სტატია წარმოადგენს კვლევითი თემის „პარკოსნების პათოგენებისა და მავნებლების მიმართ მდგრადობის გაუმჯობესება“ ნაწილს, იხილეთ ყველა 5 სტატია.
სოკოვანი მცენარის ნეკროზის გამომწვევი აგენტი Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary იყენებს მრავალდონიან სტრატეგიას სხვადასხვა მასპინძელი მცენარის დასაინფიცირებლად. ეს კვლევა გვთავაზობს დიამინ L-ორნიტინის, არაცილის ამინომჟავის, გამოყენებას, რომელიც ასტიმულირებს სხვა აუცილებელი ამინომჟავების სინთეზს, როგორც ალტერნატიულ მართვის სტრატეგიას Phaseolus vulgaris L.-ის მოლეკულური, ფიზიოლოგიური და ბიოქიმიური რეაქციების გასაძლიერებლად Pseudomonas sclerotiorum-ით გამოწვეულ თეთრ ობის მიმართ. in vitro ექსპერიმენტებმა აჩვენა, რომ L-ორნიტინი მნიშვნელოვნად აფერხებს S. pyrenoidosa-ს მიცელიუმის ზრდას დოზადამოკიდებული გზით. გარდა ამისა, მას შეუძლია მნიშვნელოვნად შეამციროს თეთრი ობის სიმძიმე სათბურის პირობებში. გარდა ამისა, L-ორნიტინმა ასტიმულირება დამუშავებული მცენარეების ზრდა, რაც მიუთითებს, რომ L-ორნიტინის შემოწმებული კონცენტრაციები არ იყო ფიტოტოქსიკური დამუშავებული მცენარეებისთვის. გარდა ამისა, L-ორნიტინმა გააძლიერა არაფერმენტული ანტიოქსიდანტების (სულ ხსნადი ფენოლები და ფლავონოიდები) და ფერმენტული ანტიოქსიდანტების (კატალაზა (CAT), პეროქსიდაზა (POX) და პოლიფენოლ ოქსიდაზა (PPO)) ექსპრესია და გაზარდა ანტიოქსიდანტებთან დაკავშირებული სამი გენის (PvCAT1, PvSOD და PvGR) ექსპრესია. გარდა ამისა, in silico ანალიზმა გამოავლინა სავარაუდო ოქსალოაცეტატ აცეტილჰიდროლაზას (SsOAH) ცილის არსებობა S. sclerotiorum-ის გენომში, რომელიც ძალიან ჰგავდა Aspergillus fijiensis-ის (AfOAH) და Penicillium sp.-ის (PlOAH) ოქსალოაცეტატ აცეტილჰიდროლაზას (SsOAH) ცილებს ფუნქციური ანალიზის, კონსერვირებული დომენების და ტოპოლოგიის თვალსაზრისით. საინტერესოა, რომ L-ორნიტინის დამატება კარტოფილის დექსტროზის ბულიონის (PDB) გარემოში მნიშვნელოვნად ამცირებდა SsOAH გენის ექსპრესიას S. sclerotiorum-ის მიცელიაში. ანალოგიურად, L-ორნიტინის ეგზოგენურმა გამოყენებამ მნიშვნელოვნად შეამცირა SsOAH გენის ექსპრესია დამუშავებული მცენარეებიდან შეგროვებულ სოკოვან მიცელიაში. და ბოლოს, L-ორნიტინის გამოყენებამ მნიშვნელოვნად შეამცირა მჟაუნას მჟავას სეკრეცია როგორც PDB გარემოში, ასევე ინფიცირებულ ფოთლებში. დასკვნის სახით, L-ორნიტინი მნიშვნელოვან როლს ასრულებს რედოქს სტატუსის შენარჩუნებაში, ასევე ინფიცირებული მცენარეების თავდაცვითი პასუხის გაძლიერებაში. ამ კვლევის შედეგებმა შეიძლება ხელი შეუწყოს თეთრი ობის კონტროლისა და ლობიოს და სხვა კულტურების წარმოებაზე მისი ზემოქმედების შესამცირებლად ინოვაციური, ეკოლოგიურად სუფთა მეთოდების შემუშავებას.
თეთრი ობი, რომელსაც იწვევს ნეკროტროფული სოკო Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, არის დამანგრეველი, მოსავლიანობის შემამცირებელი დაავადება, რომელიც სერიოზულ საფრთხეს უქმნის ლობიოს (Phaseolus vulgaris L.) გლობალურ წარმოებას (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum ერთ-ერთი ყველაზე რთულად კონტროლირებადი ნიადაგში გავრცელებული სოკოვანი მცენარეული პათოგენია, რომელსაც 600-ზე მეტი მცენარის სახეობა აერთიანებს და აქვს მასპინძელი ქსოვილების სწრაფი და არასპეციფიკური გზით დამუშავების უნარი (Liang and Rollins, 2018). არახელსაყრელ პირობებში, ის გადის თავისი სასიცოცხლო ციკლის კრიტიკულ ფაზას, ხანგრძლივი პერიოდის განმავლობაში რჩება მიძინებულ მდგომარეობაში შავი, მყარი, თესლის მსგავსი სტრუქტურების სახით, რომელსაც „სკლეროციები“ ეწოდება ნიადაგში ან თეთრი, ფუმფულა წანაზარდების სახით ინფიცირებული მცენარეების მიცელიუმში ან ღეროს ნაწლავში (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum-ს შეუძლია სკლეროციების წარმოქმნა, რაც მას საშუალებას აძლევს, დიდი ხნის განმავლობაში გადარჩეს ინფიცირებულ მინდვრებში და დაავადების დროსაც კი შენარჩუნდეს (Schwartz et al., 2005). სკლეროციები მდიდარია საკვები ნივთიერებებით, შეუძლიათ დიდი ხნის განმავლობაში შენარჩუნდეს ნიადაგში და წარმოადგენენ პირველად ინოკულუმს შემდგომი ინფექციებისთვის (Schwartz et al., 2005). ხელსაყრელ პირობებში, სკლეროციები აღმოცენდება და წარმოქმნის ჰაერწვეთოვანი გზით გადამდები სპორებს, რომლებსაც შეუძლიათ მცენარის ყველა მიწისზედა ნაწილის დაინფიცირება, მათ შორის, მაგრამ არა მხოლოდ, ყვავილების, ღეროების ან პარკების (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum იყენებს მრავალდონიან სტრატეგიას მასპინძელი მცენარეების დასაინფიცირებლად, რაც მოიცავს კოორდინირებული მოვლენების სერიას სკლეროციალური აღმოცენებიდან სიმპტომების განვითარებასამდე. თავდაპირველად, S. sclerotiorum წარმოქმნის შეჩერებულ სპორებს (ასკოსპორებს) სოკოს მსგავსი სტრუქტურებიდან, აპოთეციებიდან, რომლებიც ჰაერში გადადიან და ინფიცირებული მცენარის ნამსხვრევებზე არამძრავ სკლეროციებად ვითარდებიან (Bolton et al., 2006). შემდეგ სოკო გამოყოფს მჟაუნას მჟავას, ვირულენტობის ფაქტორს, მცენარის უჯრედის კედლის pH-ის გასაკონტროლებლად, ფერმენტული დეგრადაციისა და ქსოვილებში შეჭრის ხელშესაწყობად (Hegedus and Rimmer, 2005) და მასპინძელი მცენარის ჟანგვითი აფეთქების ჩასახშობად. მჟავიანობის ეს პროცესი ასუსტებს მცენარის უჯრედის კედელს, რაც ხელსაყრელ გარემოს ქმნის სოკოვანი უჯრედის კედლის დამშლელი ფერმენტების (CWDEs) ნორმალური და ეფექტური ფუნქციონირებისთვის, რაც პათოგენს საშუალებას აძლევს გადალახოს ფიზიკური ბარიერი და შეაღწიოს მასპინძელ ქსოვილებში (Marciano et al., 1983). შეღწევის შემდეგ, S. sclerotiorum გამოყოფს რიგ CWDE-ებს, როგორიცაა პოლიგალაქტურონაზა და ცელულოზა, რომლებიც ხელს უწყობენ მის გავრცელებას ინფიცირებულ ქსოვილებში და იწვევენ ქსოვილების ნეკროზს. დაზიანებებისა და ჰიფური ხალიჩების პროგრესირება იწვევს თეთრი ობის დამახასიათებელ სიმპტომებს (Hegedus and Rimmer, 2005). ამასობაში, მასპინძელი მცენარეები ამოიცნობენ პათოგენთან ასოცირებულ მოლეკულურ ნიმუშებს (PAMPs) ნიმუშების ამოცნობის რეცეპტორების (PRRs) მეშვეობით, რაც იწვევს სასიგნალო მოვლენების სერიას, რომლებიც საბოლოოდ ააქტიურებენ დამცავ რეაქციებს.
დაავადებათა კონტროლის ათწლეულების განმავლობაში ძალისხმევის მიუხედავად, ლობიოში, ისევე როგორც სხვა კომერციულ კულტურებში, საკმარისი რეზისტენტული გერმპლაზმის დეფიციტი კვლავ რჩება პათოგენის რეზისტენტობის, გადარჩენისა და ადაპტაციის უნარის გამო. ამიტომ, დაავადების მართვა უკიდურესად რთულია და მოითხოვს ინტეგრირებულ, მრავალმხრივ სტრატეგიას, რომელიც მოიცავს კულტურული პრაქტიკის, ბიოლოგიური კონტროლისა და ქიმიური ფუნგიციდების კომბინაციას (O'Sullivan et al., 2021). თეთრი ობის ქიმიური კონტროლი ყველაზე ეფექტურია, რადგან ფუნგიციდები, სწორად და სწორ დროს გამოყენების შემთხვევაში, ეფექტურად აკონტროლებენ დაავადების გავრცელებას, ამცირებენ ინფექციის სიმძიმეს და მინიმუმამდე ამცირებენ მოსავლიანობის დანაკარგებს. თუმცა, ფუნგიციდების ჭარბმა გამოყენებამ და მათზე ზედმეტმა დამოკიდებულებამ შეიძლება გამოიწვიოს S. sclerotiorum-ის რეზისტენტული შტამების გაჩენა და უარყოფითად იმოქმედოს არასამიზნე ორგანიზმებზე, ნიადაგის ჯანმრთელობასა და წყლის ხარისხზე (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). ამიტომ, ეკოლოგიურად სუფთა ალტერნატივების პოვნა უმთავრესი პრიორიტეტი გახდა.
