ჩვენ ადრე გამოვაქვეყნეთ ინფორმაცია, რომ ნაწლავიდან მიღებული ტრიპტოფანის მეტაბოლიტის, ინდოლ-3-პროპიონის მჟავის (IPA) შრატის დონე უფრო დაბალია ღვიძლის ფიბროზის მქონე პაციენტებში. ამ კვლევაში ჩვენ გამოვიკვლიეთ ტრანსკრიპტომი და დნმ მეთილომი სიმსუქნით დაავადებულ ღვიძლებში IPA-ს შრატის დონესთან მიმართებაში, ასევე IPA-ს როლი ღვიძლის ვარსკვლავისებრი უჯრედების (HSCs) ფენოტიპური ინაქტივაციის ინდუცირებაში in vitro.
კვლევაში მონაწილეობდა 116 სიმსუქნით დაავადებული პაციენტი, რომლებსაც არ აღენიშნებოდათ მე-2 ტიპის შაქრიანი დიაბეტი (T2DM) (ასაკი 46.8 ± 9.3 წელი; BMI: 42.7 ± 5.0 კგ/მ²), რომლებსაც ჩაუტარდათ ბარიატრიული ოპერაცია კუოპიოს ბარიატრიულ ქირურგიულ ცენტრში (KOBS). მოცირკულირე IPA-ს დონე გაიზომა თხევადი ქრომატოგრაფიით-მას-სპექტრომეტრიით (LC-MS), ღვიძლის ტრანსკრიპტომის ანალიზი ჩატარდა რნმ-ის სრული სეკვენირებით, ხოლო დნმ-ის მეთილირების ანალიზი ჩატარდა Infinium HumanMethylation450 BeadChip-ის გამოყენებით. in vitro ექსპერიმენტებისთვის გამოყენებული იქნა ადამიანის ღვიძლის ვარსკვლავური უჯრედები (LX-2).
შრატის IPA-ს დონე კორელაციაში იყო ღვიძლში აპოპტოზურ, მიტოფაგიურ და დღეგრძელობის გზებში ჩართული გენების ექსპრესიასთან. AKT სერინ/თრეონინ კინაზა 1 (AKT1) გენი იყო ყველაზე გავრცელებული და დომინანტური ურთიერთქმედების მქონე გენი ღვიძლის ტრანსკრიპტისა და დნმ-ის მეთილირების პროფილებში. IPA-თი მკურნალობა იწვევდა აპოპტოზს, მიტოქონდრიული სუნთქვის შემცირებას და უჯრედების მორფოლოგიისა და მიტოქონდრიული დინამიკის შეცვლას იმ გენების ექსპრესიის მოდულირებით, რომლებიც ცნობილია ფიბროზის, აპოპტოზისა და LX-2 უჯრედების გადარჩენის რეგულირებით.
ერთად აღებული, ეს მონაცემები ადასტურებს, რომ IPA-ს აქვს პოტენციური თერაპიული ეფექტები და შეუძლია აპოპტოზის გამოწვევა და HSC ფენოტიპის არააქტიური მდგომარეობისკენ გადატანა, რითაც აფართოებს ღვიძლის ფიბროზის ინჰიბირების შესაძლებლობას HSC აქტივაციისა და მიტოქონდრიული მეტაბოლიზმის ჩარევით.
სიმსუქნისა და მეტაბოლური სინდრომის გავრცელება დაკავშირებულია მეტაბოლურად ასოცირებული ცხიმოვანი ღვიძლის დაავადების (MASLD) მზარდ შემთხვევებისთან; დაავადება აზიანებს ზოგადი პოპულაციის 25%-დან 30%-მდე [1]. MASLD ეტიოლოგიის მთავარი შედეგია ღვიძლის ფიბროზი, დინამიური პროცესი, რომელიც ხასიათდება ბოჭკოვანი უჯრედგარე მატრიქსის (ECM) უწყვეტი დაგროვებით [2]. ღვიძლის ფიბროზში მონაწილე ძირითადი უჯრედებია ღვიძლის ვარსკვლავისებრი უჯრედები (HSCs), რომლებიც ავლენენ ოთხ ცნობილ ფენოტიპს: მოსვენებული, გააქტიურებული, ინაქტივირებული და დაბერებული [3, 4]. HSC-ების გააქტიურება და ტრანსდიფერენციაცია მოსვენებული ფორმიდან პროლიფერაციულ ფიბრობლასტის მსგავს უჯრედებად მაღალი ენერგეტიკული მოთხოვნილებით, α-გლუვი კუნთების აქტინის (α-SMA) და I ტიპის კოლაგენის (Col-I) გაზრდილი ექსპრესიით [5, 6]. ღვიძლის ფიბროზის უკუქცევის დროს, გააქტიურებული HSC-ები გამოიყოფა აპოპტოზის ან ინაქტივაციის გზით. ეს პროცესები მოიცავს ფიბროგენული გენების დაქვეითებულ რეგულაციას და პრო-გადარჩენის გენების მოდულაციას (როგორიცაა NF-κB და PI3K/Akt სასიგნალო გზები) [7, 8], ასევე მიტოქონდრიული დინამიკისა და ფუნქციის ცვლილებებს [9].
