონაწილაკები მომზადდა ქიტოზანის/ინსულინის მასის თანაფარდობით 2.5:1-ზე მეტი (w/w) (სურ. 1ბ). ამიტომ, ამ კვლევაში მომზადების ოპტიმალური პირობები (pH 6.0, ქიტოზანის/ინსულინის მასის თანაფარდობა 2.5:1) ინსულინით დატვირთული ნანონაწილაკების მოსამზადებლად გამოყენებული იქნა შემდგომი კვლევისთვის. ამ მომზადების პირობებში, ინსულინის ნანონაწილაკების საშუალო ნაწილაკების ზომა ოპტიმიზირებული იყო 318 ნმ-მდე (სურ. 1გ), PDI იყო 0.18, ჩასმის ეფექტურობა იყო 99.4%, ზეტა პოტენციალი იყო 9.8 მვ, ხოლო ინსულინის დატვირთვა იყო 25.01% (მ2/მ2). გამტარი ელექტრონული მიკროსკოპიის (TEM) შედეგების საფუძველზე, ოპტიმიზირებული ნანონაწილაკები იყო დაახლოებით სფერული და დისკრეტული შედარებით ერთგვაროვანი ზომით (სურ. 1დ).
ინსულინის ნანონაწილაკების პარამეტრების ოპტიმიზაცია: (ა) pH-ის გავლენა ინსულინის ნანონაწილაკების საშუალო დიამეტრსა და ინკაფსულაციის ეფექტურობაზე (EE) (მომზადებულია ქიტოზანისა და ინსულინის 5:1 მასის თანაფარდობით); (ბ) ქიტოზანი და ინსულინის მასის თანაფარდობის გავლენა ინსულინის ნანონაწილაკების საშუალო დიამეტრსა და ინკაფსულაციის ეფექტურობაზე (EE) (მომზადებულია pH 6-ზე); (გ) ოპტიმიზირებული ინსულინის ნანონაწილაკების ნაწილაკების ზომის განაწილება; (დ) ოპტიმიზირებული ინსულინის ნანონაწილაკების TEM მიკროგრაფია.
კარგად არის ცნობილი, რომ ქიტოზანი სუსტი პოლიელექტროლიტია 6.5 pKa-თი. მჟავე გარემოში ის დადებითად დამუხტულია, რადგან მისი მთავარი ამინოჯგუფი პროტონირებულია წყალბადის იონებით15. ამიტომ, ის ხშირად გამოიყენება უარყოფითად დამუხტული მაკრომოლეკულების კაფსულირების მატარებლად. ამ კვლევაში, ქიტოზანი გამოყენებული იქნა ინსულინის კაფსულირებისთვის 5.3 იზოელექტრული წერტილით. რადგან ქიტოზანი გამოიყენება როგორც საფარის მასალა, მისი პროპორციის ზრდასთან ერთად, ნანონაწილაკების გარე ფენის სისქე შესაბამისად იზრდება, რაც იწვევს ნაწილაკების საშუალო ზომის ზრდას. გარდა ამისა, ქიტოზანის უფრო მაღალი დონე შეიძლება შეიცავდეს მეტ ინსულინს. ჩვენს შემთხვევაში, EE ყველაზე მაღალი იყო, როდესაც ქიტოზანისა და ინსულინის თანაფარდობა 2.5:1-ს აღწევდა და EE-ში მნიშვნელოვანი ცვლილება არ დაფიქსირებულა, როდესაც თანაფარდობა მუდმივად იზრდებოდა.
ქიტოზანისა და ინსულინის თანაფარდობის გარდა, pH-ს გადამწყვეტი როლიც ეკავა ნანონაწილაკების მომზადებაში. განმა და სხვებმა 17 შეისწავლეს pH-ის გავლენა ქიტოზანის ნანონაწილაკების ნაწილაკების ზომაზე. მათ აღმოაჩინეს ნაწილაკების ზომის უწყვეტი შემცირება მანამ, სანამ pH 6.0-ს არ მიაღწევდა და ნაწილაკების ზომის მნიშვნელოვანი ზრდა დაფიქსირდა pH > 6.0-ზე, რაც შეესაბამება ჩვენს დაკვირვებებს. ეს ფენომენი განპირობებულია იმით, რომ pH-ის მატებასთან ერთად, ინსულინის მოლეკულა იძენს უარყოფით ზედაპირულ მუხტს, რითაც ხელს უწყობს ელექტროსტატიკურ ურთიერთქმედებას ქიტოზან/ნატრიუმის ტრიპოლიფოსფატის (TPP) კომპლექსთან, რაც იწვევს ნაწილაკების მცირე ზომას და მაღალ EE-ს. თუმცა, როდესაც pH 6.5-მდე დაარეგულირეს, ქიტოზანზე არსებული ამინოჯგუფები დეპროტონირებული იყო, რაც იწვევდა ქიტოზანის დაკეცვას. ამრიგად, მაღალი pH იწვევს ამინოიონების ნაკლებ ზემოქმედებას TPP-სა და ინსულინზე, რაც იწვევს ჯვარედინი შეკავშირების შემცირებას, ნაწილაკების საბოლოო საშუალო ზომის უფრო დიდ რაოდენობას და EE-ს დაბალ დონეს.