პოლიამინები (PA), როგორიცაა პუტრეცინი, სპერმიდინი, სპერმინი და კადავერინი, შეიძლება ნიადაგში გავრცელებული მცენარეული პათოგენების წინააღმდეგ პერსპექტიული ალტერნატივების სახით გამოდგეს, რითაც მთლიანად ან ნაწილობრივ შეამცირებს საშიში ქიმიური ფუნგიციდების გამოყენებას (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). უმაღლეს მცენარეებში, PA მონაწილეობენ მრავალ ფიზიოლოგიურ პროცესში, მათ შორის, მაგრამ არა მხოლოდ, უჯრედების დაყოფაში, დიფერენციაციასა და აბიოტურ და ბიოტურ სტრესებზე რეაქციაში (Killiny and Nehela, 2020). მათ შეუძლიათ იმოქმედონ როგორც ანტიოქსიდანტები, დაეხმარონ რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების (ROS) განეიტრალებაში, შეინარჩუნონ რედოქს ჰომეოსტაზი (Nehela and Killiny, 2023), გამოიწვიონ დაცვასთან დაკავშირებული გენების ინდუცირება (Romero et al., 2018), დაარეგულირონ სხვადასხვა მეტაბოლური გზები (Nehela and Killiny, 2023), მოახდინონ ენდოგენური ფიტოჰორმონების მოდულირება (Nehela and Killiny, 2019), შექმნან სისტემური შეძენილი რეზისტენტობა (SAR) და დაარეგულირონ მცენარე-პათოგენის ურთიერთქმედება (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). აღსანიშნავია, რომ მცენარეთა დაცვაში PA-ს სპეციფიკური მექანიზმები და როლები განსხვავდება მცენარის სახეობის, პათოგენების და გარემო პირობების მიხედვით. მცენარეებში ყველაზე გავრცელებული PA ბიოსინთეზირდება აუცილებელი პოლიამინ L-ორნიტინისგან (Killiny and Nehela, 2020).
L-ორნიტინი მრავალ როლს ასრულებს მცენარის ზრდა-განვითარებაში. მაგალითად, წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ ბრინჯში (Oryza sativa) ორნიტინი შეიძლება დაკავშირებული იყოს აზოტის გადამუშავებასთან (Liu et al., 2018), ბრინჯის მოსავლიანობასთან, ხარისხთან და არომატთან (Lu et al., 2020) და წყლის სტრესზე რეაგირებასთან (Yang et al., 2000). გარდა ამისა, L-ორნიტინის ეგზოგენურმა გამოყენებამ მნიშვნელოვნად გაზარდა გვალვისადმი ტოლერანტობა შაქრის ჭარხალში (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) და შეამსუბუქა მარილისადმი სტრესი ხახვის (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021) და კეშიუს (Anacardium occidentale) მცენარეებში (da Rocha et al., 2012). L-ორნიტინის პოტენციური როლი აბიოტური სტრესისგან დაცვაში შეიძლება განპირობებული იყოს მისი მონაწილეობით დამუშავებულ მცენარეებში პროლინის დაგროვებაში. მაგალითად, პროლინის მეტაბოლიზმთან დაკავშირებული გენები, როგორიცაა ორნიტინ დელტა ამინოტრანსფერაზას (დელტა-OAT) და პროლინ დეჰიდროგენაზას (ProDH1 და ProDH2) გენები, ადრე იყო ცნობილი, რომ მონაწილეობდნენ Nicotiana benthamiana-სა და Arabidopsis thaliana-ს დაცვაში არა-მასპინძლის Pseudomonas syringae შტამებისგან (Senthil-Kumar and Mysore, 2012). მეორეს მხრივ, სოკოვანი ორნიტინ დეკარბოქსილაზა (ODC) აუცილებელია პათოგენის ზრდისთვის (Singh et al., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici-ის ODC-ის დამიზნება მასპინძლის მიერ ინდუცირებული გენის ჩახშობის (HIGS) გზით მნიშვნელოვნად ზრდიდა პომიდვრის მცენარეების მდგრადობას ფუზარიუმის ჭკნობის მიმართ (Singh et al., 2020). თუმცა, ეგზოგენური ორნიტინის გამოყენების პოტენციური როლი ბიოტური სტრესების, როგორიცაა ფიტოპათოგენები, წინააღმდეგ კარგად არ არის შესწავლილი. უფრო მნიშვნელოვანია ის, რომ ორნითინის გავლენა დაავადებებისადმი რეზისტენტობაზე და მასთან დაკავშირებულ ბიოქიმიურ და ფიზიოლოგიურ მოვლენებზე დიდწილად შეუსწავლელი რჩება.
პარკოსან კულტურებში S. sclerotiorum-ით ინფექციის სირთულის გააზრება მნიშვნელოვანია ეფექტური კონტროლის სტრატეგიების შემუშავებისთვის. ამ კვლევაში ჩვენი მიზანი იყო დიამინ L-ორნიტინის პოტენციური როლის იდენტიფიცირება, როგორც ძირითადი ფაქტორი პარკოსანი მცენარეების Sclerotinia sclerotiorum ინფექციის მიმართ თავდაცვის მექანიზმებისა და წინააღმდეგობის გაძლიერების საქმეში. ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ ინფიცირებული მცენარეების თავდაცვის რეაქციების გაძლიერების გარდა, L-ორნიტინი ასევე მნიშვნელოვან როლს ასრულებს რედოქს სტატუსის შენარჩუნებაში. ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ L-ორნიტინის პოტენციური ეფექტები დაკავშირებულია ფერმენტული და არაფერმენტული ანტიოქსიდანტური თავდაცვის მექანიზმების რეგულირებასთან და სოკოვანი პათოგენურობის/ვირულენტობის ფაქტორებთან და მათთან დაკავშირებულ ცილებთან ჩარევასთან. L-ორნიტინის ეს ორმაგი ფუნქციონირება მას პერსპექტიულ კანდიდატად აქცევს მდგრადი სტრატეგიისთვის, რათა შემცირდეს თეთრი ობის გავლენა და გაიზარდოს საერთო პარკოსანი კულტურების წინააღმდეგობა ამ ძლიერი სოკოვანი პათოგენის მიმართ. ამ კვლევის შედეგები შეიძლება დაეხმაროს თეთრი ობის კონტროლისა და პარკოსანი კულტურების წარმოებაზე მისი ზემოქმედების შესამცირებლად ინოვაციური, ეკოლოგიურად სუფთა მეთოდების შემუშავებას.
ამ კვლევაში, ექსპერიმენტულ მასალად გამოყენებული იქნა ჩვეულებრივი ლობიოს მგრძნობიარე კომერციული ჯიში, გიზა 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). ჯანსაღი თესლი მოწოდებული იყო პარკოსნების კვლევის დეპარტამენტის მიერ, საველე კულტურების კვლევის ინსტიტუტიდან (FCRI), სოფლის მეურნეობის კვლევის ცენტრიდან (ARC), ეგვიპტე. ხუთი თესლი დაითესა პლასტმასის ქოთნებში (შიდა დიამეტრი 35 სმ, სიღრმე 50 სმ), რომლებიც სავსე იყო S. sclerotiorum-ით ინფიცირებული ნიადაგით სათბურის პირობებში (25 ± 2 °C, ფარდობითი ტენიანობა 75 ± 1%, 8 საათი სინათლე/16 საათი სიბნელე). დათესვიდან 7-10 დღის შემდეგ (DPS), ნერგები გათხელდა ისე, რომ თითოეულ ქოთანში დარჩენილიყო მხოლოდ ორი ნერგი ერთგვაროვანი ზრდით და სამი სრულად გაშლილი ფოთლით. ყველა ქოთნის მცენარე მორწყეს ორ კვირაში ერთხელ და ყოველთვიურად გაანოყიერეს მოცემული ჯიშისთვის რეკომენდებული ნორმით.
L-ორნითინდიამინის (ასევე ცნობილი როგორც (+)-(S)-2,5-დიამინოპენტანოინის მჟავა; Sigma-Aldrich, Darmstadt, გერმანია) 500 მგ/ლ კონცენტრაციის მოსამზადებლად, 50 მგ თავდაპირველად გახსნეს 100 მლ სტერილურ გამოხდილ წყალში. შემდეგ მიღებული ხსნარი განზავდა და გამოყენებულ იქნა შემდგომ ექსპერიმენტებში. მოკლედ, L-ორნითინის კონცენტრაციების ექვსი სერია (12.5, 25, 50, 75, 100 და 125 მგ/ლ) გამოსცადეს in vitro. გარდა ამისა, უარყოფით კონტროლად (Mock) გამოყენებული იქნა სტერილური გამოხდილი წყალი, ხოლო დადებით კონტროლად გამოყენებული იქნა კომერციული ფუნგიციდი „Rizolex-T“ 50%-იანი დასასველებელი ფხვნილი (ტოკლოფოს-მეთილი 20% + თირამი 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, გარბიის გუბერნატორი, ეგვიპტე). კომერციული ფუნგიციდი „რიზოლექს-T“ ინ ვიტრო გამოიცადა ხუთ კონცენტრაციაზე (2, 4, 6, 8 და 10 მგ/ლ).
კომერციული ფერმებიდან შეგროვდა თეთრი ობის ტიპური სიმპტომების მქონე ჩვეულებრივი ლობიოს ღეროებისა და ნაჭუჭების ნიმუშები (ინფექციის მაჩვენებელი: 10–30%). მიუხედავად იმისა, რომ ინფიცირებული მცენარეული მასალების უმეტესობა იდენტიფიცირებული იყო სახეობების/ჯიშის მიხედვით (მგრძნობიარე კომერციული ჯიში Giza 3), სხვა მასალები, განსაკუთრებით ადგილობრივი ბაზრებიდან მიღებული, უცნობი სახეობის იყო. შეგროვებული ინფიცირებული მასალები თავდაპირველად ზედაპირულად დეზინფექციას უტარებდნენ 0.5%-იან ნატრიუმის ჰიპოქლორიტის ხსნარით 3 წუთის განმავლობაში, შემდეგ რამდენჯერმე ირეცხებოდა სტერილური გამოხდილი წყლით და გაშრობისას იწმინდებოდა სტერილური ფილტრის ქაღალდით ზედმეტი წყლის მოსაშორებლად. შემდეგ ინფიცირებული ორგანოები შუა ქსოვილიდან (ჯანსაღ და ინფიცირებულ ქსოვილებს შორის) პატარა ნაჭრებად დაიჭრა, კულტივირებული იქნა კარტოფილის დექსტროზის აგარზე (PDA) და ინკუბირებული იქნა 25 ± 2 °C ტემპერატურაზე 12 საათიანი სინათლის/12 საათიანი სიბნელის ციკლით 5 დღის განმავლობაში სკლეროციების წარმოქმნის სტიმულირების მიზნით. მიცელიუმის წვერის მეთოდი ასევე გამოყენებული იქნა სოკოვანი იზოლატების გასაწმენდად შერეული ან დაბინძურებული კულტურებიდან. გაწმენდილი სოკოვანი იზოლატი თავდაპირველად იდენტიფიცირებული იქნა მისი კულტურული მორფოლოგიური მახასიათებლების საფუძველზე და შემდეგ მიკროსკოპული მახასიათებლების საფუძველზე დადასტურდა, რომ ეს იყო S. sclerotiorum. და ბოლოს, ყველა გაწმენდილი იზოლატი შემოწმდა პათოგენურობაზე მგრძნობიარე გავრცელებულ ლობიოს ჯიშ Giza 3-ზე, კოხის პოსტულატების დასაკმაყოფილებლად.