ნაწლავში გამომუშავებული ტრიპტოფანის მეტაბოლიტის, ინდოლ-3-პროპიონის მჟავის (IPA) შრატის დონე შემცირებულია ადამიანის მეტაბოლური დაავადებების, მათ შორის MASLD-ის დროს [10–13]. IPA ასოცირდება საკვები ბოჭკოების მიღებასთან, ცნობილია თავისი ანტიოქსიდანტური და ანთების საწინააღმდეგო ეფექტებით და ასუსტებს დიეტით გამოწვეულ არაალკოჰოლური სტეატოჰეპატიტის (NASH) ფენოტიპს in vivo და in vitro [11–14]. ზოგიერთი მტკიცებულება მომდინარეობს ჩვენი წინა კვლევიდან, რომელმაც აჩვენა, რომ შრატში IPA-ს დონე უფრო დაბალი იყო ღვიძლის ფიბროზის მქონე პაციენტებში, ვიდრე სიმსუქნით დაავადებულ პაციენტებში ღვიძლის ფიბროზის გარეშე, კუოპიოს ბარიატრიული ქირურგიის კვლევაში (KOBS). გარდა ამისა, ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ IPA-თი მკურნალობას შეუძლია შეამციროს იმ გენების ექსპრესია, რომლებიც წარმოადგენენ უჯრედების ადჰეზიის, უჯრედების მიგრაციის და ჰემატოპოეტური ღეროვანი უჯრედების აქტივაციის კლასიკურ მარკერებს ადამიანის ღვიძლის ვარსკვლავური უჯრედების (LX-2) მოდელში და წარმოადგენს პოტენციურ ჰეპატოპროტექტორულ მეტაბოლიტს [15]. თუმცა, გაურკვეველი რჩება, თუ როგორ იწვევს IPA ღვიძლის ფიბროზის რეგრესიას HSC აპოპტოზის და მიტოქონდრიული ბიოენერგეტიკის გააქტიურებით.
აქ ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ შრატის IPA ასოცირდება სიმსუქნით დაავადებული, მაგრამ არა ტიპი 2 დიაბეტით დაავადებული პირების ღვიძლში აპოპტოზის, მიტოფაგიის და სიცოცხლის ხანგრძლივობის გზებით გამდიდრებული გენების ექსპრესიასთან. გარდა ამისა, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ IPA-ს შეუძლია ინაქტივაციის გზით გამოიწვიოს აქტივირებული ჰემატოპოეტური ღეროვანი უჯრედების (HSCs) კლირენსი და დეგრადაცია. ეს შედეგები ავლენს IPA-ს ახალ როლს, რაც მას ღვიძლის ფიბროზის რეგრესიის ხელშეწყობის პოტენციურ თერაპიულ სამიზნედ აქცევს.
KOBS კოჰორტაში ჩატარებულმა წინა კვლევამ აჩვენა, რომ ღვიძლის ფიბროზის მქონე პაციენტებს ღვიძლის ფიბროზის არმქონე პაციენტებთან შედარებით სისხლში IPA-ს უფრო დაბალი დონე ჰქონდათ [15]. მე-2 ტიპის დიაბეტის პოტენციური შემააშრიალებელი ეფექტის გამოსარიცხად, მიმდინარე KOBS კვლევიდან კვლევის პოპულაციად [16] ავიყვანეთ 116 სიმსუქნით დაავადებული პაციენტი მე-2 ტიპის დიაბეტის არმქონე (საშუალო ასაკი ± სტანდარტული გადახრა: 46.8 ± 9.3 წელი; BMI: 42.7 ± 5.0 კგ/მ2) (ცხრილი 1). ყველა მონაწილემ წერილობითი ინფორმირებული თანხმობა განაცხადა და კვლევის პროტოკოლი დამტკიცდა ჩრდილოეთ სავოს ოლქის საავადმყოფოს ეთიკის კომიტეტის მიერ ჰელსინკის დეკლარაციის (54/2005, 104/2008 და 27/2010) შესაბამისად.
ღვიძლის ბიოფსიის ნიმუშები აღებული იქნა ბარიატრიული ოპერაციის დროს და ჰისტოლოგიურად შეფასდა გამოცდილი პათოლოგების მიერ ადრე აღწერილი კრიტერიუმების მიხედვით [17, 18]. შეფასების კრიტერიუმები შეჯამებულია დამატებით ცხრილში S1 და აღწერილია ადრე [19].
უზმოზე აღებული შრატის ნიმუშები მეტაბოლომიკური ანალიზისთვის გაანალიზდა არამიზნობრივი თხევადი ქრომატოგრაფიით-მას-სპექტრომეტრიით (LC-MS) (n = 116). ნიმუშები გაანალიზდა UHPLC-qTOF-MS სისტემის გამოყენებით (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany), როგორც ადრე იყო აღწერილი19. იზოპროპილის სპირტის (IPA) იდენტიფიკაცია ეფუძნებოდა შეკავების დროს და MS/MS სპექტრის შედარებას სუფთა სტანდარტებთან. IPA სიგნალის ინტენსივობა (პიკის ფართობი) გათვალისწინებული იყო ყველა შემდგომ ანალიზში [20].
მთელი ღვიძლის რნმ-ის სეკვენირება ჩატარდა Illumina HiSeq 2500-ის გამოყენებით და მონაცემები წინასწარ დამუშავდა ადრე აღწერილი მეთოდით [19, 21, 22]. ჩვენ ჩავატარეთ მიტოქონდრიულ ფუნქციაზე/ბიოგენეზზე მოქმედი ტრანსკრიპტების მიზნობრივი დიფერენციალური ექსპრესიის ანალიზი MitoMiner 4.0 მონაცემთა ბაზიდან შერჩეული 1957 გენის გამოყენებით [23]. ღვიძლის დნმ-ის მეთილირების ანალიზი ჩატარდა Infinium HumanMethylation450 BeadChip-ის (Illumina, სან დიეგო, კალიფორნია, აშშ) გამოყენებით, იგივე მეთოდოლოგიის გამოყენებით, რაც ადრე იყო აღწერილი [24, 25].