ლიოფილიზებული და შესხურებით გამომშრალი ნანონაწილაკების მორფოლოგიური თვისებების ანალიზი შეიძლება დაეხმაროს დეჰიდრატაციისა და ფხვნილის წარმოქმნის უკეთესი ტექნიკის შერჩევაში. სასურველი მეთოდი უნდა უზრუნველყოფდეს პრეპარატის სტაბილურობას, ნაწილაკების ერთგვაროვან ფორმას, პრეპარატის მაღალ დატვირთვას და კარგ ხსნადობას საწყის ხსნარში. ამ კვლევაში, ორი ტექნიკის უკეთ შესადარებლად, დეჰიდრატაციის დროს გამოყენებული იქნა ინსულინის ნანონაწილაკები 1%-იანი მანიტოლით ან მის გარეშე. მანიტოლი გამოიყენება როგორც შემავსებელი ან კრიოპროტექტორი სხვადასხვა მშრალი ფხვნილის ფორმულირებებში ლიოფილიზებული და შესხურებით გამომშრალი გაშრობისთვის. ლიოფილიზებული ინსულინის ნანონაწილაკებისთვის, რომლებიც არ შეიცავს მანიტოლს, როგორც ნაჩვენებია ნახაზ 2ა-ზე, სკანირების ელექტრონული მიკროსკოპიის (SEM) ქვეშ დაფიქსირდა მაღალი ფორიანობის ფხვნილის სტრუქტურა დიდი, არარეგულარული და უხეში ზედაპირებით. დეჰიდრატაციის შემდეგ ფხვნილში აღმოჩენილი იქნა რამდენიმე დისკრეტული ნაწილაკი (ნახ. 2ე). ეს შედეგები მიუთითებს, რომ ნანონაწილაკების უმეტესობა დაიშალა გაყინვით გამოშრობის დროს კრიოპროტექტორის გარეშე. ლიოფილიზებული და შესხურებით გამომშრალი ინსულინის ნანონაწილაკებისთვის, რომლებიც შეიცავენ 1% მანიტოლს, დაფიქსირდა სფერული ნანონაწილაკები გლუვი ზედაპირებით (ნახ. 2ბ,დ,ვ,თ). მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამშრალი ინსულინის ნანონაწილაკები სფერული დარჩა, მაგრამ ზედაპირზე დანაოჭებული იყო (სურ. 2გ). სფერული და დანაოჭებული ზედაპირები დაწვრილებით განიხილება გამოთავისუფლების ქცევისა და უჯრედული შთანთქმის ტესტებში ქვემოთ. გამხმარი ნანონაწილაკების ხილული გარეგნობის მიხედვით, როგორც შესხურებით გამშრალი ნანონაწილაკები მანიტოლის გარეშე, ასევე გაყინვით გამშრალი და შესხურებით გამშრალი ნანონაწილაკები მანიტოლით წვრილი ნანონაწილაკების ფხვნილებს იძლეოდა (სურ. 2ვ,გ,თ). რაც უფრო დიდია ნაწილაკების ზედაპირებს შორის ზედაპირის ფართობი, მით უფრო მაღალია ხსნადობა და შესაბამისად, მით უფრო მაღალია გამოთავისუფლების სიჩქარე.
სხვადასხვა დეჰიდრატირებული ინსულინის ნანონაწილაკების მორფოლოგია: (ა) ლიოფილიზებული ინსულინის ნანონაწილაკების SEM გამოსახულება მანიტოლის გარეშე; (ბ) ლიოფილიზებული ინსულინის ნანონაწილაკების SEM გამოსახულება მანიტოლით; (გ) შესხურებით გამშრალი ინსულინის ნანონაწილაკების SEM გამოსახულება მანიტოლის გარეშე; (დ) მანიტოლით შესხურებით გამშრალი ინსულინის ნანონაწილაკების SEM გამოსახულება; (ე) ლიოფილიზებული ინსულინის ნანონაწილაკების ფხვნილის გამოსახულება მანიტოლის გარეშე; (ვ) ლიოფილიზებული ინსულინის ნანონაწილაკების სურათი მანიტოლით; (ზ) შესხურებით გამშრალი ინსულინის ნანონაწილაკების ფხვნილის გამოსახულება მანიტოლის გარეშე; (თ) შესხურებით გამშრალი ინსულინის ნანონაწილაკების ფხვნილის გამოსახულება მანიტოლით.
გაყინვით გაშრობის დროს, მანიტოლი მოქმედებს როგორც კრიოპროტექტორი, ინარჩუნებს ნანონაწილაკებს ამორფულ ფორმაში და ხელს უშლის ყინულის კრისტალებით დაზიანებას19. ამის საპირისპიროდ, შესხურებით გაშრობის დროს გაყინვის ეტაპი არ არის. ამიტომ, ამ მეთოდში მანიტოლი არ არის საჭირო. სინამდვილეში, მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამშრალი ნანონაწილაკებიდან უფრო წვრილი ნანონაწილაკები მიიღება, როგორც ადრე იყო აღწერილი. თუმცა, მანიტოლს კვლავ შეუძლია იმოქმედოს როგორც შემავსებელი შესხურებით გაშრობის პროცესში, რათა ნანონაწილაკებს უფრო სფერული სტრუქტურა მისცეს20 (სურ. 2დ), რაც ხელს უწყობს ასეთი კაფსულირებული ნანონაწილაკების ერთგვაროვანი გამოთავისუფლების ქცევის მიღწევას. გარდა ამისა, ცხადია, რომ ზოგიერთი დიდი ნაწილაკის აღმოჩენა შესაძლებელია როგორც გაყინვით გამშრალ, ასევე შესხურებით გამშრალ ინსულინის ნანონაწილაკებში, რომლებიც შეიცავს მანიტოლს (სურ. 2ბ,დ), რაც შეიძლება გამოწვეული იყოს ნაწილაკების ბირთვში მანიტოლის დაგროვებით კაფსულირებულ ინსულინთან ერთად. ქიტოზანის ფენა. აღსანიშნავია, რომ ამ კვლევაში, დეჰიდრატაციის შემდეგ სფერული სტრუქტურის ხელუხლებლად შენარჩუნების უზრუნველსაყოფად, მანიტოლისა და ქიტოზანის თანაფარდობა 5:1-ზეა შენარჩუნებული, რათა შემავსებლის დიდმა რაოდენობამ ასევე გაზარდოს გამხმარი ნანონაწილაკების ნაწილაკების ზომა.
ფურიეს გარდაქმნის ინფრაწითელი შესუსტებული სრული რეფლექსიის (FTIR-ATR) სპექტროსკოპიამ დაახასიათა თავისუფალი ინსულინის, ქიტოზანის, ქიტოზანის, TPP-ის და ინსულინის ფიზიკური ნარევი. ყველა დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკი დახასიათდა FTIR-ATR სპექტროსკოპიის გამოყენებით. აღსანიშნავია, რომ 1641, 1543 და 1412 სმ-1 ზოლების ინტენსივობა დაფიქსირდა მანიტოლით გაყინვით გამომშრალ ნანონაწილაკებში და მანიტოლით და მის გარეშე შესხურებით გამომშრალ ნანონაწილაკებში (სურ. 3). როგორც ადრე იყო აღნიშნული, სიძლიერის ეს ზრდა დაკავშირებული იყო ქიტოზანს, TPP-სა და ინსულინს შორის ჯვარედინი შეკავშირებასთან. ქიტოზანსა და ინსულინს შორის ურთიერთქმედების კვლევამ აჩვენა, რომ ინსულინით დატვირთული ქიტოზანის ნანონაწილაკების FTIR სპექტრებში, ქიტოზანის ზოლი გადაფარავდა ინსულინის ზოლს, რაც ზრდიდა კარბონილის ინტენსივობას (1641 სმ-1) და ამინის (1543 სმ-1) სარტყელს. TPP-ის ტრიპოლიფოსფატური ჯგუფები დაკავშირებულია ქიტოზანში ამონიუმის ჯგუფებთან, რაც ქმნის... ზოლი 1412 სმ-1-ზე.