გარდა ამისა, ყველაზე ინვაზიური S. sclerotiorum იზოლატი (იზოლატი #3) დამატებით დადასტურდა შიდა ტრანსკრიფციული სპეისერის (ITS) სეკვენირების საფუძველზე, როგორც აღწერილია White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017-ის მიერ. მოკლედ, იზოლატები კულტივირებული იქნა კარტოფილის დექსტროზის ბულიონში (PDB) და ინკუბირებული იქნა 25 ± 2 °C ტემპერატურაზე 5-7 დღის განმავლობაში. შემდეგ სოკოვანი მიცელიუმი შეგროვდა, გაფილტრული იქნა ყველით, ორჯერ გაირეცხა სტერილური წყლით და გაშრა სტერილური ფილტრის ქაღალდით. გენომური დნმ იზოლირებული იქნა Quick-DNA™ სოკოვანი/ბაქტერიული მინიპრეპის ნაკრების გამოყენებით (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). ITS rDNA რეგიონი შემდეგ ამპლიფიცირებული იქნა სპეციფიკური პრაიმერის წყვილის ITS1/ITS4 გამოყენებით (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; მოსალოდნელი ზომა: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). გასუფთავებული PCR პროდუქტები წარდგენილი იქნა სეკვენირებისთვის (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA თანმიმდევრობები ორმხრივად სეკვენირებული იქნა სენგერის თანმიმდევრობის მეთოდის გამოყენებით. აწყობილი საძიებო თანმიმდევრობები შემდეგ შედარებული იქნა GenBank-სა და ბიოტექნოლოგიური ინფორმაციის ეროვნულ ცენტრში (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) უახლეს მონაცემებთან BLASTn პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით. მოთხოვნის თანმიმდევრობა შედარებული იქნა S. sclerotiorum-ის 20 სხვა შტამთან/იზოლატთან, რომლებიც აღებულია NCBI GenBank-ში (დამატებითი ცხრილი S1) უახლესი მონაცემებიდან, ClustalW-ის გამოყენებით მოლეკულური ევოლუციური გენეტიკის ანალიზის პაკეტში (MEGA-11; ვერსია 11) (Kumar et al., 2024). ევოლუციური ანალიზი ჩატარდა მაქსიმალური ალბათობის მეთოდისა და ზოგადი დროში შექცევადი ნუკლეოტიდური ჩანაცვლების მოდელის გამოყენებით (Nei and Kumar, 2000). ნაჩვენებია ყველაზე მაღალი ლოგარითმული ალბათობის მქონე ხე. ევრისტიკული ძიების საწყისი ხე შეირჩევა მეზობლის შეერთების (NJ) ხეს (Kumar et al., 2024) და მაქსიმალური ეკონომიურობის (MP) ხეს შორის უფრო მაღალი ლოგარითმული ალბათობის მქონე ხის არჩევით. NJ ხე აგებული იქნა ზოგადი დროში შექცევადი მოდელის გამოყენებით გამოთვლილი წყვილური მანძილის მატრიცის გამოყენებით (Nei and Kumar, 2000).
L-ორნიტინის და ბაქტერიციდ „რიზოლექს-T“-ს ანტიბაქტერიული აქტივობა განისაზღვრა in vitro აგარის დიფუზიის მეთოდით. ​​მეთოდი: აიღეთ L-ორნიტინის საბაზო ხსნარის შესაბამისი რაოდენობა (500 მგ/ლ) და კარგად შეურიეთ 10 მლ PDA საკვებ გარემოს, რათა მომზადდეს ხსნარები, რომელთა საბოლოო კონცენტრაცია შესაბამისად 12.5, 25, 50, 75, 100 და 125 მგ/ლ-ია. საკონტროლოდ გამოყენებული იქნა ფუნგიციდი „რიზოლექს-T“-ს ხუთი კონცენტრაცია (2, 4, 6, 8 და 10 მგ/ლ) და სტერილური გამოხდილი წყალი. გარემოს გამყარების შემდეგ, Sclerotinia sclerotiorum კულტურის ახლად მომზადებული მიცელიუმის საცობი, დიამეტრით 4 მმ, გადაიტანეს პეტრის თეფშის ცენტრში და კულტივირება მოახდინეს 25±2°C ტემპერატურაზე, სანამ მიცელიუმი არ დაფარავდა მთელ საკონტროლო პეტრის თეფშს, რის შემდეგაც დაფიქსირდა სოკოვანი ზრდა. გამოთვალეთ S. sclerotiorum-ის რადიალური ზრდის ინჰიბირების პროცენტული მაჩვენებელი განტოლება 1-ის გამოყენებით:
ექსპერიმენტი ორჯერ განმეორდა, თითოეული საკონტროლო/ექსპერიმენტული ჯგუფისთვის ექვსი ბიოლოგიური გამეორებით და თითოეული ბიოლოგიური გამეორებისთვის ხუთი ქოთნით (თითო ქოთანში ორი მცენარე). ექსპერიმენტული შედეგების სიზუსტის, სანდოობისა და რეპროდუცირებადობის უზრუნველსაყოფად თითოეული ბიოლოგიური გამეორება ორჯერ გაანალიზდა (ორი ტექნიკური გამეორება). გარდა ამისა, პრობიტ რეგრესიული ანალიზი გამოყენებული იქნა ნახევარმაქსიმალური ინჰიბიტორული კონცენტრაციის (IC50) და IC99-ის გამოსათვლელად (Prentice, 1976).
სათბურის პირობებში L-ორნიტინის პოტენციალის შესაფასებლად, ჩატარდა ორი ზედიზედ ექსპერიმენტი ქოთნებში. მოკლედ, ქოთნები შეივსო სტერილიზებული თიხნარ-ქვიშიანი მიწით (3:1) და დაითესა S. sclerotiorum-ის ახლად მომზადებული კულტურით. პირველ რიგში, S. sclerotiorum-ის ყველაზე ინვაზიური იზოლატი (იზოლატი #3) კულტივირებული იქნა ერთი სკლეროციუმის შუაზე გაჭრით, პირქვე დადებით PDA-ზე და ინკუბაციით 25°C ტემპერატურაზე მუდმივ სიბნელეში (24 საათი) 4 დღის განმავლობაში მიცელიუმის ზრდის სტიმულირებისთვის. შემდეგ წინა კიდიდან აიღეს ოთხი 5 მმ დიამეტრის აგარის საცობი და დაითესეს ხორბლისა და ბრინჯის ქატოს 100 გ სტერილური ნარევით (1:1, v/v) და ყველა კოლბა ინკუბირებული იქნა 25 ± 2°C ტემპერატურაზე 12 საათიანი სინათლის/12 საათიანი სიბნელის ციკლით 5 დღის განმავლობაში სკლეროციების წარმოქმნის სტიმულირებისთვის. ნიადაგის დამატებამდე ყველა კოლბის შიგთავსი საფუძვლიანად აირია ერთგვაროვნების უზრუნველსაყოფად. შემდეგ, პათოგენების მუდმივი კონცენტრაციის უზრუნველსაყოფად, თითოეულ ქოთანში ჩაყარეს 100 გრამი კოლონიზაციისთვის განკუთვნილი ქატოს ნარევი. დაინფიცირებული ქოთნები მორწყეს სოკოვანი ზრდის გასააქტიურებლად და 7 დღის განმავლობაში მოათავსეს სათბურის პირობებში.
შემდეგ თითოეულ ქოთანში დაითესა Giza 3 ჯიშის ხუთი თესლი. L-ორნიტინითა და ფუნგიციდით Rizolex-T-ით დამუშავებული ქოთნებისთვის, სტერილიზებული თესლი თავდაპირველად ორი საათის განმავლობაში დაალბეს ორი ნაერთის წყალხსნარში, საბოლოო IC99 კონცენტრაციით, შესაბამისად, დაახლოებით 250 მგ/ლ და 50 მგ/ლ, შემდეგ კი დათესვამდე ერთი საათის განმავლობაში გააშრეს ჰაერზე. მეორეს მხრივ, თესლი უარყოფით კონტროლად სტერილურ გამოხდილ წყალში დაალბეს. 10 დღის შემდეგ, პირველ მორწყვამდე, ნერგები გათხელდა, რის შედეგადაც თითოეულ ქოთანში მხოლოდ ორი სუფთა ნერგი დარჩა. გარდა ამისა, S. sclerotiorum-ით ინფიცირების უზრუნველსაყოფად, ერთსა და იმავე განვითარების სტადიაზე მყოფი ლობიოს მცენარის ღეროები (10 დღე) ორ სხვადასხვა ადგილას მოიჭრა სტერილიზებული სკალპელის გამოყენებით და თითოეულ ჭრილობაში დაახლოებით 0.5 გ კოლონიზებული ქატოს ნარევი მოათავსეს, რასაც მოჰყვა მაღალი ტენიანობა ყველა დაინფიცირებულ მცენარეში ინფექციისა და დაავადების განვითარების სტიმულირებისთვის. საკონტროლო მცენარეები მსგავსად დაიჭრა და ჭრილობაში მოათავსეს სტერილური, არაკოლონიზებული ქატოს ნარევის თანაბარი რაოდენობა (0.5 გ), რომელიც მაღალი ტენიანობის პირობებში შენარჩუნდა დაავადების განვითარებისთვის გარემოს სიმულირებისა და სამკურნალო ჯგუფებს შორის თანმიმდევრულობის უზრუნველყოფის მიზნით.