ადამიანის ღვიძლის ვარსკვლავისებრი უჯრედები (LX-2) კეთილგანწყობილი სახით მოგვაწოდა პროფესორმა სტეფანო რომეომ და მათი კულტივაცია და შენახვა მოხდა DMEM/F12 გარემოში (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). IPA-ს სამუშაო დოზის შესარჩევად, LX-2 უჯრედები დამუშავდა IPA-ს სხვადასხვა კონცენტრაციით (10 μM, 100 μM და 1 mM; Sigma, 220027) DMEM/F12 გარემოში 24 საათის განმავლობაში. გარდა ამისა, IPA-ს მიერ HSC-ების ინაქტივაციის უნარის შესასწავლად, LX-2 უჯრედები თანადამუშავდა 5 ნგ/მლ TGF-β1-ით (R&D systems, 240-B-002/CF) და 1 mM IPA-თი შრატისგან თავისუფალ გარემოში 24 საათის განმავლობაში. შესაბამისი გამხსნელის კონტროლისთვის, TGF-β1 მკურნალობისთვის გამოყენებული იქნა 0.1% BSA-ს შემცველი 4 nM HCL, ხოლო IPA მკურნალობისთვის - 0.05% DMSO, ხოლო კომბინირებული მკურნალობისთვის ორივე ერთად იქნა გამოყენებული.
აპოპტოზი შეფასდა FITC ანექსინ V აპოპტოზის დეტექციის ნაკრების გამოყენებით 7-AAD-ით (Biolegend, სან დიეგო, კალიფორნია, აშშ, კატ. #640922) მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად. მოკლედ, LX-2 (1 × 105 უჯრედი/ჭაბურღილი) კულტივირებული იქნა მთელი ღამის განმავლობაში 12-ჭაბურღილიან ფირფიტებში და შემდეგ დამუშავდა IPA-ს ან IPA-ს და TGF-β1-ის მრავალჯერადი დოზებით. მომდევნო დღეს, მცურავი და ადჰეზიური უჯრედები შეგროვდა, ტრიფსინიზებული იქნა, გარეცხილი იქნა PBS-ით, რესუსპენდირებული იქნა ანექსინ V შემაკავშირებელ ბუფერში და ინკუბირებული იქნა FITC-ანექსინ V-თან და 7-AAD-თან 15 წუთის განმავლობაში.
ცოცხალ უჯრედებში მიტოქონდრიები შეღებილი იქნა ჟანგვითი აქტივობისთვის Mitotracker™ Red CMXRos (MTR)-ის (Thermo Fisher Scientific, კარლსბადი, კალიფორნია) გამოყენებით. MTR ანალიზებისთვის, LX-2 უჯრედები ინკუბირებული იქნა თანაბარი სიმკვრივით IPA-სთან და TGF-β1-თან. 24 საათის შემდეგ, ცოცხალი უჯრედები ტრიფსინიზებული იქნა, გარეცხილი იქნა PBS-ით და შემდეგ ინკუბირებული იქნა 100 μM MTR-ით შრატისგან თავისუფალ გარემოში 37°C ტემპერატურაზე 20 წუთის განმავლობაში, როგორც ადრე იყო აღწერილი [26]. ცოცხალი უჯრედის მორფოლოგიის ანალიზისთვის, უჯრედის ზომა და ციტოპლაზმური სირთულე გაანალიზდა შესაბამისად პირდაპირი გაფანტვის (FSC) და გვერდითი გაფანტვის (SSC) პარამეტრების გამოყენებით.
ყველა მონაცემი (30,000 მოვლენა) მიღებული იქნა NovoCyte Quanteon-ის (Agilent) გამოყენებით და გაანალიზდა NovoExpress® 1.4.1 ან FlowJo V.10 პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.
ჟანგბადის მოხმარების სიჩქარე (OCR) და უჯრედგარე მჟავიანობის სიჩქარე (ECAR) გაიზომა რეალურ დროში Seahorse-ის უჯრედგარე ნაკადის ანალიზატორის (Agilent Technologies, სანტა კლარა, კალიფორნია) გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო Seahorse XF Cell Mito Stress-ით მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად. მოკლედ, 2 × 104 LX-2 უჯრედი/ჭაბურღილი დაითესა XF96 უჯრედული კულტურის ფირფიტებზე. ღამის ინკუბაციის შემდეგ, უჯრედები დამუშავდა იზოპროპანოლით (IPA) და TGF-β1-ით (დამატებითი მეთოდები 1). მონაცემთა ანალიზი ჩატარდა Seahorse XF Wave პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით, რომელიც მოიცავს Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator-ს. აქედან გამოითვალა ბიოენერგეტიკული ჯანმრთელობის ინდექსი (BHI) [27].
მთლიანი რნმ ტრანსკრიფცირებული იქნა ცდნმ-ში. სპეციფიკური მეთოდებისთვის იხილეთ მითითება [15]. ადამიანის 60S რიბოსომული მჟავე ცილის P0 (RPLP0) და ციკლოფილინის A1 (PPIA) mRNA დონეები გამოყენებული იქნა როგორც კონსტიტუციური გენის კონტროლი. QuantStudio 6 pro რეალურ დროში PCR სისტემა (Thermo Fisher, Landsmeer, ნიდერლანდები) გამოყენებული იქნა TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit-თან (Applied Biosystems) ან Sensifast SYBR Lo-ROX Kit-თან (Bioline, BIO 94050) ერთად და გენის ფარდობითი ექსპრესიის დაკეცვა გამოითვალა შედარებითი Ct მნიშვნელობის ციკლირების პარამეტრების (ΔΔCt) და ΔΔCt მეთოდის გამოყენებით. პრაიმერების დეტალები მოცემულია დამატებით ცხრილებში S2 და S3.
ბირთვული დნმ (ncDNA) და მიტოქონდრიული დნმ (mtDNA) ექსტრაგირებული იქნა DNeasy-ის სისხლისა და ქსოვილის ნაკრების (Qiagen) გამოყენებით, როგორც ეს ადრე იყო აღწერილი [28]. mtDNA-ს ფარდობითი რაოდენობა გამოითვალა თითოეული სამიზნე mtDNA რეგიონის ბირთვული დნმ-ის სამი რეგიონის (mtDNA/ncDNA) გეომეტრიულ საშუალოსთან თანაფარდობის გამოთვლით, როგორც ეს დეტალურად არის აღწერილი დამატებით მეთოდებში 2. mtDNA-ს და ncDNA-ს პრაიმერების დეტალები მოცემულია დამატებით ცხრილში S4.