თავისუფალი ინსულინის, ქიტოზანის, ქიტოზანის/TPP/ინსულინის ფიზიკური ნარევების და სხვადასხვა მეთოდით დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკების FTIR-ATR სპექტრები.
გარდა ამისა, ეს შედეგები შეესაბამება SEM-ში ნაჩვენებ შედეგებს, რომლებმაც აჩვენა, რომ ინკაფსულირებული ნანონაწილაკები ხელუხლებელი დარჩა როგორც შესხურების, ასევე მანიტოლით გაყინვის დროს, მაგრამ მანიტოლის არარსებობის შემთხვევაში, მხოლოდ შესხურებით გაშრობამ წარმოქმნა ინკაფსულირებული ნაწილაკები. ამის საპირისპიროდ, მანიტოლის გარეშე გაყინვით გაშრობილი ნანონაწილაკების FTIR-ATR სპექტრული შედეგები ძალიან ჰგავდა ქიტოზანის, TPP-ის და ინსულინის ფიზიკურ ნარევს. ეს შედეგი მიუთითებს, რომ ქიტოზანს, TPP-სა და ინსულინს შორის ჯვარედინი კავშირები აღარ არის მანიტოლის გარეშე გაყინვით გაშრობილ ნანონაწილაკებში. ნანონაწილაკების სტრუქტურა განადგურდა კრიოპროტექტორის გარეშე გაყინვის დროს, რაც ჩანს SEM შედეგებში (სურ. 2ა). დეჰიდრატირებული ინსულინის ნანონაწილაკების მორფოლოგიისა და FTIR შედეგების საფუძველზე, რეკონსტიტუციის ექსპერიმენტებისთვის გამოყენებული იქნა მხოლოდ ლიოფილიზირებული, შესხურებით გაშრობილი და მანიტოლისგან თავისუფალი ნანონაწილაკები, ხოლო დეჰიდრატაციის დროს მანიტოლისგან თავისუფალი ნანონაწილაკების დაშლის გამო, მანიტოლისგან თავისუფალი ნანონაწილაკები. განიხილეთ.
დეჰიდრატაცია გამოიყენება ხანგრძლივი შენახვისა და სხვა ფორმულირებებად გადამუშავებისთვის. მშრალი ნანონაწილაკების შენახვის შემდეგ აღდგენის უნარი კრიტიკულია მათი სხვადასხვა ფორმულირებებში, როგორიცაა ტაბლეტები და აპკები, გამოყენებისთვის. ჩვენ შევნიშნეთ, რომ მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამშრალი ინსულინის ნანონაწილაკების საშუალო ნაწილაკების ზომა მხოლოდ ოდნავ გაიზარდა აღდგენის შემდეგ. მეორეს მხრივ, მანიტოლთან ერთად შესხურებით გამშრალი და ლიოფილიზით გამშრალი ინსულინის ნანონაწილაკების ნაწილაკების ზომა მნიშვნელოვნად გაიზარდა (ცხრილი 1). PDI და EE მნიშვნელოვნად არ შეცვლილა (p > 0.05) ამ კვლევაში ყველა ნანონაწილაკების რეკომბინაციის შემდეგ (ცხრილი 1). ეს შედეგი მიუთითებს, რომ ნაწილაკების უმეტესობა ხელახალი გახსნის შემდეგ ხელუხლებელი დარჩა. თუმცა, მანიტოლის დამატებამ ლიოფილიზირებული და შესხურებით გამშრალი მანიტოლის ნანონაწილაკების ინსულინის დატვირთვა მნიშვნელოვნად შეამცირა (ცხრილი 1). ამის საპირისპიროდ, მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამშრალი ნანონაწილაკების ინსულინის დატვირთვის შემცველობა იგივე დარჩა, რაც ადრე (ცხრილი 1).
კარგად არის ცნობილი, რომ ნანონაწილაკების დატვირთვა კრიტიკულია წამლის მიწოდების მიზნებისთვის. დაბალი დატვირთვის მქონე ნანონაწილაკებისთვის, თერაპიული ზღურბლის მისაღწევად საჭიროა მასალის ძალიან დიდი რაოდენობა. თუმცა, ასეთი მაღალი კონცენტრაციების მაღალი სიბლანტე იწვევს დისკომფორტს და სირთულეს პერორალური მიღებისა და ინექციური ფორმულირებების დროს, შესაბამისად, 22. გარდა ამისა, ინსულინის ნანონაწილაკების გამოყენება ასევე შესაძლებელია ტაბლეტებისა და ბლანტი ბიოფილმების დასამზადებლად 23, 24, რაც მოითხოვს ნანონაწილაკების დიდი რაოდენობით გამოყენებას დაბალი დატვირთვის დონეზე, რაც იწვევს დიდ ტაბლეტებსა და სქელ ბიოფილმებს, რომლებიც არ არის შესაფერისი პერორალური გამოყენებისთვის. ამიტომ, ინსულინის მაღალი დატვირთვის მქონე დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკები ძალიან სასურველია. ჩვენი შედეგები მიუთითებს, რომ მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამომშრალი ნანონაწილაკების მაღალი ინსულინის დატვირთვა შეიძლება მრავალი მიმზიდველი უპირატესობის მომტანი იყოს ამ ალტერნატიული მიწოდების მეთოდებისთვის.
ყველა დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკი სამი თვის განმავლობაში ინახებოდა მაცივარში. ელექტრომიოგრაფიის შედეგებმა აჩვენა, რომ ყველა დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკის მორფოლოგია სამთვიანი შენახვის განმავლობაში მნიშვნელოვნად არ შეცვლილა (სურ. 4). წყალში გახსნის შემდეგ, ყველა ნანონაწილაკმა აჩვენა EE-ს უმნიშვნელო შემცირება და სამთვიანი შენახვის პერიოდში გამოყო ინსულინის დაახლოებით მცირე რაოდენობა (~5%) (ცხრილი 2). თუმცა, ყველა ნანონაწილაკის საშუალო ნაწილაკების ზომა გაიზარდა. მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამშრალი ნანონაწილაკების ნაწილაკების ზომა გაიზარდა 525 ნმ-მდე, ხოლო მანიტოლის შემცველი შესხურებით გამშრალი და ლიოფილიზით გამშრალი ნანონაწილაკების ზომა გაიზარდა შესაბამისად 872 და 921 ნმ-მდე (ცხრილი 2).