დამუშავების მეთოდი: ლობიოს ნერგები მორწყეს ნიადაგის მორწყვით L-ორნიტინის (250 მგ/ლ) 500 მლ წყალხსნარით ან ფუნგიციდით Rizolex-T (50 მგ/ლ), შემდეგ დამუშავება განმეორდა სამჯერ 10-დღიანი ინტერვალით. პლაცებოთი დამუშავებული საკონტროლო ჯგუფები მორწყეს 500 მლ სტერილური გამოხდილი წყლით. ყველა დამუშავება ჩატარდა სათბურის პირობებში (25 ± 2°C, 75 ± 1% ფარდობითი ტენიანობა და 8 საათიანი სინათლე/16 საათიანი სიბნელე ფოტოპერიოდი). ყველა ქოთანი მორწყეს ორ კვირაში ერთხელ და ყოველთვიურად დაამუშავეს დაბალანსებული NPK სასუქით (20-20-20, 3.6% გოგირდით და TE მიკროელემენტებით; Zain Seeds, ეგვიპტე) 3–4 გ/ლ კონცენტრაციით ფოთლებში შესხურებით, კონკრეტული ჯიშის რეკომენდაციებისა და მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად. თუ სხვა რამ არ არის მითითებული, სრულად გაფართოებული მწიფე ფოთლები (ზემოდან მე-2 და მე-3 ფოთოლი) შეგროვდა თითოეული ბიოლოგიური რეპლიკიდან დამუშავებიდან 72 საათის შემდეგ (hpt), ჰომოგენიზირებული, გაერთიანებული და შენახული იქნა -80°C ტემპერატურაზე შემდგომი ანალიზებისთვის, მათ შორის, მაგრამ არა მხოლოდ, ოქსიდაციური სტრესის ინდიკატორების in situ ჰისტოქიმიური ლოკალიზაციის, ლიპიდების პეროქსიდაციის, ფერმენტული და არაფერმენტული ანტიოქსიდანტების და გენების ექსპრესიის ანალიზისთვის.
თეთრი ობის ინფექციის ინტენსივობა შეფასდა ყოველკვირეულად, ინოკულაციიდან 21 დღის შემდეგ (dpi), 1-9 შკალის გამოყენებით (დამატებითი ცხრილი S2), რომელიც დაფუძნებულია პეტზოლდტისა და დიკსონის შკალაზე (1996), რომელიც მოდიფიცირებულია ტერანის და სხვების მიერ (2006). მოკლედ, ლობიოს მცენარეების ღეროები და ტოტები შემოწმდა ინოკულაციის წერტილიდან, რათა თვალყური ადევნებულიყო დაზიანებების პროგრესირებას კვანძთაშორის და კვანძების გასწვრივ. შემდეგ გაიზომა დაზიანების მანძილი ინოკულაციის წერტილიდან ღეროს ან ტოტის გასწვრივ ყველაზე შორეულ წერტილამდე და დაზიანების ადგილმდებარეობის მიხედვით მიენიჭა 1-9 ქულა, სადაც (1) მიუთითებდა ინოკულაციის წერტილთან ახლოს ხილული ინფექციის არარსებობაზე, ხოლო (2-9) მიუთითებდა დაზიანების ზომის თანდათანობით ზრდაზე და პროგრესირებაზე კვანძების/კვანძთაშორისი კვანძების გასწვრივ (დამატებითი ცხრილი S2). თეთრი ობის ინფექციის ინტენსივობა შემდეგ გადაიყვანეს პროცენტულად ფორმულის 2 გამოყენებით:
გარდა ამისა, დაავადების პროგრესირების მრუდის ქვეშ არსებული ფართობი (AUDPC) გამოითვალა ფორმულის (შანერი და ფინი, 1977) გამოყენებით, რომელიც ახლახანს ადაპტირებული იქნა ჩვეულებრივი ლობიოს თეთრი ლპობისთვის (ჩაუჰანი და სხვ., 2020) განტოლება 3-ის გამოყენებით:
სადაც Yi = დაავადების სიმძიმე ti დროს, Yi+1 = დაავადების სიმძიმე შემდეგი ti დროს, ti = პირველი გაზომვის დრო (დღეებში), ti+1 = შემდეგი გაზომვის დრო (დღეებში), n = დროის წერტილების ან დაკვირვების წერტილების საერთო რაოდენობა. ლობიოს მცენარის ზრდის პარამეტრები, მათ შორის მცენარის სიმაღლე (სმ), ტოტების რაოდენობა მცენარეზე და ფოთლების რაოდენობა მცენარეზე, ყოველკვირეულად იწერებოდა 21 დღის განმავლობაში ყველა ბიოლოგიურ რეპლიკატში.
თითოეულ ბიოლოგიურ რეპლიკატში, ფოთლების ნიმუშები (ზემოდან მეორე და მესამე სრულად განვითარებული ფოთლები) შეგროვდა დამუშავებიდან 45-ე დღეს (ბოლო დამუშავებიდან 15 დღის შემდეგ). თითოეული ბიოლოგიური რეპლიკა შედგებოდა ხუთი ქოთნისგან (თითო ქოთანში ორი მცენარე). დაახლოებით 500 მგ დაქუცმაცებული ქსოვილი გამოყენებული იქნა ფოტოსინთეზური პიგმენტების (ქლოროფილი a, ქლოროფილი b და კაროტინოიდები) ექსტრაქციისთვის 80%-იანი აცეტონის გამოყენებით 4°C ტემპერატურაზე სიბნელეში. 24 საათის შემდეგ, ნიმუშები ცენტრიფუგირდა და ზედა ფენა შეგროვდა ქლოროფილ a-ს, ქლოროფილ b-ს და კაროტინოიდების შემცველობის კოლორიმეტრიულად დასადგენად UV-160A სპექტროფოტომეტრის (Shimadzu Corporation, იაპონია) გამოყენებით, Lichtenthaler, 1987 მეთოდის მიხედვით, შთანთქმის გაზომვით სამ სხვადასხვა ტალღის სიგრძეზე (A470, A646 და A663 ნმ). და ბოლოს, ფოტოსინთეზური პიგმენტების შემცველობა გამოითვალა შემდეგი ფორმულების 4-6 გამოყენებით, რომლებიც აღწერილია Lichtenthaler-ის მიერ (1987).
დამუშავებიდან 72 საათის შემდეგ (hpt), ფოთლები (ზემოდან მეორე და მესამე სრულად განვითარებული ფოთლები) შეგროვდა თითოეული ბიოლოგიური რეპლიკიდან წყალბადის ზეჟანგის (H2O2) და სუპეროქსიდის ანიონის (O2•−) in situ ჰისტოქიმიური ლოკალიზაციისთვის. თითოეული ბიოლოგიური რეპლიკატი შედგებოდა ხუთი ქოთნისგან (თითო ქოთანში ორი მცენარე). მეთოდის სიზუსტის, სანდოობისა და რეპროდუცირებადობის უზრუნველსაყოფად, თითოეული ბიოლოგიური რეპლიკატი გაანალიზდა დუბლიკატად (ორი ტექნიკური რეპლიკატი). H2O2 და O2•− განისაზღვრა შესაბამისად 0.1% 3,3′-დიამინობენზიდინის (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, გერმანია) ან ნიტროლურჯი ტეტრაზოლიუმის (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, გერმანია) გამოყენებით, რომერო-პუერტასის და სხვების (2004) და ადამისა და სხვების (1989) მიერ აღწერილი მეთოდების გამოყენებით მცირედი ცვლილებებით. H2O2-ის ჰისტოქიმიური ლოკალიზაციისთვის ადგილზე, ბუკლეტები ვაკუუმში შეიყვანეს 0.1% DAB-ით 10 mM Tris ბუფერში (pH 7.8) და შემდეგ ინკუბირებული იქნა ოთახის ტემპერატურაზე, სინათლეზე 60 წუთის განმავლობაში. ბუკლეტები გაათეთრეს 0.15% (v/v) TCA-ში 4:1 (v/v) ეთანოლ:ქლოროფორმში (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, კაირო, ეგვიპტე) და შემდეგ განათებულ იქნა გამუქებამდე. ანალოგიურად, სარქველები ვაკუუმში შეიყვანეს 10 mM კალიუმის ფოსფატის ბუფერით (pH 7.8), რომელიც შეიცავდა 0.1 w/v % HBT-ს ადგილზე, O2•−-ის ჰისტოქიმიური ლოკალიზაციისთვის ადგილზე. ბუკლეტები ინკუბირებული იქნა სინათლეზე ოთახის ტემპერატურაზე 20 წუთის განმავლობაში, შემდეგ გათეთრებული იქნა ზემოთ აღწერილი მეთოდით და განათებული იქნა მუქი ლურჯი/იისფერი ლაქების გაჩენამდე. მიღებული ყავისფერი (როგორც H2O2 ინდიკატორი) ან ლურჯ-იისფერი (როგორც O2•− ინდიკატორი) ფერის ინტენსივობა შეფასდა გამოსახულების დამუშავების პაკეტის ImageJ-ის ფიჯის ვერსიის გამოყენებით (http://fiji.sc; წვდომა 2024 წლის 7 მარტს).
მალონდიალდეჰიდი (MDA; როგორც ლიპიდების პეროქსიდაციის მარკერი) განისაზღვრა დუს და ბრამლაჟის (1992) მეთოდის მიხედვით მცირედი მოდიფიკაციებით. თითოეული ბიოლოგიური რეპლიკიდან (ზემოდან მეორე და მესამე სრულად განვითარებული ფოთლები) ფოთლები შეგროვდა დამუშავებიდან 72 საათის შემდეგ (hpt). თითოეული ბიოლოგიური რეპლიკატი მოიცავდა ხუთ ქოთანს (თითო ქოთანში ორი მცენარე). მეთოდის სიზუსტის, სანდოობისა და რეპროდუცირებადობის უზრუნველსაყოფად, თითოეული ბიოლოგიური რეპლიკატი გაანალიზდა დუბლიკატად (ორი ტექნიკური რეპლიკატი). მოკლედ, MDA ექსტრაქციისთვის გამოყენებული იქნა 0.5 გ დაფქული ფოთლის ქსოვილი 20%-იანი ტრიქლორძმარმჟავით (TCA; MilliporeSigma, ბურლინგტონი, მასაჩუსეტსი, აშშ), რომელიც შეიცავდა 0.01% ბუტილირებულ ჰიდროქსიტოლუოლს (BHT; Sigma-Aldrich, სენტ-ლუისი, მისური, აშშ). ზედა ფენაში MDA-ს შემცველობა შემდეგ განისაზღვრა კოლორიმეტრიულად, UV-160A სპექტროფოტომეტრის (Shimadzu Corporation, იაპონია) გამოყენებით 532 და 600 ნმ-ზე აბსორბციის გაზომვით და შემდეგ გამოისახა ნმოლ გ−1 FW-ში.