ცოცხალი უჯრედები შეღებილი იქნა Mitotracker™ Red CMXRos (MTR)-ით (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) უჯრედშორისი და უჯრედშიდა მიტოქონდრიული ქსელების ვიზუალიზაციისთვის. LX-2 უჯრედები (1 × 104 უჯრედი/ჭაბურღილი) კულტივირებული იქნა მინის სლაიდებზე შესაბამის მინის ფსკერიან კულტურულ ფირფიტებში (Ibidi GmbH, Martinsried, გერმანია). 24 საათის შემდეგ, ცოცხალი LX-2 უჯრედები ინკუბირებული იქნა 100 μM MTR-ით 20 წუთის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე და უჯრედის ბირთვები შეღებილი იქნა DAPI-ით (1 μg/მლ, Sigma-Aldrich), როგორც ადრე იყო აღწერილი [29]. მიტოქონდრიული ქსელები ვიზუალიზებული იქნა Zeiss Axio Observer ინვერტირებული მიკროსკოპის (Carl Zeiss Microimaging GmbH, იენა, გერმანია) გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო Zeiss LSM 800 კონფოკალური მოდულით 37°C ტემპერატურაზე ნოტიო ატმოსფეროში 5% CO2-ით, 63×NA 1.3 ობიექტივის გამოყენებით. თითოეული ნიმუშის ტიპისთვის ჩვენ მივიღეთ ათი Z-სერიის სურათი. თითოეული Z-სერია შეიცავს 30 სექციას, თითოეულის სისქე 9.86 μm. თითოეული ნიმუშისთვის, ათი სხვადასხვა ხედვის ველის გამოსახულება მიღებული იქნა ZEN 2009 პროგრამული უზრუნველყოფის (Carl Zeiss Microimaging GmbH, იენა, გერმანია) გამოყენებით, ხოლო მიტოქონდრიული მორფოლოგიის ანალიზი ჩატარდა ImageJ პროგრამული უზრუნველყოფის (v1.54d) [30, 31] გამოყენებით, დამატებით მეთოდებში 3 დეტალურად აღწერილი პარამეტრების შესაბამისად.
უჯრედები დააფიქსირეს 2%-იანი გლუტარალდეჰიდით 0.1 M ფოსფატურ ბუფერში, რასაც მოჰყვა ფიქსაცია 1%-იანი ოსმიუმის ტეტროქსიდის ხსნარით (Sigma Aldrich, MO, აშშ), თანდათანობით გაუწყლოეს აცეტონით (Merck, Darmstadt, გერმანია) და ბოლოს ჩასვეს ეპოქსიდური ფისით. ულტრათხელი მონაკვეთები მომზადდა და შეღებილი იქნა 1%-იანი ურანილის აცეტატით (Merck, Darmstadt, გერმანია) და 1%-იანი ტყვიის ციტრატით (Merck, Darmstadt, გერმანია). ულტრასტრუქტურული გამოსახულებები მიღებული იქნა JEM 2100F EXII გამტარი ელექტრონული მიკროსკოპის (JEOL Ltd, ტოკიო, იაპონია) გამოყენებით 80 კვ ამაჩქარებელი ძაბვით.
IPA-თი 24 საათის განმავლობაში დამუშავებული LX-2 უჯრედების მორფოლოგია გაანალიზდა ფაზურ-კონტრასტული მიკროსკოპიით 50-ჯერ გადიდებით Zeiss-ის ინვერტირებული სინათლის მიკროსკოპის გამოყენებით (Zeiss Axio Vert.A1 და AxioCam MRm, იენა, გერმანია).
კლინიკური მონაცემები გამოისახა საშუალო ± სტანდარტული გადახრის ან მედიანის სახით (კვარტილთაშორისი დიაპაზონი: IQR). სამ საკვლევ ჯგუფს შორის განსხვავებების შესადარებლად გამოყენებული იქნა ვარიაციის ცალმხრივი ანალიზი (უწყვეტი ცვლადები) ან χ² ტესტი (კატეგორიული ცვლადები). მრავლობითი ტესტირების კორექციისთვის გამოყენებული იქნა ცრუ დადებითი შედეგის მაჩვენებელი (FDR), ხოლო გენები FDR < 0.05-ით სტატისტიკურად მნიშვნელოვნად ჩაითვალა. CpG დნმ-ის მეთილირების IPA სიგნალის ინტენსივობასთან კორელაციისთვის გამოყენებული იქნა სპირმანის კორელაციის ანალიზი, სადაც დაფიქსირდა ნომინალური p მნიშვნელობები (p < 0.05).
გზის ანალიზი ჩატარდა ვებ-ზე დაფუძნებული გენების ნაკრების ანალიზის ინსტრუმენტის (WebGestalt) გამოყენებით 268 ტრანსკრიპტისთვის (ნომინალური p < 0.01), 119 მიტოქონდრიასთან ასოცირებული ტრანსკრიპტისთვის (ნომინალური p < 0.05) და 4350 CpG-სთვის 3093 ღვიძლის ტრანსკრიპტიდან, რომლებიც დაკავშირებული იყო მოცირკულირე IPA-ს დონესთან. გადაფარვის გენების მოსაძებნად გამოყენებული იქნა თავისუფლად ხელმისაწვდომი Venny DB (ვერსია 2.1.0) ინსტრუმენტი, ხოლო ცილა-ცილის ურთიერთქმედების ვიზუალიზაციისთვის - StringDB (ვერსია 11.5).