სამი თვის განმავლობაში შენახული სხვადასხვა დეჰიდრატირებული ინსულინის ნანონაწილაკების მორფოლოგია: (ა) ლიოფილიზირებული ინსულინის ნანონაწილაკების მანიტოლით SEM გამოსახულება; (ბ) მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამშრალი ინსულინის ნანონაწილაკების SEM გამოსახულება; (გ) მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამშრალი ინსულინის ნანონაწილაკების SEM გამოსახულებები.
გარდა ამისა, ნალექები შეინიშნებოდა მანიტოლით შესხურებით გამომშრალ და გაყინვით გამომშრალ ინსულინის ნანონაწილაკებში (სურ. S2). ეს შეიძლება გამოწვეული იყოს წყალში სათანადოდ არ სუსპენზირებული დიდი ნაწილაკებით. ზემოთ ჩამოთვლილი ყველა შედეგი აჩვენებს, რომ შესხურებით გაშრობის ტექნიკას შეუძლია ინსულინის ნანონაწილაკების დაცვა დეჰიდრატაციისგან და რომ ინსულინის ნანონაწილაკების მაღალი დატვირთვის მიღება შესაძლებელია ყოველგვარი შემავსებლის ან კრიოპროტექტორების გარეშე.
ინსულინის შეკავება შემოწმდა pH = 2.5 გარემოში პეპსინის, ტრიპსინის და α-ქიმოტრიფსინის გამოყენებით, რათა დემონსტრირებულიყო ნანონაწილაკების დამცავი უნარი დეჰიდრატაციის შემდეგ ფერმენტული დაშლის წინააღმდეგ. დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკების ინსულინის შეკავება შედარებული იყო ახლად მომზადებულ ნანონაწილაკებთან და თავისუფალი ინსულინი გამოყენებული იქნა როგორც უარყოფითი კონტროლი. ამ კვლევაში, თავისუფალმა ინსულინმა აჩვენა ინსულინის სწრაფი ელიმინაცია 4 საათის განმავლობაში სამივე ფერმენტული დამუშავების დროს (სურ. 5ა-გ). ამის საპირისპიროდ, მანიტოლით გაყინვით გამომშრალი ნანონაწილაკების და მანიტოლით ან მის გარეშე შესხურებით გამომშრალი ნანონაწილაკების ინსულინის ელიმინაციის ტესტირებამ აჩვენა ამ ნანონაწილაკების მნიშვნელოვნად მაღალი დაცვა ფერმენტული დაშლისგან, რაც მსგავსი იყო ახლად მომზადებული ინსულინის ნანონაწილაკების (სურათი 1).5ა-გ). პეპსინში, ტრიპსინში და α-ქიმოტრიფსინში ნანონაწილაკების დახმარებით, ინსულინის 50%-ზე მეტი, 60%-ზე მეტი და 75%-ზე მეტი შეიძლება დაცული იყოს შესაბამისად 4 საათის განმავლობაში (სურ. 5ა-გ). ინსულინის ამ დამცავმა უნარმა შეიძლება გაზარდოს ინსულინის უფრო მაღალი შეწოვის შანსი. სისხლის მიმოქცევაში25. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ მანიტოლით ან მის გარეშე შესხურებით გაშრობას და მანიტოლით გაყინვით გაშრობას შეუძლია შეინარჩუნოს ნანონაწილაკების ინსულინდამცავი უნარი დეჰიდრატაციის შემდეგ.
დეჰიდრატირებული ინსულინის ნანონაწილაკების დაცვა და გამოთავისუფლების ქცევა: (ა) ინსულინის დაცვა პეპსინის ხსნარში; (ბ) ინსულინის დაცვა ტრიპსინის ხსნარში; (გ) ინსულინის დაცვა α-ქიმოტრიფსინის ხსნარით; (დ) დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკების გამოთავისუფლების ქცევა pH = 2.5 ხსნარში; (ე) დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკების გამოთავისუფლების ქცევა pH = 6.6 ხსნარში; (ვ) დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკების გამოთავისუფლების ქცევა pH = 7.0 ხსნარში.
ინსულინის რეზისტენტობაზე ინსულინის ზემოქმედების შესასწავლად, ახლად მომზადებული და აღდგენილი მშრალი ინსულინის ნანონაწილაკები ინკუბირებული იქნა სხვადასხვა ბუფერში (pH = 2.5, 6.6, 7.0) 37°C ტემპერატურაზე, რაც ახდენდა კუჭის, თორმეტგოჯა ნაწლავის და ზედა წვრილი ნაწლავის pH გარემოს სიმულირებას. გამოთავისუფლების ქცევა სხვადასხვა გარემოში. კუჭ-ნაწლავის ტრაქტის ფრაგმენტი. pH = 2.5-ზე, ინსულინით დატვირთულმა ნანონაწილაკებმა და ხელახლა გახსნილმა მშრალმა ინსულინის ნანონაწილაკებმა აჩვენეს საწყისი აფეთქებითი გამოთავისუფლება პირველი ერთი საათის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა ნელი გამოთავისუფლება მომდევნო 5 საათის განმავლობაში (სურ. 5დ). დასაწყისში ეს სწრაფი გამოთავისუფლება, სავარაუდოდ, ნაწილაკის შიდა სტრუქტურაში სრულად არ იმობილიზებული ცილის მოლეკულების სწრაფი ზედაპირული დესორბციის შედეგია. pH = 6.5-ზე, ინსულინით დატვირთულმა ნანონაწილაკებმა და ხელახლა გახსნილმა მშრალმა ინსულინის ნანონაწილაკებმა აჩვენეს გლუვი და ნელი გამოთავისუფლება 6 საათის განმავლობაში, რადგან ტესტის ხსნარის pH მსგავსი იყო ნანონაწილაკებით მომზადებული ხსნარის pH (სურ. 5ე). pH = 7-ზე, ნანონაწილაკები არასტაბილური იყო და თითქმის მთლიანად დაიშალა პირველი ორი საათის განმავლობაში (სურ. 5ვ). ეს იმიტომ ხდება, რომ ქიტოზანის დეპროტონაცია ხდება უფრო მაღალ pH-ზე, რაც იწვევს ნაკლებად კომპაქტურ პოლიმერულ ქსელს და დატვირთული ინსულინის გამოთავისუფლებას.