არაფერმენტული და ფერმენტული ანტიოქსიდანტების შესაფასებლად, ფოთლები (ზემოდან მეორე და მესამე სრულად განვითარებული ფოთლები) შეგროვდა თითოეული ბიოლოგიური რეპლიკიდან დამუშავებიდან 72 საათის შემდეგ (hpt). თითოეული ბიოლოგიური რეპლიკატი შედგებოდა ხუთი ქოთნისგან (თითო ქოთანში ორი მცენარე). თითოეული ბიოლოგიური ნიმუში გაანალიზდა დუბლიკატად (ორი ტექნიკური ნიმუში). ორი ფოთოლი დაფქული იქნა თხევადი აზოტით და გამოყენებული იქნა უშუალოდ ფერმენტული და არაფერმენტული ანტიოქსიდანტების, ამინომჟავების საერთო რაოდენობის, პროლინის შემცველობის, გენის ექსპრესიისა და ოქსალატის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის.
ხსნადი ფენოლების საერთო რაოდენობა განისაზღვრა ფოლინ-ჩიოკალტეუს რეაგენტის (Sigma-Aldrich, სენტ-ლუისი, მისური, აშშ) გამოყენებით, კახკონენის და სხვების მიერ (1999) აღწერილი მეთოდის მცირედი მოდიფიკაციებით. მოკლედ, დაახლოებით 0.1 გ ჰომოგენიზებული ფოთლის ქსოვილი ექსტრაგირებული იქნა 20 მლ 80%-იანი მეთანოლით სიბნელეში 24 საათის განმავლობაში და ცენტრიფუგირების შემდეგ შეგროვდა ზედა ფენა. ნიმუშის ექსტრაქტის 0.1 მლ შეერია 0.5 მლ ფოლინ-ჩიოკალტეუს რეაგენტს (10%), შეანჯღრიეს 30 წამის განმავლობაში და დატოვეს სიბნელეში 5 წუთის განმავლობაში. შემდეგ თითოეულ მილს დაემატა 0.5 მლ 20%-იანი ნატრიუმის კარბონატის ხსნარი (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, კაირო, ეგვიპტე), კარგად შეერია და ინკუბირებული იქნა ოთახის ტემპერატურაზე სიბნელეში 1 საათის განმავლობაში. ინკუბაციის შემდეგ, რეაქციის ნარევის შთანთქმა გაიზომა 765 ნმ-ზე UV-160A სპექტროფოტომეტრის (Shimadzu Corporation, იაპონია) გამოყენებით. ნიმუშის ექსტრაქტებში ხსნადი ფენოლების საერთო კონცენტრაცია განისაზღვრა გალის მჟავას კალიბრაციის მრუდის გამოყენებით (Fisher Scientific, ჰემპტონი, ნიუ ჰემფშირი, აშშ) და გამოისახა გალის მჟავას ექვივალენტის მილიგრამებში ახალი წონის ერთ გრამზე (მგ GAE გ-1 ახალი წონა).
ხსნადი ფლავონოიდების საერთო შემცველობა განისაზღვრა ჯერიდანის და სხვების (2006) მეთოდის მიხედვით, მცირედი ცვლილებებით. მოკლედ, ზემოთ მოყვანილი მეთანოლის ექსტრაქტის 0.3 მლ შეურიეს 0.3 მლ 5%-იან ალუმინის ქლორიდის ხსნარს (AlCl3; Fisher Scientific, ჰემპტონი, ნიუ ჰემფშირი, აშშ), ენერგიულად მოურიეს და შემდეგ ინკუბაცია მოახდინეს ოთახის ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა 0.3 მლ 10%-იანი კალიუმის აცეტატის ხსნარის (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, კაირო, ეგვიპტე), საფუძვლიანად შეურიეს და ინკუბაცია მოახდინეს ოთახის ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში სიბნელეში. ინკუბაციის შემდეგ, რეაქციის ნარევის შთანთქმა გაიზომა 430 ნმ-ზე UV-160A სპექტროფოტომეტრის გამოყენებით (Shimadzu Corporation, იაპონია). ნიმუშის ექსტრაქტებში ხსნადი ფლავონოიდების საერთო კონცენტრაცია განისაზღვრა რუტინის კალიბრაციის მრუდის გამოყენებით (TCI America, პორტლენდი, ორეგონი, აშშ) და შემდეგ გამოისახა რუტინის ეკვივალენტის მილიგრამებში სუფთა წონის ერთ გრამზე (მგ RE გ-1 სუფთა წონა).
ლობიოს ფოთლების თავისუფალი ამინომჟავების საერთო შემცველობა განისაზღვრა მოდიფიცირებული ნინჰიდრინის რეაგენტის (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) გამოყენებით, რომელიც დაფუძნებულია იოკოიამას და ჰირამატუს (2003) მიერ შემოთავაზებულ და სანის და სხვების (2006) მიერ მოდიფიცირებულ მეთოდზე. მოკლედ, დაფქული ქსოვილის 0.1 გ ექსტრაგირებული იქნა pH 5.4 ბუფერით და 200 μL ზედა ფენა რეაქციაში შევიდა 200 μL ნინჰიდრინთან (2%) და 200 μL პირიდინთან (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), ინკუბირებული იქნა მდუღარე წყლის აბაზანაში 30 წუთის განმავლობაში, შემდეგ გაცივდა და გაიზომა 580 ნმ-ზე UV-160A სპექტროფოტომეტრის (Shimadzu Corporation, იაპონია) გამოყენებით. მეორეს მხრივ, პროლინი განისაზღვრა ბეიტსის მეთოდით (Bates et al., 1973). პროლინი ექსტრაგირებული იქნა 3%-იანი სულფოსალიცილის მჟავით (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, აშშ) და ცენტრიფუგირების შემდეგ, 0.5 მლ ზედა ფენა შეერია 1 მლ გამყინვარების ძმარმჟავას (Fisher Scientific, Hampton, NH, აშშ) და ნინჰიდრინის რეაგენტს, ინკუბირებული იქნა 90°C-ზე 45 წუთის განმავლობაში, გაცივდა და გაიზომა 520 ნმ-ზე იმავე სპექტროფოტომეტრის გამოყენებით, როგორც ზემოთ იყო აღწერილი. ფოთლის ექსტრაქტებში თავისუფალი ამინომჟავების და პროლინის საერთო რაოდენობა განისაზღვრა შესაბამისად გლიცინის და პროლინის კალიბრაციის მრუდების გამოყენებით (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, აშშ) და გამოისახა მგ/გ სუფთა წონაში.
ანტიოქსიდანტური ფერმენტების ფერმენტული აქტივობის დასადგენად, დაახლოებით 500 მგ ჰომოგენიზებული ქსოვილი ექსტრაგირებული იქნა 3 მლ 50 mM Tris ბუფერით (pH 7.8), რომელიც შეიცავდა 1 mM EDTA-Na2-ს (Sigma-Aldrich, სენტ-ლუისი, მისური, აშშ) და 7.5% პოლივინილპიროლიდონს (PVP; Sigma-Aldrich, სენტ-ლუისი, მისური, აშშ), ცენტრიფუგირებული იქნა 10,000 × g-ზე 20 წუთის განმავლობაში მაცივარში (4°C) და შეგროვდა ზედა ფენა (ნედლი ფერმენტის ექსტრაქტი) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). შემდეგ კატალაზა (CAT) რეაქციაში შევიდა 2 მლ 0.1 M ნატრიუმის ფოსფატის ბუფერთან (pH 6.5; Sigma-Aldrich, სენტ-ლუისი, მისური, აშშ) და 100 μl 269 mM H2O2 ხსნარის შემცველობასთან, რათა განესაზღვრა მისი ფერმენტული აქტივობა აების (1984) მეთოდის მიხედვით მცირედი მოდიფიკაციებით (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). გუაიაკოლ-დამოკიდებული პეროქსიდაზას (POX) ფერმენტული აქტივობა განისაზღვრა ჰარახის და სხვების (2009) მეთოდის გამოყენებით. (2008) მცირე მოდიფიკაციებით (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) და პოლიფენოლ ოქსიდაზას (PPO) ფერმენტული აქტივობა განისაზღვრა 2.2 მლ 100 mM ნატრიუმის ფოსფატის ბუფერთან (pH 6.0), 100 μl გუაიაკოლთან (TCI chemicals, პორტლენდი, ორეგონი, აშშ) და 100 μl 12 mM H2O2-თან რეაქციის შემდეგ. მეთოდი ოდნავ შეცვლილია (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) მეთოდისგან. ანალიზი ჩატარდა 0.1 M ფოსფატის ბუფერში (pH 6.0) ახლად მომზადებული კატექოლის ხსნარის 3 მლ (Thermo Scientific Chemicals, უოლტჰემი, მასაჩუსეტსი, აშშ) (0.01 M) რეაქციის შემდეგ. CAT აქტივობა გაიზომა H2O2-ის დაშლის მონიტორინგით 240 ნმ-ზე (A240), POX აქტივობა გაიზომა შთანთქმის ზრდის მონიტორინგით 436 ნმ-ზე (A436), ხოლო PPO აქტივობა გაიზომა შთანთქმის რყევების ჩაწერით 495 ნმ-ზე (A495) ყოველ 30 წამში 3 წუთის განმავლობაში UV-160A სპექტროფოტომეტრის (შიმაძუ, იაპონია) გამოყენებით.
ბოლო დამუშავებიდან 72 საათის შემდეგ, ლობიოს ფოთლებში (ზემოდან მეორე და მესამე სრულად განვითარებული ფოთლები) ანტიოქსიდანტებთან დაკავშირებული სამი გენის ტრანსკრიპტის დონის დასადგენად გამოყენებული იქნა რეალურ დროში RT-PCR მეთოდი, მათ შორის პეროქსისომული კატალაზას (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), სუპეროქსიდდისმუტაზას (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1) და გლუტათიონ რედუქტაზას (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1) ტრანსკრიპტის დონეები. მოკლედ, რნმ იზოლირებული იქნა Simply P Total RNA Extraction Kit-ის (კატალოგის ნომერი BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) გამოყენებით, მწარმოებლის პროტოკოლის შესაბამისად. შემდეგ, cDNA სინთეზირებული იქნა TOP script™ cDNA Synthesis Kit-ის გამოყენებით, მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად. ზემოთ ჩამოთვლილი სამი გენის პრაიმერის თანმიმდევრობები ჩამოთვლილია დამატებით ცხრილში S3. PvActin-3 (GenBank-ის სააბონენტო ნომერი: XM_068616709.1) გამოყენებული იქნა როგორც „მოვლის“ გენი და გენის ფარდობითი ექსპრესია გამოითვალა 2-ΔΔCT მეთოდის გამოყენებით (ლივაკი და შმიტგენი, 2001). აქტინის სტაბილურობა ნაჩვენები იყო ბიოტური სტრესის (ჩვეულებრივ პარკოსნებსა და ანთრაქნოზურ სოკოს Colletotrichum lindemuthianum-ს შორის შეუთავსებელი ურთიერთქმედება) და აბიოტური სტრესის (გვალვა, მარილიანობა, დაბალი ტემპერატურა) პირობებში (ბორგესი და სხვ., 2012).