LX-2 ექსპერიმენტისთვის, ნიმუშები ნორმალურობაზე შემოწმდა დ’აგოსტინო-პირსონის ტესტის გამოყენებით. მონაცემები მიღებული იქნა მინიმუმ სამი ბიოლოგიური რეპლიკიდან და დაექვემდებარა ცალმხრივ ANOVA-ს ბონფერონის პოსტ ჰოკ ტესტით. 0.05-ზე ნაკლები p-მნიშვნელობა სტატისტიკურად მნიშვნელოვნად ჩაითვალა. მონაცემები წარმოდგენილია საშუალო ± სტანდარტული გადახრით და ექსპერიმენტების რაოდენობა მითითებულია თითოეულ ფიგურაში. ყველა ანალიზი და გრაფიკი ჩატარდა Windows-ისთვის განკუთვნილი GraphPad Prism 8 სტატისტიკური პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (GraphPad Software Inc., ვერსია 8.4.3, სან დიეგო, აშშ).
პირველ რიგში, ჩვენ გამოვიკვლიეთ შრატის IPA დონის კავშირი ღვიძლის, მთელი ორგანიზმის და მიტოქონდრიული ტრანსკრიპტებთან. ტრანსკრიპტის საერთო პროფილში, შრატის IPA დონესთან ასოცირებული ყველაზე ძლიერი გენი იყო MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; მიტოგენ-აქტივირებული ცილოვანი კინაზა-აქტივირებული ცილოვანი კინაზა 3); მიტოქონდრიასთან დაკავშირებულ ტრანსკრიპტის პროფილში, ყველაზე ძლიერი ასოცირებული გენი იყო AKT1 (FDR = 0.7621; AKT სერინ/თრეონინ კინაზა 1) (დამატებითი ფაილი 1 და დამატებითი ფაილი 2).
შემდეგ ჩვენ გავაანალიზეთ გლობალური ტრანსკრიპტები (n = 268; p < 0.01) და მიტოქონდრიასთან ასოცირებული ტრანსკრიპტები (n = 119; p < 0.05), საბოლოოდ აპოპტოზი ყველაზე მნიშვნელოვან კანონიკურ გზად გამოვავლინეთ (p = 0.0089). შრატის IPA-ს დონესთან ასოცირებული მიტოქონდრიული ტრანსკრიპტებისთვის, ჩვენ ყურადღება გავამახვილეთ აპოპტოზზე (FDR = 0.00001), მიტოფაგიაზე (FDR = 0.00029) და TNF სიგნალიზაციის გზებზე (FDR = 0.000006) (სურათი 1A, ცხრილი 2 და დამატებითი სურათები 1A-B).
ადამიანის ღვიძლში გლობალური, მიტოქონდრიასთან ასოცირებული ტრანსკრიპტებისა და დნმ-ის მეთილირების გადაფარვის ანალიზი შრატის IPA-ს დონეებთან დაკავშირებით. A წარმოადგენს 268 გლობალურ ტრანსკრიპტს, 119 მიტოქონდრიასთან ასოცირებულ ტრანსკრიპტს და დნმ-მეთილირებულ ტრანსკრიპტებს, რომლებიც მიმაგრებულია შრატის IPA-ს დონეებთან ასოცირებულ 3092 CpG უბანზე (p მნიშვნელობები < 0.01 გლობალური ტრანსკრიპტებისა და დნმ-მეთილირებულისთვის, ხოლო p მნიშვნელობები < 0.05 მიტოქონდრიული ტრანსკრიპტებისთვის). ძირითადი გადაფარვის ტრანსკრიპტები ნაჩვენებია შუაში (AKT1 და YKT6). B ყველაზე მაღალი ურთიერთქმედების ქულის (0.900) მქონე 13 გენის ურთიერთქმედების რუკა სხვა გენებთან აგებულია 56 გადაფარვის გენიდან (შავი ხაზის რეგიონი), რომლებიც მნიშვნელოვნად იყვნენ დაკავშირებული შრატის IPA-ს დონეებთან, ონლაინ ინსტრუმენტის StringDB-ის გამოყენებით. მწვანე: გენები მიმაგრებულია გენების ონტოლოგიის (GO) უჯრედულ კომპონენტთან: მიტოქონდრიასთან (GO:0005739). AKT1 არის ცილა, რომელსაც აქვს ყველაზე მაღალი ქულა (0.900) სხვა ცილებთან ურთიერთქმედებისთვის მონაცემებზე დაყრდნობით (ტექსტის მოპოვების, ექსპერიმენტების, მონაცემთა ბაზებისა და თანაექსპრესიის საფუძველზე). ქსელის კვანძები წარმოადგენს ცილებს, ხოლო კიდეები - ცილებს შორის კავშირებს.
ვინაიდან ნაწლავის მიკრობიოტას მეტაბოლიტებს შეუძლიათ ეპიგენეტიკური შემადგენლობის რეგულირება დნმ-ის მეთილირების გზით [32], ჩვენ გამოვიკვლიეთ, ასოცირდებოდა თუ არა შრატის IPA-ს დონე ღვიძლის დნმ-ის მეთილირებასთან. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ შრატის IPA-ს დონესთან ასოცირებული ორი ძირითადი მეთილირების ადგილი იყო პროლინ-სერინით მდიდარი რეგიონის 3 (C19orf55) და სითბური შოკის ცილის ოჯახის B (პატარა) წევრის 6 (HSPB6) მახლობლად (დამატებითი ფაილი 3). 4350 CpG-ის დნმ-ის მეთილირება (p < 0.01) კორელაციაში იყო შრატის IPA-ს დონესთან და გამდიდრებული იყო სიცოცხლის ხანგრძლივობის მარეგულირებელი გზებით (p = 0.006) (სურათი 1A, ცხრილი 2 და დამატებითი სურათი 1C).