გარდა ამისა, მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამომშრალმა ინსულინის ნანონაწილაკებმა სხვა დეჰიდრატირებულ ნანონაწილაკებთან შედარებით უფრო სწრაფი გამოთავისუფლების პროფილი აჩვენეს (სურ. 5დ–ვ). როგორც ადრე იყო აღწერილი, მანიტოლის გარეშე გამომშრალმა აღდგენილმა ინსულინის ნანონაწილაკებმა ნაწილაკების ყველაზე პატარა ზომა აჩვენეს. მცირე ნაწილაკები უფრო დიდ ზედაპირს უზრუნველყოფენ, ამიტომ შესაბამისი პრეპარატის უმეტესი ნაწილი ნაწილაკის ზედაპირზე ან მის მახლობლად იქნება, რაც პრეპარატის სწრაფ გამოთავისუფლებას იწვევს26.
ნანონაწილაკების ციტოტოქსიურობა გამოკვლეული იქნა MTT ანალიზით. როგორც ნაჩვენებია ნახაზ S4-ზე, აღმოჩნდა, რომ ყველა დეჰიდრატირებულ ნანონაწილაკს არ ჰქონდა მნიშვნელოვანი გავლენა უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობაზე 50–500 მკგ/მლ კონცენტრაციის დროს, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ყველა დეჰიდრატირებული ნანონაწილკის უსაფრთხოდ გამოყენება შესაძლებელია თერაპიული ფანჯრის მისაღწევად.
ღვიძლი არის მთავარი ორგანო, რომლის მეშვეობითაც ინსულინი ახორციელებს თავის ფიზიოლოგიურ ფუნქციებს. HepG2 უჯრედები ადამიანის ჰეპატომის უჯრედული ხაზია, რომელიც ხშირად გამოიყენება როგორც in vitro ჰეპატოციტების შთანთქმის მოდელი. აქ, HepG2 უჯრედები გამოყენებული იქნა დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკების უჯრედული შთანთქმის შესაფასებლად გაყინვით-გაშრობის და შესხურებით-გაშრობის მეთოდების გამოყენებით. უჯრედული შთანთქმა კონფოკალური ლაზერული სკანირებით ნაკადური ციტომეტრიის და მხედველობის გამოყენებით, რამდენიმესაათიანი ინკუბაციის შემდეგ თავისუფალი FITC ინსულინით 25 მკგ/მლ კონცენტრაციით, ახლად მომზადებული FITC ინსულინით დატვირთული ნანონაწილაკებით და დეჰიდრატირებული FITC ინსულინით დატვირთული ნანონაწილაკებით თანაბარი ინსულინის კონცენტრაციით. ჩატარდა რაოდენობრივი მიკროსკოპიული (CLSM) დაკვირვებები. ლიოფილიზებული ნანონაწილაკები მანიტოლის გარეშე განადგურდა დეჰიდრატაციის დროს და ამ ტესტში არ შეფასებულა. ახლად მომზადებული ინსულინით დატვირთული ნანონაწილაკების, ლიოფილიზებული ნანონაწილაკების მანიტოლით და შესხურებით გამხმარი ნანონაწილაკების უჯრედშიდა ფლუორესცენციის ინტენსივობა მანიტოლით და მის გარეშე (სურ. 6ა) იყო 4.3, 2.6, 2.4 და 4.1-ჯერ მეტია, ვიდრე თავისუფალი. FITC-ინსულინის ჯგუფი, შესაბამისად (სურ. 6ბ). ეს შედეგები მიუთითებს, რომ კაფსულირებული ინსულინი უფრო ძლიერია უჯრედული შთანთქმის თვალსაზრისით, ვიდრე თავისუფალი ინსულინი, ძირითადად კვლევაში წარმოქმნილი ინსულინით დატვირთული ნანონაწილაკების უფრო მცირე ზომის გამო.
HepG2 უჯრედების მიერ 4-საათიანი ინკუბაციის შემდეგ ახლად მომზადებული ნანონაწილაკებით და დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკებით: (ა) HepG2 უჯრედების მიერ FITC-ინსულინის შეწოვის განაწილება. (ბ) ფლუორესცენციის ინტენსივობის გეომეტრიული საშუალო, გაანალიზებული ნაკადური ციტომეტრიით (n = 3), *P < 0.05 თავისუფალ ინსულინთან შედარებით.
ანალოგიურად, CLSM სურათებმა აჩვენა, რომ ახლად მომზადებული FITC-ინსულინით დატვირთული ნანონაწილაკების და FITC-ინსულინით დატვირთული შესხურებით გამომშრალი ნანონაწილაკების (მანიტოლის გარეშე) FITC ფლუორესცენციის ინტენსივობა გაცილებით ძლიერი იყო, ვიდრე სხვა ნიმუშების (სურ. 6ა). გარდა ამისა, მანიტოლის დამატებით, ხსნარის უფრო მაღალმა სიბლანტემ გაზარდა უჯრედული შთანთქმისადმი წინააღმდეგობა, რაც იწვევს ინსულინის პროლიფერაციის შემცირებას. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამომშრალმა ნანონაწილაკებმა აჩვენეს უჯრედული შთანთქმის ყველაზე მაღალი ეფექტურობა, რადგან მათი ნაწილაკების ზომა უფრო მცირე იყო, ვიდრე ლიოფილიზებული გამომშრალი ნანონაწილაკების.
ქიტოზანი (საშუალო მოლეკულური წონა 100 კდა, 75–85%-ით დეაცეტილირებული) შეძენილი იქნა Sigma-Aldrich-ისგან (ოუკვილი, ონტარიო, კანადა). ნატრიუმის ტრიპოლიფოსფატი (TPP) შეძენილი იქნა VWR-ისგან (რადნორი, პენსილვანია, აშშ). კვლევაში გამოყენებული რეკომბინანტული ადამიანის ინსულინი იყო Fisher Scientific-ისგან (უოლტჰემი, მასაჩუსეტსი, აშშ). ფლუორესცეინის იზოთიოციანატით (FITC) მონიშნული ადამიანის ინსულინი და 4′,6-დიამიდინო-2-ფენილინდოლის დიჰიდროქლორიდი (DAPI) შეძენილი იქნა Sigma-Aldrich-ისგან (ოუკვილი, ონტარიო, კანადა). HepG2 უჯრედული ხაზი შეძენილი იქნა ATCC-სგან (მანასასი, ვირჯინია, აშშ). ყველა სხვა რეაგენტი იყო ანალიტიკური ან ქრომატოგრაფიული კლასის.