თავდაპირველად, S. sclerotiorum-ში ოქსალოაცეტატ აცეტილჰიდროლაზას (OAH) ცილების გენომის მასშტაბით in silico ანალიზი ჩავატარეთ ცილა-ცილა BLAST ინსტრუმენტის (BLASTp 2.15.0+) გამოყენებით (Altschul et al., 1997, 2005). მოკლედ, S. sclerotiorum-ში ჰომოლოგიური ცილის (ტაქსიდი: 5180) დასაფიქსირებლად, მოთხოვნის თანმიმდევრობად გამოვიყენეთ Aspergillus fijiensis CBS 313.89-ის (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank-ის სააბონენტო ნომერი XP_040799428.1; 342 ამინომჟავა) და Penicillium lagena-ს (PlOAH; taxide: 94218; GenBank-ის სააბონენტო ნომერი XP_056833920.1; 316 ამინომჟავა) OAH. BLASTp ჩატარდა S. sclerotiorum-ის უახლესი ხელმისაწვდომ გენომის მონაცემებზე ბიოტექნოლოგიური ინფორმაციის ეროვნული ცენტრის (NCBI) ვებსაიტზე, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/, GenBank-ში.
გარდა ამისა, S. sclerotiorum-დან (SsOAH) პროგნოზირებული OAH გენი და A. fijiensis CBS 313.89-დან AfOAH-ის და P. lagena-დან PlOAH-ის ევოლუციური ანალიზი და ფილოგენეტიკური ხე გამოითვალა MEGA11-ში მაქსიმალური ალბათობის მეთოდის (Tamura et al., 2021) და JTT მატრიცაზე დაფუძნებული მოდელის (Jones et al., 1992) გამოყენებით. ფილოგენეტიკური ხე გაერთიანდა S. sclerotiorum-დან ყველა პროგნოზირებული OAH გენის (SsOAH) ცილოვანი თანმიმდევრობების მრავალჯერადი გასწორების ანალიზთან და მოთხოვნის თანმიმდევრობასთან შეზღუდვაზე დაფუძნებული გასწორების ინსტრუმენტის (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) გამოყენებით (Papadopoulos and Agarwala, 2007). გარდა ამისა, S. sclerotiorum-დან მიღებული SsOAH-ის ყველაზე შესატყვისი ამინომჟავების თანმიმდევრობები გასწორდა საძიებო თანმიმდევრობებთან (AfOAH და PlOAH) (Larkin et al., 2007) ClustalW-ის (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) გამოყენებით, ხოლო გასწორებაში კონსერვირებული რეგიონები ვიზუალიზებული იქნა ESPript ინსტრუმენტის (ვერსია 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) გამოყენებით.
გარდა ამისა, S. sclerotiorum SsOAH-ის პროგნოზირებული ფუნქციური წარმომადგენლობითი დომენები და კონსერვირებული უბნები ინტერაქტიულად კლასიფიცირდა სხვადასხვა ოჯახებში InterPro ინსტრუმენტის გამოყენებით (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). და ბოლოს, პროგნოზირებული S. sclerotiorum SsOAH-ის სამგანზომილებიანი (3D) სტრუქტურის მოდელირება ჩატარდა ცილის ჰომოლოგიის/ანალოგიის ამოცნობის ძრავის გამოყენებით (Phyre2 სერვერის ვერსია 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) და დადასტურდა SWISS-MODEL სერვერის გამოყენებით (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). პროგნოზირებული სამგანზომილებიანი სტრუქტურები (PDB ფორმატი) ინტერაქტიულად ვიზუალიზებული იქნა UCSF-Chimera პაკეტის (ვერსია 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) გამოყენებით (პეტერსენი და სხვ., 2004).
Sclerotinia sclerotiorum-ის მიცელიუმის ოქსალოაცეტატ აცეტილჰიდროლაზას (SsOAH; GenBank-ის სააბონენტო ნომერი: XM_001590428.1) ტრანსკრიფციული დონის დასადგენად გამოყენებული იქნა რაოდენობრივი რეალურ დროში ფლუორესცენტული პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR). მოკლედ, S. sclerotiorum ინოკულირებული იქნა PDB-ის შემცველ კოლბაში და მოთავსდა შენჯღრეულ ინკუბატორში (მოდელი: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) 25 ± 2 °C ტემპერატურაზე 24 საათის განმავლობაში 150 ბრ/წთ-ზე და მუდმივ სიბნელეში (24 საათი) მიცელიუმის ზრდის სტიმულირების მიზნით. ამის შემდეგ, უჯრედები დამუშავდა L-ორნიტინით და ფუნგიციდით Rizolex-T-ით საბოლოო IC50 კონცენტრაციებით (დაახლოებით 40 და 3.2 მგ/ლ, შესაბამისად) და შემდეგ კულტივირებული იქნა კიდევ 24 საათის განმავლობაში იმავე პირობებში. ინკუბაციის შემდეგ, კულტურები ცენტრიფუგირდა 2500 ბრ/წთ-ზე 5 წუთის განმავლობაში და სუპერნატანტი (სოკოვანი მიცელიუმი) შეგროვდა გენის ექსპრესიის ანალიზისთვის. ანალოგიურად, სოკოვანი მიცელიუმი შეგროვდა ინფექციიდან 0, 24, 48, 72, 96 და 120 საათის შემდეგ ინფიცირებული მცენარეებიდან, რომლებმაც ინფიცირებული ქსოვილების ზედაპირზე წარმოიქმნა თეთრი ობი და ბამბისებრი მიცელიუმი. სოკოვანი მიცელიუმიდან ექსტრაგირებული იქნა რნმ და შემდეგ სინთეზირებული იქნა cDNA ზემოთ აღწერილი წესით. SsOAH-ის პრაიმერის თანმიმდევრობები ჩამოთვლილია დამატებით ცხრილში S3. SsActin (GenBank-ის სააბონენტო ნომერი: XM_001589919.1) გამოყენებული იქნა როგორც „მოვლის“ გენი, ხოლო გენის ფარდობითი ექსპრესია გამოითვალა 2-ΔΔCT მეთოდის გამოყენებით (Livak and Schmittgen, 2001).
კარტოფილის დექსტროზის ბულიონში (PDB) და სოკოვანი პათოგენის, Sclerotinia sclerotiorum-ის შემცველ მცენარეთა ნიმუშებში, ოქსალის მჟავა განისაზღვრა სიუ და ჟანგის (2000) მეთოდის მიხედვით, მცირედი ცვლილებებით. მოკლედ, S. sclerotiorum-ის იზოლატები ინოკულირებული იქნა PDB-ის შემცველ კოლბებში და შემდეგ კულტივირებული იქნა შენჯღრევის ინკუბატორში (მოდელი I2400, New Brunswick Scientific Co., ედისონი, ნიუ ჯერსი, აშშ) 150 ბრ/წთ სიჩქარით 25 ± 2 °C ტემპერატურაზე 3-5 დღის განმავლობაში მუდმივ სიბნელეში (24 სთ) მიცელიუმის ზრდის სტიმულირების მიზნით. ინკუბაციის შემდეგ, სოკოვანი კულტურა ჯერ გაფილტრული იქნა Whatman #1 ფილტრის ქაღალდით და შემდეგ ცენტრიფუგირებული იქნა 2500 ბრ/წთ სიჩქარით 5 წუთის განმავლობაში ნარჩენი მიცელიუმის მოსაშორებლად. ზედა ფენა შეგროვდა და შეინახეს 4°C ტემპერატურაზე ოქსალატის შემდგომი რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის. მცენარეული ნიმუშების მოსამზადებლად, დაახლოებით 0.1 გ მცენარეული ქსოვილის ფრაგმენტები სამჯერ იქნა ექსტრაგირებული გამოხდილი წყლით (თითოეულ ჯერზე 2 მლ). შემდეგ ნიმუშები დაცენტრიფუგდა 2500 ბრ/წთ-ზე 5 წუთის განმავლობაში, ზედა ფენა გაფილტრული იქნა Whatman No. 1 ფილტრის ქაღალდით და შეგროვდა შემდგომი ანალიზისთვის.
მჟაუნას მჟავას რაოდენობრივი ანალიზისთვის, რეაქციის ნარევი მომზადდა მინის საცობიან მილში შემდეგი თანმიმდევრობით: 0.2 მლ ნიმუში (ან PDB კულტურის ფილტრატი ან მჟაუნას მჟავას სტანდარტული ხსნარი), 0.11 მლ ბრომოფენოლის ლურჯი (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, პიტსბურგი, პენსილვანია, აშშ), 0.198 მლ 1 M გოგირდმჟავა (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, კაირო, ეგვიპტე) და 0.176 მლ 100 mM კალიუმის დიქრომატი (K2Cr2O7; TCI chemicals, პორტლენდი, ორეგონი, აშშ), შემდეგ ხსნარი განზავდა 4.8 მლ-მდე გამოხდილი წყლით, ენერგიულად შეურიეს და დაუყოვნებლივ მოათავსეს 60°C ტემპერატურის წყლის აბაზანაში. 10 წუთის შემდეგ, რეაქცია შეწყდა 0.5 მლ ნატრიუმის ჰიდროქსიდის ხსნარის (NaOH; 0.75 M) დამატებით. რეაქციის ნარევის შთანთქმა (A600) გაიზომა 600 ნმ-ზე UV-160 სპექტროფოტომეტრის (Shimadzu Corporation, იაპონია) გამოყენებით. კულტურის ფილტრატებისა და მცენარის ნიმუშების რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის, შესაბამისად, გამოყენებული იქნა PDB და გამოხდილი წყალი. კულტურის ფილტრატებში მჟაუნას მჟავას კონცენტრაციები, გამოხატული მჟაუნას მჟავას მიკროგრამებში PDB გარემოს მილილიტრზე (μg.mL−1), და ფოთლის ექსტრაქტებში, გამოხატული მჟაუნას მჟავას მიკროგრამებში სუფთა წონის გრამზე (μg.g−1 FW), განისაზღვრა მჟაუნას მჟავას კალიბრაციის მრუდის გამოყენებით (Thermo Fisher Scientific Chemicals, უოლტჰემი, მასაჩუსეტსი, აშშ).