ადამიანის ღვიძლში შრატის IPA-ს დონეს, გლობალურ ტრანსკრიპტებს, მიტოქონდრიასთან ასოცირებულ ტრანსკრიპტებსა და დნმ-ის მეთილირებას შორის კავშირის ბიოლოგიური მექანიზმების გასაგებად, ჩვენ ჩავატარეთ წინა გზის ანალიზში იდენტიფიცირებული გენების გადაფარვის ანალიზი (სურათი 1A). 56 გადაფარვის გენის გზის გამდიდრების ანალიზის შედეგებმა (სურათი 1A-ზე შავი ხაზის შიგნით) აჩვენა, რომ აპოპტოზის გზამ (p = 0.00029) გამოავლინა სამივე ანალიზისთვის საერთო ორი გენი: AKT1 და YKT6 (YKT6 v-SNARE ჰომოლოგი), როგორც ეს ნაჩვენებია ვენის დიაგრამაზე (დამატებითი სურათი 2 და სურათი 1A). საინტერესოა, რომ აღმოვაჩინეთ, რომ AKT1 (cg19831386) და YKT6 (cg24161647) დადებითად კორელირებული იყო შრატის IPA-ს დონესთან (დამატებითი ფაილი 3). გენურ პროდუქტებს შორის პოტენციური ცილოვანი ურთიერთქმედების დასადგენად, 56 გადაფარვის გენიდან შევარჩიეთ 13 გენი ყველაზე მაღალი საერთო რეგიონის ქულით (0.900) და შევქმენით ურთიერთქმედების რუკა. სანდოობის დონის (ზღვრული სანდოობის) მიხედვით, ყველაზე მაღალი ქულის მქონე AKT1 გენი (0.900) ზედა ადგილზე იყო (სურათი 1B).
გზის ანალიზის საფუძველზე აღმოვაჩინეთ, რომ აპოპტოზი იყო მთავარი გზა, ამიტომ გამოვიკვლიეთ, იმოქმედებდა თუ არა IPA-თი მკურნალობა HSC-ების აპოპტოზზე in vitro. ჩვენ ადრე ვაჩვენეთ, რომ IPA-ს სხვადასხვა დოზები (10 μM, 100 μM და 1 mM) არატოქსიკური იყო LX-2 უჯრედებისთვის [15]. ამ კვლევამ აჩვენა, რომ IPA-თი მკურნალობა 10 μM და 100 μM დოზებით ზრდიდა სიცოცხლისუნარიანი და ნეკროზული უჯრედების რაოდენობას. თუმცა, საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით, უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა შემცირდა 1 mM IPA კონცენტრაციისას, ხოლო უჯრედების ნეკროზის სიჩქარე უცვლელი დარჩა (სურათი 2A, B). შემდეგ, LX-2 უჯრედებში აპოპტოზის ინდუცირების ოპტიმალური კონცენტრაციის დასადგენად, ჩვენ გამოვცადეთ 10 μM, 100 μM და 1 mM IPA 24 საათის განმავლობაში (სურათი 2A-E და დამატებითი სურათი 3A-B). საინტერესოა, რომ IPA 10 μM და 100 μM ამცირებდა აპოპტოზის მაჩვენებელს (%), თუმცა, IPA 1 mM ზრდიდა გვიან აპოპტოზს და აპოპტოზის მაჩვენებელს (%) საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით და შესაბამისად, შეირჩა შემდგომი ექსპერიმენტებისთვის (სურათები 2A–D).
IPA იწვევს LX-2 უჯრედების აპოპტოზს. აპოპტოზის სიჩქარისა და უჯრედების მორფოლოგიის ნაკადური ციტომეტრიის გამოყენებით შესაფასებლად გამოყენებული იქნა ანექსინ V-სა და 7-AAD-ის ორმაგი შეღებვის მეთოდი. BA უჯრედები ინკუბირებული იქნა 10 μM, 100 μM და 1 mM IPA-სთან 24 საათის განმავლობაში ან F–H TGF-β1-თან (5 ნგ/მლ) და 1 mM IPA-სთან შრატისგან თავისუფალ გარემოში 24 საათის განმავლობაში. A: ცოცხალი უჯრედები (ანექსინი V -/ 7AAD-); B: ნეკროზული უჯრედები (ანექსინი V -/ 7AAD+); C, F: ადრეული (ანექსინი V +/ 7AAD-); D, G: გვიანი (ანექსინი V+/7AAD.+); E, H: აპოპტოზის სიჩქარეში ადრეული და გვიანი აპოპტოზური უჯრედების საერთო რაოდენობის პროცენტული მაჩვენებელი (%). მონაცემები გამოხატულია საშუალო ± სტანდარტული გადახრით, n = 3 დამოუკიდებელი ექსპერიმენტი. სტატისტიკური შედარებები ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA-ს გამოყენებით Bonferroni-ს პოსტ ჰოკ ტესტით. *p < 0.05; ****p < 0.0001
როგორც ადრე ვაჩვენეთ, 5 ნგ/მლ TGF-β1-ს შეუძლია HSC აქტივაციის ინდუცირება კლასიკური მარკერის გენების ექსპრესიის გაზრდით [15]. LX-2 უჯრედები დამუშავდა 5 ნგ/მლ TGF-β1-ით და 1 mM IPA-თი კომბინაციაში (სურ. 2E–H). TGF-β1-ით მკურნალობამ არ შეცვალა აპოპტოზის მაჩვენებელი, თუმცა, IPA-თი თანამკურნალობამ გაზარდა გვიანი აპოპტოზი და აპოპტოზის მაჩვენებელი (%) TGF-β1-ით მკურნალობასთან შედარებით (სურ. 2E–H). ეს შედეგები მიუთითებს, რომ 1 mM IPA-ს შეუძლია ხელი შეუწყოს აპოპტოზს LX-2 უჯრედებში TGF-β1 ინდუქციისგან დამოუკიდებლად.