მოამზადეთ 1 მგ/მლ CS ხსნარი ორმაგად გამოხდილ წყალში (DD წყალი), რომელიც შეიცავს 0.1% ძმარმჟავას. მოამზადეთ TPP-ის და ინსულინის 1 მგ/მლ ხსნარები, შესაბამისად, DD წყალში და 0.1% ძმარმჟავაში გახსნით. წინასწარი ემულსია მომზადდა polytron PCU-2-110 მაღალსიჩქარიანი ჰომოგენიზატორით (Brinkmann Ind. Westbury, NY, აშშ). მომზადების პროცესი შემდეგია: პირველ რიგში, TPP-ის 2 მლ ხსნარი ემატება 4 მლ ინსულინის ხსნარს და ნარევი ურიეთ 30 წუთის განმავლობაში და სრულად აირია. შემდეგ, შერეული ხსნარი წვეთ-წვეთობით დაემატა CS ხსნარს შპრიცის საშუალებით მაღალსიჩქარიანი მორევის ქვეშ (10,000 ბრ/წთ). ნარევები ინახებოდა მაღალსიჩქარიანი მორევის ქვეშ (15,000 ბრ/წთ) ყინულის აბაზანაში 30 წუთის განმავლობაში და დაარეგულირეს გარკვეული pH-მდე ჯვარედინად დაკავშირებული ინსულინის ნანონაწილაკების მისაღებად. ინსულინის ნანონაწილაკების შემდგომი ჰომოგენიზაციისა და ნაწილაკების ზომის შესამცირებლად, ისინი დამატებით 30 წუთის განმავლობაში ულტრაბგერით დამუშავდა. ყინულის აბაზანაში ზონდის ტიპის სონიკატორის გამოყენებით (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, გერმანია).
ინსულინის ნანონაწილაკების Z-საშუალო დიამეტრი, პოლიდისპერსიულობის ინდექსი (PDI) და ზეტა პოტენციალი შემოწმდა დინამიური სინათლის გაფანტვის (DLS) გაზომვების გამოყენებით Litesizer 500-ის (ანტონ პაარი, გრაცი, ავსტრია) გამოყენებით, მათი 25°C ტემპერატურაზე DD წყალში განზავებით. მორფოლოგია და ზომის განაწილება დახასიათდა Hitachi H7600 გამტარი ელექტრონული მიკროსკოპით (TEM) (Hitachi, ტოკიო, იაპონია) და სურათები შემდგომში გაანალიზდა Hitachi-ს გამოსახულების პროგრამული უზრუნველყოფის (Hitachi, ტოკიო, იაპონია) გამოყენებით. ინსულინის ნანონაწილაკების ინკაფსულაციის ეფექტურობის (EE) და დატვირთვის ტევადობის (LC) შესაფასებლად, ნანონაწილაკები პიპეტით გადაიტანეს ულტრაფილტრაციის მილებში 100 kDa მოლეკულური წონის ზღვრით და დაცენტრიფუგირდა 500 xg-ზე 30 წუთის განმავლობაში. ფილტრატში არაინკაფსულირებული ინსულინი განისაზღვრა Agilent 1100 სერიის HPLC სისტემის (Agilent, სანტა კლარა, კალიფორნია, აშშ) გამოყენებით, რომელიც შედგება მეოთხეული ტუმბოსგან, ავტოსემპლერისგან, სვეტის გამათბობლისგან და DAD დეტექტორი. ინსულინი გაანალიზდა C18 სვეტით (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 მმ × 150 მმ, Agilent, აშშ) და აღმოჩენილი იქნა 214 ნმ-ზე. მობილური ფაზა იყო აცეტონიტრილი და წყალი, რომელიც შეიცავდა 0.1% TFA-ს, გრადიენტის თანაფარდობით 10/90-დან 100/0-მდე და მუშაობდა 10 წუთის განმავლობაში. მობილური ფაზა გადატუმბული იყო 1.0 მლ/წთ ნაკადის სიჩქარით. სვეტის ტემპერატურა დაყენებული იყო 20 °C-ზე. გამოთვალეთ EE-ს და LC-ს პროცენტული შემცველობა განტოლებების (1) და განტოლების (2) გამოყენებით.
ინსულინის ნანონაწილაკების ოპტიმიზაციისთვის გამოიცადა CS/ინსულინის სხვადასხვა თანაფარდობა 2.0-დან 4.0-მდე დიაპაზონში. მომზადების დროს დაემატა CS ხსნარის სხვადასხვა რაოდენობა, ინსულინის/TPP ნარევის მუდმივი შენარჩუნებით. ინსულინის ნანონაწილაკები მომზადდა pH დიაპაზონში 4.0-დან 6.5-მდე, ყველა ხსნარის (ინსულინი, TPP და CS) დამატების შემდეგ ნარევის pH-ის ფრთხილად კონტროლით. ინსულინის ნანონაწილაკების EE და ნაწილაკების ზომა შეფასდა სხვადასხვა pH მნიშვნელობებსა და CS/ინსულინის მასის თანაფარდობებზე ინსულინის ნანონაწილაკების ფორმირების ოპტიმიზაციის მიზნით.
ოპტიმიზებული ინსულინის ნანონაწილაკები მოათავსეს ალუმინის კონტეინერზე და დაიფარეს ლენტით შეკრული ქსოვილით. შემდგომში, ხრახნიანი კონტეინერები მოათავსეს Labconco FreeZone-ის საყინულე საშრობში (Labconco, კანზას სიტი, მისური, აშშ), რომელიც აღჭურვილი იყო ლანგრისებრი საშრობით. მშრალი ინსულინის ნანონაწილაკების მისაღებად ტემპერატურა და ვაკუუმური წნევა დაყენებული იყო -10°C-ზე, 0.350 ტორზე პირველი 2 საათის განმავლობაში და 0°C-ზე და 0.120 ტორზე 24 საათის დარჩენილი 22 საათის განმავლობაში.
კაფსულირებული ინსულინის გენერირებისთვის გამოყენებული იქნა Buchi-ს მინი სპრეის საშრობი B-290 (BÜCHI, ფლავილი, შვეიცარია). შერჩეული გაშრობის პარამეტრები იყო: ტემპერატურა 100 °C, მიწოდების ნაკადი 3 ლ/წთ და გაზის ნაკადი 4 ლ/წთ.
ინსულინის ნანონაწილაკები დეჰიდრატაციამდე და დეჰიდრატაციის შემდეგ დახასიათდა FTIR-ATR სპექტროსკოპიის გამოყენებით. დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკები, ასევე თავისუფალი ინსულინი და ქიტოზანი გაანალიზდა Spectrum 100 FTIR სპექტროფოტომეტრის (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო უნივერსალური ATR სინჯის აღების აქსესუარით (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). სიგნალის საშუალო მაჩვენებლები მიღებული იქნა 16 სკანირებიდან 4 სმ2 გარჩევადობით 4000-600 სმ2 სიხშირის დიაპაზონში.