კვლევის განმავლობაში, ყველა ექსპერიმენტი შემუშავებული იყო სრულიად რანდომიზებული დიზაინით (CRD), ექვსი ბიოლოგიური რეპლიკაციით თითო დამუშავებაზე და ხუთი ქოთნით თითო ბიოლოგიურ რეპლიკაზე (ორი მცენარე თითო ქოთანზე), თუ სხვა რამ არ არის მითითებული. ბიოლოგიური რეპლიკები გაანალიზდა დუბლიკატებში (ორი ტექნიკური რეპლიკატი). ტექნიკური რეპლიკები გამოყენებული იქნა ერთი და იგივე ექსპერიმენტის რეპროდუცირებადობის შესამოწმებლად, მაგრამ არ იქნა გამოყენებული სტატისტიკურ ანალიზში ცრუ რეპლიკაციების თავიდან ასაცილებლად. მონაცემები სტატისტიკურად გაანალიზდა ვარიაციის ანალიზის (ANOVA) გამოყენებით, რასაც მოჰყვა ტუკი-კრამერის გულწრფელად მნიშვნელოვანი სხვაობის (HSD) ტესტი (p ≤ 0.05). ინ ვიტრო ექსპერიმენტებისთვის, IC50 და IC99 მნიშვნელობები გამოითვალა პრობიტის მოდელის გამოყენებით და გამოითვალა 95%-იანი სანდოობის ინტერვალები.
ეგვიპტის ელ-ღაბიას პროვინციაში, სოიოს სხვადასხვა მინდვრიდან სულ ოთხი იზოლატი შეგროვდა. PDA გარემოზე ყველა იზოლატმა წარმოქმნა კრემისებრი თეთრი მიცელიუმი, რომელიც სწრაფად გადაიქცა ბამბისფერ-თეთრ ფერში (სურათი 1A), შემდეგ კი სკლეროციუმის სტადიაზე კრემისფერი ან ყავისფერი. სკლეროციები, როგორც წესი, მკვრივი, შავი, სფერული ან არარეგულარული ფორმისაა, 5.2-დან 7.7 მმ-მდე სიგრძისა და 3.4-დან 5.3 მმ-მდე დიამეტრის (სურათი 1B). მიუხედავად იმისა, რომ ოთხ იზოლატს განუვითარდა სკლეროციების მარგინალური ნიმუში კულტურული გარემოს კიდეზე 10-12 დღიანი ინკუბაციის შემდეგ 25 ± 2 °C ტემპერატურაზე (სურათი 1A), სკლეროციების რაოდენობა თითო ფირფიტაზე მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდა მათ შორის (P < 0.001), სადაც იზოლატ 3-ს ჰქონდა სკლეროციების ყველაზე მაღალი რაოდენობა (32.33 ± 1.53 სკლეროცია თითო ფირფიტაზე; სურ. 1C). ანალოგიურად, იზოლატ #3-მა PDB-ში სხვა იზოლატებთან შედარებით მეტი მჟაუნას მჟავა გამოიმუშავა (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; სურ. 1D). იზოლატ #3-მა ფიტოპათოგენური სოკოს, Sclerotinia sclerotiorum-ის, ტიპური მორფოლოგიური და მიკროსკოპული მახასიათებლები აჩვენა. მაგალითად, PDA-ზე, იზოლატ #3-ის კოლონიები სწრაფად იზრდებოდა, იყო კრემისფერი თეთრი (სურათი 1A), შებრუნებული კრემისფერი ან ღია ორაგულისფერი ყვითელ-ყავისფერი და 9 სმ დიამეტრის ფირფიტის ზედაპირის სრულად დასაფარად 6-7 დღე სჭირდებოდა 25 ± 2°C ტემპერატურაზე. ზემოთ აღნიშნული მორფოლოგიური და მიკროსკოპული მახასიათებლების საფუძველზე, იზოლატი #3 იდენტიფიცირებული იქნა, როგორც Sclerotinia sclerotiorum.
სურათი 1. გავრცელებული პარკოსანი კულტურებიდან აღებული S. sclerotiorum იზოლატების მახასიათებლები და პათოგენურობა. (A) S. sclerotiorum-ის ოთხი იზოლატის მიცელიუმის ზრდა PDA გარემოზე, (B) S. sclerotiorum-ის ოთხი იზოლატის სკლეროციები, (C) სკლეროციების რაოდენობა (თითო ფირფიტაზე), (D) მჟაუნას მჟავას სეკრეცია PDB გარემოზე (μg.mL−1) და (E) S. sclerotiorum-ის ოთხი იზოლატის დაავადების სიმძიმე (%) მგრძნობიარე კომერციული პარკოსანი მცენარის ჯიშ Giza 3-ზე სათბურის პირობებში. მნიშვნელობები წარმოადგენს ხუთი ბიოლოგიური რეპლიკაციების საშუალო ± სტანდარტული გადახრას (n = 5). სხვადასხვა ასო მიუთითებს სტატისტიკურად მნიშვნელოვან განსხვავებებზე დამუშავებებს შორის (p < 0.05). (F–H) თეთრი ობის ტიპური სიმპტომები გამოვლინდა შესაბამისად მიწისზედა ღეროებსა და სილიკებზე, იზოლატი #3-ით ინოკულაციიდან 10 დღის შემდეგ (dpi). (I) S. sclerotiorum იზოლატის #3 შიდა ტრანსკრიფციული სპეისერის (ITS) რეგიონის ევოლუციური ანალიზი ჩატარდა მაქსიმალური ალბათობის მეთოდის გამოყენებით და შედარდა ბიოტექნოლოგიური ინფორმაციის ეროვნული ცენტრის (NCBI) მონაცემთა ბაზიდან (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) მიღებულ 20 საცნობარო იზოლატთან/შტამთან. კლასტერიზაციის ხაზების ზემოთ მოცემული რიცხვები მიუთითებს რეგიონის დაფარვას (%), ხოლო კლასტერიზაციის ხაზების ქვემოთ მოცემული რიცხვები მიუთითებს ტოტის სიგრძეზე.
გარდა ამისა, პათოგენურობის დასადასტურებლად, მიღებული S. sclerotiorum-ის ოთხი იზოლატი გამოყენებული იქნა მგრძნობიარე კომერციული ლობიოს ჯიშის, Giza 3-ის, სათბურის პირობებში ინოკულაციისთვის, რაც შეესაბამება კოხის პოსტულატებს (სურ. 1E). მიუხედავად იმისა, რომ მიღებული ყველა სოკოვანი იზოლატი პათოგენური იყო და შეეძლო მწვანე ლობიოს (cv. Giza 3) დაინფიცირება, რამაც გამოიწვია თეთრი ობის ტიპური სიმპტომები ყველა მიწისზედა ნაწილზე (სურ. 1F), განსაკუთრებით ღეროებზე (სურ. 1G) და პარკებზე (სურ. 1H) ინოკულაციიდან 10 დღის შემდეგ (dpi), იზოლატი 3 ყველაზე აგრესიული იზოლატი იყო ორ დამოუკიდებელ ექსპერიმენტში. იზოლატ 3-ს ჰქონდა დაავადების ყველაზე მაღალი სიმძიმე (%) ლობიოს მცენარეებზე (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0 და 76.7 ± 3.1 ინფექციიდან 7, 14 და 21 დღის შემდეგ, შესაბამისად; სურათი 1F).
ყველაზე ინვაზიური S. sclerotiorum იზოლატის #3 იზოლატის იდენტიფიკაცია დამატებით დადასტურდა შიდა ტრანსკრიფციული სპეისერის (ITS) სეკვენირების საფუძველზე (სურ. 1I). იზოლატ #3-სა და 20 საცნობარო იზოლატს/შტამს შორის ფილოგენეტიკურმა ანალიზმა აჩვენა მათ შორის მაღალი მსგავსება (>99%). აღსანიშნავია, რომ S. sclerotiorum იზოლატ #3-ს (533 bp) მაღალი მსგავსება აქვს ამერიკულ S. sclerotiorum იზოლატ LPM36-თან, რომელიც იზოლირებულია მშრალი ბარდის თესლიდან (GenBank-ის სააბონენტო ნომერი MK896659.1; 540 bp) და ჩინურ S. sclerotiorum იზოლატ YKY211-თან (GenBank-ის სააბონენტო ნომერი OR206374.1; 548 bp), რომელიც იწვევს იისფერ (Matthiola incana) ღეროს ლპობას, რომელთაგან ყველა ცალკეა დაჯგუფებული დენდროგრამის ზედა ნაწილში (სურათი 1I). ახალი თანმიმდევრობა განთავსებულია NCBI მონაცემთა ბაზაში და მას სახელი მიენიჭა „Sclerotinia sclerotiorum – იზოლატი YN-25“ (GenBank-ის სააბონენტო ნომერი PV202792). ჩანს, რომ იზოლატი 3 ყველაზე ინვაზიური იზოლატია; შესაბამისად, ეს იზოლატი შეირჩა ყველა შემდგომ ექსპერიმენტში შესასწავლად.
დიამინ L-ორნიტინის (Sigma-Aldrich, Darmstadt, გერმანია) ანტიბაქტერიული აქტივობა სხვადასხვა კონცენტრაციით (12.5, 25, 50, 75, 100 და 125 მგ/ლ) S. sclerotiorum იზოლატ 3-ის წინააღმდეგ შესწავლილ იქნა in vitro. აღსანიშნავია, რომ L-ორნიტინმა ანტიბაქტერიული ეფექტი გამოავლინა და თანდათანობით აფერხებდა S. sclerotiorum ჰიფების რადიალურ ზრდას დოზადამოკიდებული გზით (სურათი 2A, B). ყველაზე მაღალი ტესტირებული კონცენტრაციით (125 მგ/ლ), L-ორნიტინმა აჩვენა მიცელიუმის ზრდის ინჰიბირების ყველაზე მაღალი მაჩვენებელი (99.62 ± 0.27%; სურათი 2B), რაც ექვივალენტური იყო კომერციული ფუნგიციდის Rizolex-T-ის (ინჰიბირების მაჩვენებელი 99.45 ± 0.39%; სურათი 2C) ყველაზე მაღალი ტესტირებული კონცენტრაციით (10 მგ/ლ), რაც მიუთითებს მსგავს ეფექტურობაზე.