ჩვენ დამატებით შევისწავლეთ IPA-ს გავლენა LX-2 უჯრედებში მიტოქონდრიულ სუნთქვაზე. შედეგებმა აჩვენა, რომ 1 mM IPA-მ შეამცირა ჟანგბადის მოხმარების სიჩქარის (OCR) პარამეტრები: არამიტოქონდრიული სუნთქვა, ბაზალური და მაქსიმალური სუნთქვა, პროტონების გაჟონვა და ATP-ის გამომუშავება საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (სურათი 3A, B), ხოლო ბიოენერგეტიკული ჯანმრთელობის ინდექსი (BHI) არ შეცვლილა.
IPA ამცირებს მიტოქონდრიულ სუნთქვას LX-2 უჯრედებში. მიტოქონდრიული სუნთქვის მრუდი (OCR) წარმოდგენილია მიტოქონდრიული სუნთქვის პარამეტრების სახით (არამიტოქონდრიული სუნთქვა, ბაზალური სუნთქვა, მაქსიმალური სუნთქვა, პროტონის გაჟონვა, ATP-ის გენერაცია, SRC და BHI). უჯრედები A და B ინკუბირებული იქნა შესაბამისად 10 μM, 100 μM და 1 mM IPA-სთან 24 საათის განმავლობაში. უჯრედები C და D ინკუბირებული იქნა შესაბამისად TGF-β1-თან (5 ნგ/მლ) და 1 mM IPA-სთან შრატისგან თავისუფალ გარემოში 24 საათის განმავლობაში. ყველა გაზომვა ნორმალიზებული იყო დნმ-ის შემცველობასთან CyQuant ნაკრების გამოყენებით. BHI: ბიოენერგეტიკული ჯანმრთელობის ინდექსი; SRC: სუნთქვის რეზერვის მოცულობა; OCR: ჟანგბადის მოხმარების სიჩქარე. მონაცემები წარმოდგენილია საშუალო ± სტანდარტული გადახრის (SD) სახით, n = 5 დამოუკიდებელი ექსპერიმენტი. სტატისტიკური შედარებები ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA-ს და Bonferroni-ს პოსტ ჰოკ ტესტის გამოყენებით. *p < 0.05; **p < 0.01; და ***p < 0.001.
TGF-β1-ით გააქტიურებული LX-2 უჯრედების ბიოენერგეტიკულ პროფილზე IPA-ს ეფექტის უფრო სრულყოფილი გაგების მიზნით, ჩვენ გავაანალიზეთ მიტოქონდრიული ჟანგვითი ფოსფორილირება OCR-ის მეთოდით (სურ. 3C,D). შედეგებმა აჩვენა, რომ TGF-β1-ით მკურნალობამ შეიძლება შეამციროს მაქსიმალური სუნთქვა, სუნთქვის სარეზერვო მოცულობა (SRC) და BHI საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (სურ. 3C,D). გარდა ამისა, კომბინირებული მკურნალობა ამცირებს ბაზალურ სუნთქვას, პროტონების გაჟონვას და ATP-ის წარმოებას, მაგრამ SRC და BHI მნიშვნელოვნად მაღალი იყო TGF-β1-ით დამუშავებულ ჯგუფებთან შედარებით (სურ. 3C,D).
ჩვენ ასევე ჩავატარეთ Seahorse პროგრამული უზრუნველყოფის მიერ მოწოდებული „უჯრედული ენერგიის ფენოტიპის ტესტი“ (დამატებითი სურ. 4A–D). როგორც დამატებით სურათ 3B-ზეა ნაჩვენები, როგორც OCR, ასევე ECAR მეტაბოლური პოტენციალი შემცირდა TGF-β1 მკურნალობის შემდეგ, თუმცა, განსხვავება არ დაფიქსირებულა კომბინირებული და IPA მკურნალობის ჯგუფებში საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით. გარდა ამისა, OCR-ის როგორც ბაზალური, ასევე სტრესის დონე შემცირდა კომბინირებული და IPA მკურნალობის შემდეგ საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (დამატებითი სურ. 4C). საინტერესოა, რომ მსგავსი სურათი დაფიქსირდა კომბინირებული თერაპიის დროს, სადაც ECAR-ის ბაზალური და სტრესის დონეებში ცვლილება არ დაფიქსირებულა TGF-β1 მკურნალობასთან შედარებით (დამატებითი სურ. 4C). ჰემატოპოეზურ-მთლიან უჯრედებში, მიტოქონდრიული ჟანგვითი ფოსფორილირების შემცირებამ და კომბინირებული მკურნალობის უნარმა, აღადგინოს SCR და BHI TGF-β1 მკურნალობის ზემოქმედების შემდეგ, არ შეცვალა მეტაბოლური პოტენციალი (OCR და ECAR). ეს შდეგები ერთად აღებული მიუთითებს, რომ IPA-მ შესაძლოა შეამციროს ბიოენერგეტიკა HSC-ებში, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ IPA-მ შეიძლება გამოიწვიოს უფრო დაბალი ენერგეტიკული პროფილი, რაც HSC ფენოტიპს ინაქტივაციისკენ გადაიყვანს (დამატებითი სურათი 4D).