მშრალი ინსულინის ნანონაწილაკების მორფოლოგია შეფასდა Helios NanoLab 650 ფოკუსირებული იონური სხივური სკანირების ელექტრონული მიკროსკოპით (FIB-SEM) (FEI, ჰილსბორო, ორეგონი, აშშ) გადაღებული ლიოფილიზებული და შესხურებით გამომშრალი ინსულინის ნანონაწილაკების SEM გამოსახულებით. გამოყენებული ძირითადი პარამეტრი იყო ძაბვა 5 კევ და დენი 30 მA.
ყველა დეჰიდრატირებული ინსულინის ნანონაწილაკი ხელახლა გაიხსნა გლუტამატის შემცველ წყალში. ნაწილაკების ზომა, PDI, EE და LC კვლავ შემოწმდა იმავე მეთოდით, რომელიც ადრე იყო ნახსენები, დეჰიდრატაციის შემდეგ მათი ხარისხის შესაფასებლად. ანჰიდროინსულინის ნანონაწილაკების სტაბილურობა ასევე გაიზომა ხანგრძლივი შენახვის შემდეგ ნანონაწილაკების თვისებების შემოწმებით. ამ კვლევაში, დეჰიდრატაციის შემდეგ ყველა ნანონაწილაკი მაცივარში სამი თვის განმავლობაში ინახებოდა. სამთვიანი შენახვის შემდეგ, ნანონაწილაკებს შემოწმდა მორფოლოგიური ნაწილაკების ზომა, PDI, EE და LC.
დეჰიდრატაციის შემდეგ ნანონაწილაკების დაცვაში ინსულინის ეფექტურობის შესაფასებლად, გახსნეთ 5 მლ გახსნილი ნანონაწილაკები 45 მლ-ში, რომელიც შეიცავს სიმულირებულ კუჭის სითხეს (pH 1.2, 1% პეპსინის შემცველი), ნაწლავის სითხეს (pH 6.8, 1% ტრიპსინის შემცველი) ან ქიმოტრიფსინის ხსნარს (100 გ/მლ, ფოსფატურ ბუფერში, pH 7.8). ისინი ინკუბირებული იყო 37°C ტემპერატურაზე 100 ბრ/წთ მორევის სიჩქარით. ხსნარის 500 μL შეგროვდა სხვადასხვა დროს და ინსულინის კონცენტრაცია განისაზღვრა HPLC-ით.
ახლად მომზადებული და დეჰიდრატირებული ინსულინის ნანონაწილაკების in vitro გამოთავისუფლების ქცევა შემოწმდა დიალიზის პარკის მეთოდით (მოლეკულური წონის ზღვარი 100 kDa, Spectra Por Inc.). ახლად მომზადებული და აღდგენილი მშრალი ნანონაწილაკები დიალიზირებული იქნა სითხეებში pH 2.5, pH 6.6 და pH 7.0-ით (0.1 M ფოსფატ-ბუფერული ფიზიოლოგიური ხსნარი, PBS), შესაბამისად, კუჭის, თორმეტგოჯა ნაწლავის და ზედა წვრილი ნაწლავის pH გარემოს სიმულირებისთვის. ყველა ნიმუში ინკუბირებული იქნა 37°C ტემპერატურაზე, უწყვეტი შენჯღრევის დროს 200 ბრ/წთ-ზე. სითხე ამოიღეთ 5 მლ დიალიზის პარკის გარეთ შემდეგ დროს: 0.5, 1, 2, 3, 4 და 6 საათი და დაუყოვნებლივ შეავსეთ მოცულობა ახალი დიალიზატით. სითხეში ინსულინის დაბინძურება გაანალიზდა HPLC-ით და ნანონაწილაკებიდან ინსულინის გამოთავისუფლების სიჩქარე გამოითვალა გამოთავისუფლებული თავისუფალი ინსულინის და ნანონაწილაკებში კაფსულირებული ინსულინის მთლიანი რაოდენობის თანაფარდობიდან (განტოლება 3).
ადამიანის ჰეპატოცელულარული კარცინომის უჯრედული ხაზის HepG2 უჯრედები გაიზარდა 60 მმ დიამეტრის ჭურჭელში Dulbecco-ს მოდიფიცირებული Eagle's Medium (DMEM) გამოყენებით, რომელიც შეიცავდა 10% ნაყოფის ძროხის შრატს, 100 სე/მლ პენიცილინს და 100 მკგ/მლ სტრეპტომიცინს29. კულტურები შენარჩუნებული იყო 37°C ტემპერატურაზე, 95%-იან ფარდობით ტენიანობაზე და 5% CO2-ზე. შთანთქმის ანალიზებისთვის, HepG2 უჯრედები დაითესა 1 × 105 უჯრედი/მლ 8-ჭედიან Nunc Lab-Tek კამერულ სლაიდ სისტემაზე (Thermo Fisher, NY, აშშ). ციტოტოქსიკურობის ანალიზებისთვის, ისინი დაითესა 96-ჭედიან ფირფიტებში (Corning, NY, აშშ) 5 × 104 უჯრედი/მლ სიმკვრივით.
MTT ანალიზი გამოყენებული იქნა ახლად მომზადებული და დეჰიდრატირებული ინსულინის ნანონაწილაკების30 ციტოტოქსიურობის შესაფასებლად. HepG2 უჯრედები დაითესა 96-ჭეჭიან ფირფიტებში 5 × 104 უჯრედი/მლ სიმკვრივით და კულტივირებული იქნა ტესტირებამდე 7 დღის განმავლობაში. ინსულინის ნანონაწილაკები განზავდა სხვადასხვა კონცენტრაციამდე (50-დან 500 მკგ/მლ-მდე) კულტურულ გარემოში და შემდეგ შეიყვანეს უჯრედებში. 24 საათიანი ინკუბაციის შემდეგ, უჯრედები 3-ჯერ გაირეცხა PBS-ით და ინკუბირებული იქნა 0.5 მგ/მლ MTT შემცველ გარემოში დამატებით 4 საათის განმავლობაში. ციტოტოქსიურობა შეფასდა ყვითელი ტეტრაზოლიუმის MTT-ის ფერმენტული შემცირების გაზომვით 570 ნმ-ზე იისფერ ფორმაზანად Tecan infinite M200 pro სპექტროფოტომეტრის ფირფიტის წამკითხველის (Tecan, მენედორფი, შვეიცარია) გამოყენებით.