სურათი 2. L-ორნიტინის in vitro ანტიბაქტერიული აქტივობა Sclerotinia sclerotiorum-ის წინააღმდეგ. (A) L-ორნიტინის სხვადასხვა კონცენტრაციის ანტიბაქტერიული აქტივობის შედარება S. sclerotiorum-ის წინააღმდეგ კომერციულ ფუნგიციდ Rizolex-T-სთან (10 მგ/ლ). (B, C) S. sclerotiorum-ის მიცელიუმის ზრდის ინჰიბირების მაჩვენებელი (%) L-ორნიტინის სხვადასხვა კონცენტრაციით (12.5, 25, 50, 75, 100 და 125 მგ/ლ) ან Rizolex-T-ით (2, 4, 6, 8 და 10 მგ/ლ) დამუშავების შემდეგ, შესაბამისად. მნიშვნელობები წარმოადგენს ხუთი ბიოლოგიური რეპლიკის საშუალო ± სტანდარტული გადახრას (n = 5). სხვადასხვა ასო აღნიშნავს დამუშავებებს შორის სტატისტიკურ განსხვავებებს (p < 0.05). (D, E) L-ორნიტინის და კომერციული ფუნგიციდის Rizolex-T-ის Probit მოდელის რეგრესიული ანალიზი, შესაბამისად. პრობიტის მოდელის რეგრესიის ხაზი ნაჩვენებია უწყვეტი ლურჯი ხაზით, ხოლო ნდობის ინტერვალი (95%) - წყვეტილი წითელი ხაზით.
გარდა ამისა, ჩატარდა პრობიტ რეგრესიული ანალიზი და შესაბამისი დიაგრამები ნაჩვენებია ცხრილში 1 და ნახაზებში 2D,E. მოკლედ, L-ორნიტინის მისაღები დახრილობის მნიშვნელობა (y = 2.92x − 4.67) და მასთან დაკავშირებული მნიშვნელოვანი სტატისტიკა (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 და p < 0.0001; სურათი 2D) მიუთითებდა გაძლიერებულ სოკოს საწინააღმდეგო აქტივობაზე S. sclerotiorum-ის წინააღმდეგ კომერციულ ფუნგიციდ Rizolex-T-სთან შედარებით (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 და p < 0.0001) (ცხრილი 1).
ცხრილი 1. L-ორნიტინის და S. sclerotiorum-ის წინააღმდეგ კომერციული ფუნგიციდის „რიზოლექს-T“-ის ნახევარმაქსიმალური ინჰიბიტორული კონცენტრაციის (IC50) და IC99 (მგ/ლ) მნიშვნელობები.
საერთო ჯამში, L-ორნიტინმა (250 მგ/ლ) მნიშვნელოვნად შეამცირა თეთრი ობის განვითარება და სიმძიმე დამუშავებულ ჩვეულებრივ ლობიოს მცენარეებზე, დაუმუშავებელ S. sclerotiorum-ით ინფიცირებულ მცენარეებთან შედარებით (კონტროლი; სურათი 3A). მოკლედ, მიუხედავად იმისა, რომ დაუმუშავებელი ინფიცირებული საკონტროლო მცენარეების დაავადების სიმძიმე თანდათან გაიზარდა (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61 და 92.33 ± 3.06%), L-ორნიტინმა მნიშვნელოვნად შეამცირა დაავადების სიმძიმე (%) მთელი ექსპერიმენტის განმავლობაში (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00 და 26.36 ± 3.07) დამუშავებიდან 7, 14 და 21 დღის შემდეგ, შესაბამისად (სურათი 3A). ანალოგიურად, როდესაც S. sclerotiorum-ით ინფიცირებული ლობიოს მცენარეები დამუშავდა 250 მგ/ლ L-ორნიტინით, დაავადების პროგრესირების მრუდის ქვეშ არსებული ფართობი (AUDPC) შემცირდა 1274.33 ± 33.13-დან დაუმუშავებელ საკონტროლო ჯგუფში 281.03 ± 7.95-მდე, რაც ოდნავ დაბალი იყო, ვიდრე დადებითი კონტროლის 50 მგ/ლ Rizolex-T ფუნგიციდის მაჩვენებელი (183.61 ± 7.71; სურ. 3B). იგივე ტენდენცია დაფიქსირდა მეორე ექსპერიმენტში.
სურ. 3. L-ორნიტინის ეგზოგენური გამოყენების გავლენა სათბურის პირობებში Sclerotinia sclerotiorum-ით გამოწვეული ჩვეულებრივი ლობიოს თეთრი ლპობის განვითარებაზე. (A) ჩვეულებრივი ლობიოს თეთრი ობის დაავადების პროგრესირების მრუდი 250 მგ/ლ L-ორნიტინით დამუშავების შემდეგ. (B) ჩვეულებრივი ლობიოს თეთრი ობის დაავადების პროგრესირების მრუდის ქვეშ არსებული ფართობი (AUDPC) L-ორნიტინით დამუშავების შემდეგ. მნიშვნელობები წარმოადგენს ხუთი ბიოლოგიური რეპლიკის (n = 5) საშუალო ± სტანდარტული გადახრას. სხვადასხვა ასო აღნიშნავს დამუშავებებს შორის სტატისტიკურად მნიშვნელოვან განსხვავებებს (p < 0.05).
250 მგ/ლ L-ორნიტინის ეგზოგენური გამოყენება 42 დღის შემდეგ თანდათან ზრდიდა მცენარის სიმაღლეს (სურ. 4A), ტოტების რაოდენობას მცენარეზე (სურ. 4B) და ფოთლების რაოდენობას მცენარეზე (სურ. 4C). მიუხედავად იმისა, რომ კომერციულ ფუნგიციდ Rizolex-T-ს (50 მგ/ლ) ყველაზე დიდი გავლენა ჰქონდა ყველა შესწავლილ კვებით პარამეტრზე, 250 მგ/ლ L-ორნიტინის ეგზოგენურ გამოყენებას მეორე უდიდესი ეფექტი ჰქონდა დაუმუშავებელ საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (სურ. 4A–C). მეორეს მხრივ, L-ორნიტინით დამუშავებას მნიშვნელოვანი გავლენა არ მოუხდენია ფოტოსინთეზური პიგმენტების ქლოროფილ a-ს (სურ. 4D) და ქლოროფილ b-ს (სურ. 4E) შემცველობაზე, მაგრამ ოდნავ გაზარდა კაროტინოიდების საერთო შემცველობა (0.56 ± 0.03 მგ/გ წონაზე) უარყოფით კონტროლთან (0.44 ± 0.02 მგ/გ წონაზე) და დადებით კონტროლთან (0.46 ± 0.02 მგ/გ წონაზე; სურ. 4F) შედარებით. საერთო ჯამში, ეს შედეგები მიუთითებს, რომ L-ორნიტინი არ არის ფიტოტოქსიკური დამუშავებული პარკოსნებისთვის და შესაძლოა მათი ზრდის სტიმულირებაც კი.
სურ. 4. ეგზოგენური L-ორნიტინის გამოყენების გავლენა Sclerotinia sclerotiorum-ით ინფიცირებული ლობიოს ფოთლების ზრდის მახასიათებლებსა და ფოტოსინთეზურ პიგმენტებზე სათბურის პირობებში. (A) მცენარის სიმაღლე (სმ), (B) ტოტების რაოდენობა მცენარეზე, (C) ფოთლების რაოდენობა მცენარეზე, (D) ქლოროფილ a-ს შემცველობა (მგ გ-1 წონა), (E) ქლოროფილ b-ს შემცველობა (მგ გ-1 წონა), (F) კაროტინოიდების საერთო შემცველობა (მგ გ-1 წონა). მნიშვნელობები წარმოადგენს ხუთი ბიოლოგიური რეპლიკის (n = 5) საშუალო ± სტანდარტული გადახრას. სხვადასხვა ასო მიუთითებს დამუშავებებს შორის სტატისტიკურად მნიშვნელოვან განსხვავებებზე (p < 0.05).
რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების (ROS; გამოხატული წყალბადის ზეჟანგით [H2O2]) და თავისუფალი რადიკალების (გამოხატული სუპეროქსიდის ანიონებით [O2•−]) in situ ჰისტოქიმიურმა ლოკალიზაციამ აჩვენა, რომ L-ორნიტინის (250 მგ/ლ) ეგზოგენური გამოყენება მნიშვნელოვნად ამცირებს H2O2-ის (96.05 ± 5.33 ნმოლ.გ−1 FW; სურ. 5A) და O2•−-ის (32.69 ± 8.56 ნმოლ.გ−1 FW; სურ. 5B) დაგროვებას როგორც დაუმუშავებელი ინფიცირებული მცენარეების (შესაბამისად, 173.31 ± 12.06 და 149.35 ± 7.94 ნმოლ.გ−1 FW) და კომერციული ფუნგიციდით Rizolex-T-ით (შესაბამისად, 170.12 ± 9.50 და 157.00 ± 7.81 ნმოლ.გ−1 წონით) 50 მგ/ლ დამუშავებულ მცენარეებთან შედარებით 72 საათის შემდეგ. H2O2-ის და O2•−-ის მაღალი დონეები დაგროვდა hpt-ის ზემოქმედების ქვეშ (სურ. 5A, B). ანალოგიურად, TCA-ზე დაფუძნებულმა მალონდიალდეჰიდის (MDA) ანალიზმა აჩვენა, რომ S. sclerotiorum-ით ინფიცირებულ ლობიოს მცენარეებში ფოთლებში დააგროვეს MDA-ს უფრო მაღალი დონე (113.48 ± 10.02 ნმოლ.გ წონაზე) (სურ. 5C). თუმცა, L-ორნიტინის ეგზოგენურმა გამოყენებამ მნიშვნელოვნად შეამცირა ლიპიდების პეროქსიდაცია, რასაც ადასტურებს დამუშავებულ მცენარეებში MDA-ს შემცველობის შემცირება (33.08 ± 4.00 ნმოლ.გ წონაზე).
სურ. 5. ეგზოგენური L-ორნიტინის გამოყენების გავლენა ოქსიდაციური სტრესის ძირითად მარკერებზე და არაფერმენტულ ანტიოქსიდანტურ თავდაცვის მექანიზმებზე S. sclerotiorum-ით ინფიცირებულ ლობიოს ფოთლებში ინფექციიდან 72 საათის შემდეგ სათბურის პირობებში. (A) წყალბადის ზეჟანგი (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt-ზე, (B) სუპეროქსიდის ანიონი (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt-ზე, (C) მალონდიალდეჰიდი (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt-ზე, (D) ხსნადი ფენოლების საერთო რაოდენობა (მგ GAE g−1 FW) 72 hpt-ზე, (E) ხსნადი ფლავონოიდების საერთო რაოდენობა (მგ RE g−1 FW) 72 hpt-ზე, (F) თავისუფალი ამინომჟავების საერთო რაოდენობა (მგ g−1 FW) 72 hpt-ზე და (G) პროლინის შემცველობა (მგ g−1 FW) 72 hpt-ზე. მნიშვნელობები წარმოადგენს 5 ბიოლოგიური რეპლიკის (n = 5) საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას (საშუალო ± სტანდარტული გადახრა). სხვადასხვა ასო მიუთითებს დამუშავებებს შორის სტატისტიკურად მნიშვნელოვან განსხვავებებზე (p < 0.05).