ნანონაწილაკების უჯრედული შთანთქმის ეფექტურობა შემოწმდა კონფოკალური ლაზერული სკანირების მიკროსკოპიით და ნაკადური ციტომეტრიის ანალიზით. Nunc Lab-Tek კამერული სლაიდების სისტემის თითოეული ჭა დამუშავდა თავისუფალი FITC-ინსულინით, FITC-ინსულინით დატვირთული ნანონაწილაკებით და აღდგა 25 მკგ/მლ დეჰიდრატირებული FITC-ინსულინის ნანონაწილაკებით იმავე კონცენტრაციით და ინკუბირებული იქნა 4 საათის განმავლობაში. უჯრედები 3-ჯერ გაირეცხა PBS-ით და ფიქსირდა 4%-იანი პარაფორმალდეჰიდით. ბირთვები შეღებილი იქნა 4′,6-დიამიდინო-2-ფენილინდოლით (DAPI). ინსულინის ლოკალიზაცია დაფიქსირდა Olympus FV1000 ლაზერული სკანირების/ორფოტონიანი კონფოკალური მიკროსკოპის გამოყენებით (Olympus, შინჯუკუ სიტი, ტოკიო, იაპონია). ნაკადური ციტომეტრიის ანალიზისთვის, დაემატა 10 მკგ/მლ თავისუფალი FITC-ინსულინის, FITC-ინსულინით დატვირთული ნანონაწილაკების და ხელახლა გახსნილი დეჰიდრატირებული FITC-ინსულინის ნანონაწილაკების იგივე კონცენტრაციები. 96-ჭეჭიან ფირფიტებში დაითესა HepG2 უჯრედები და ინკუბირებული იყო 4 საათის განმავლობაში. 4 საათიანი ინკუბაციის შემდეგ, უჯრედები ამოიღეს და 3-ჯერ გაირეცხა FBS-ით. თითო ნიმუშში 5 × 104 უჯრედი გაანალიზდა BD LSR II ნაკადური ციტომეტრით (BD, ფრანკლინ ლეიკსი, ნიუ ჯერსი, აშშ).
ყველა მნიშვნელობა გამოხატულია საშუალო ± სტანდარტული გადახრით. ყველა ჯგუფს შორის შედარება შეფასდა ცალმხრივი ANOVA-ს ან t-ტესტის გამოყენებით IBM SPSS Statistics 26 for Mac-ის გამოყენებით (IBM, Endicott, ნიუ-იორკი, აშშ) და p < 0.05 სტატისტიკურად მნიშვნელოვნად ჩაითვალა.
ეს კვლევა აჩვენებს შესხურებით გაშრობის მოქნილობას და უნარს, გააშროს ჯვარედინი შეკავშირებული ქიტოზანის/TPP/ინსულინის ნანონაწილაკები უკეთესი აღდგენით, სტანდარტულ გაყინვით გაშრობის მეთოდებთან შედარებით, შემავსებელი აგენტების ან კრიოპროტექტორების გამოყენებით, ტევადობითა და უფრო მაღალი დატვირთვის ტევადობით. ოპტიმიზებულმა ინსულინის ნანონაწილაკებმა მოგვცა საშუალოდ 318 ნმ ნაწილაკების ზომა და 99.4% ინკაფსულაციის ეფექტურობა. დეჰიდრატაციის შემდეგ SEM და FTIR შედეგებმა აჩვენა, რომ სფერული სტრუქტურა შენარჩუნებული იყო მხოლოდ შესხურებით გამომშრალ ნანონაწილაკებში მანიტოლით და მის გარეშე და ლიოფილიზებულ მანიტოლით, მაგრამ ლიოფილიზირებული მანიტოლის გარეშე ლიოფილიზებული ნანონაწილაკები დაიშალა დეჰიდრატაციის დროს. აღდგენითი უნარის ტესტში, მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამომშრალმა ინსულინის ნანონაწილაკებმა აჩვენეს ყველაზე პატარა საშუალო ნაწილაკების ზომა და ყველაზე მაღალი დატვირთვა აღდგენისას. ყველა ამ დეჰიდრატირებული ნანონაწილაკის გამოთავისუფლების ქცევამ აჩვენა, რომ ისინი სწრაფად გამოთავისუფლდნენ pH = 2.5 და pH = 7 ხსნარებში და ძალიან სტაბილური იყვნენ pH = 6.5 ხსნარში. სხვა ხელახლა გახსნილ დეჰიდრატირებულ ნანონაწილაკებთან შედარებით, მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამომშრალმა ნანონაწილაკებმა ყველაზე სწრაფი გამოთავისუფლება აჩვენეს. ეს შედეგი თანხვედრაშია უჯრედული შთანთქმის ანალიზში დაფიქსირებულ შედეგსთან, რადგან მანიტოლის გარეშე შესხურებით გამომშრალმა ნანონაწილაკებმა თითქმის სრულად შეინარჩუნეს ახლად მომზადებული ნანონაწილაკების უჯრედული შთანთქმის ეფექტურობა. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ მანიტოლის გარეშე შესხურებით გაშრობით მომზადებული მშრალი ინსულინის ნანონაწილაკები ყველაზე შესაფერისია სხვა უწყლო დოზირების ფორმებად, როგორიცაა პერორალური ტაბლეტები ან ბიოადჰეზიური აპკები, შემდგომი დამუშავებისთვის.
ინტელექტუალური საკუთრების საკითხების გამო, მიმდინარე კვლევის დროს გენერირებული და/ან გაანალიზებული მონაცემთა ნაკრებები საჯაროდ ხელმისაწვდომი არ არის, მაგრამ ხელმისაწვდომია შესაბამისი ავტორებისგან გონივრული მოთხოვნის შემთხვევაში.
კაგანი, ა. მე-2 ტიპის დიაბეტი: სოციალური და სამეცნიერო წარმოშობა, სამედიცინო გართულებები და შედეგები პაციენტებისა და სხვებისთვის. (მაკფარლეინი, 2009).
სინგჰი, ა.პ., გუო, ი., სინგჰი, ა., სიე, ვ. და ჯიანგი, პ. ინსულინის კაფსულაციის შემუშავება: შესაძლებელია თუ არა პერორალური მიღება ახლა? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
ვონგი, სი.ი., ალ-სალამი, ჰ. და დასი, სი.რ. დიაბეტის სამკურნალოდ ინსულინით დატვირთული ლიპოსომების ორალური მიწოდების სისტემების ბოლოდროინდელი მიღწევები. ინტერპრეტაცია. ჯ. ფარმაცია.549, 201–217 (2018).