IPA-ს გავლენა მიტოქონდრიულ დინამიკაზე გამოკვლეული იქნა მიტოქონდრიული მორფოლოგიისა და ქსელური კავშირების სამგანზომილებიანი რაოდენობრივი შეფასების, ასევე MTR შეღებვის გამოყენებით (სურათი 4 და დამატებითი სურათი 5). სურათი 4 აჩვენებს, რომ საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით, TGF-β1 დამუშავებამ შეამცირა საშუალო ზედაპირის ფართობი, ტოტების რაოდენობა, ტოტების საერთო სიგრძე და ტოტების შეერთების რაოდენობა (სურათი 4A და B) და შეცვალა მიტოქონდრიების პროპორცია სფერულიდან შუალედურ მორფოლოგიამდე (სურათი 4C). მხოლოდ IPA დამუშავებამ შეამცირა მიტოქონდრიის საშუალო მოცულობა და შეცვალა მიტოქონდრიების პროპორცია სფერულიდან შუალედურ მორფოლოგიამდე საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (სურათი 4A). ამის საპირისპიროდ, სფერულობა, ტოტების საშუალო სიგრძე და მიტოქონდრიული აქტივობა, რომელიც შეფასდა მიტოქონდრიის მემბრანის პოტენციალზე დამოკიდებული MTR-ით (სურათი 4A და E), უცვლელი დარჩა და ეს პარამეტრები არ განსხვავდებოდა ჯგუფებს შორის. ერთად აღებული, ეს შედეგები მიუთითებს, რომ TGF-β1 და IPA დამუშავება, როგორც ჩანს, ცვლის მიტოქონდრიის ფორმასა და ზომას, ასევე ქსელის სირთულეს ცოცხალ LX-2 უჯრედებში.
IPA ცვლის მიტოქონდრიულ დინამიკას და მიტოქონდრიული დნმ-ის სიმრავლეს LX-2 უჯრედებში. A. ცოცხალი LX-2 უჯრედების წარმომადგენლობითი კონფოკალური გამოსახულებები, რომლებიც ინკუბირებული იყო TGF-β1-ით (5 ნგ/მლ) და 1 mM IPA-თი 24 საათის განმავლობაში შრატისგან თავისუფალ გარემოში, რომლებიც აჩვენებდნენ Mitotracker™ Red CMXRos-ით შეღებილ მიტოქონდრიულ ქსელებს და DAPI-ით ლურჯად შეღებილ ბირთვებს. ყველა მონაცემი შეიცავდა მინიმუმ 15 სურათს ჯგუფში. ჩვენ შევიძინეთ 10 Z-დასტის სურათი თითოეული ნიმუშის ტიპისთვის. თითოეული Z-ღერძის თანმიმდევრობა შეიცავდა 30 ნაჭერს, თითოეულის სისქით 9.86 μm. მასშტაბის ზოლი: 10 μm. B. წარმომადგენლობითი ობიექტები (მხოლოდ მიტოქონდრიები), რომლებიც იდენტიფიცირებული იყო გამოსახულებაზე ადაპტური ზღურბლის გამოყენებით. მიტოქონდრიული მორფოლოგიური ქსელური კავშირების რაოდენობრივი ანალიზი და შედარება ჩატარდა თითოეული ჯგუფის ყველა უჯრედისთვის. C. მიტოქონდრიული ფორმის თანაფარდობების სიხშირე. 0-თან ახლოს მნიშვნელობები მიუთითებს სფერულ ფორმებზე, ხოლო 1-თან ახლოს მნიშვნელობები მიუთითებს ძაფისებრ ფორმებზე. D მიტოქონდრიული დნმ-ის (mtDNA) შემცველობა განისაზღვრა, როგორც აღწერილია „მასალები და მეთოდები“-ში. E Mitotracker™ Red CMXRos ანალიზი ჩატარდა ნაკადური ციტომეტრიით (30,000 მოვლენა), როგორც აღწერილია „მასალები და მეთოდები“-ში. მონაცემები წარმოდგენილია საშუალო ± სტანდარტული გადახრით, n = 3 დამოუკიდებელი ექსპერიმენტი. სტატისტიკური შედარებები ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA-სა და Bonferroni-ს პოსტ ჰოკ ტესტის გამოყენებით. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
შემდეგ ჩვენ გავაანალიზეთ LX-2 უჯრედებში mtDNA-ს შემცველობა, როგორც მიტოქონდრიების რაოდენობის ინდიკატორი. საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით, mtDNA-ს შემცველობა გაიზარდა TGF-β1-ით დამუშავებულ ჯგუფში (სურათი 4D). TGF-β1-ით დამუშავებულ ჯგუფთან შედარებით, mtDNA-ს შემცველობა შემცირდა კომბინირებული მკურნალობის ჯგუფში (სურათი 4D), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ IPA-მ შეიძლება შეამციროს mtDNA-ს შემცველობა და შესაძლოა მიტოქონდრიების რაოდენობა, ასევე მიტოქონდრიული სუნთქვა (სურათი 3C). გარდა ამისა, IPA, როგორც ჩანს, ამცირებს mtDNA-ს შემცველობას კომბინირებული მკურნალობის დროს, მაგრამ გავლენას არ ახდენს MTR-განპირობებულ მიტოქონდრიულ აქტივობაზე (სურათები 4A–C).
ჩვენ გამოვიკვლიეთ IPA-ს კავშირი LX-2 უჯრედებში ფიბროზთან, აპოპტოზთან, გადარჩენასთან და მიტოქონდრიულ დინამიკასთან დაკავშირებული გენების mRNA დონეებთან (სურათი 5A–D). საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით, TGF-β1-ით დამუშავებულ ჯგუფში აღინიშნა ისეთი გენების ექსპრესიის მომატება, როგორიცაა კოლაგენის I ტიპის α2 ჯაჭვი (COL1A2), α-გლუვი კუნთების აქტინი (αSMA), მატრიქსული მეტალოპროტეინაზა 2 (MMP2), მეტალოპროტეინაზა 1-ის ქსოვილის ინჰიბიტორი (TIMP1) და დინამინ 1-ის მსგავსი გენი (DRP1), რაც მიუთითებს ფიბროზისა და აქტივაციის მომატებაზე. გარდა ამისა, საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით, TGF-β1-ით მკურნალობამ შეამცირა ბირთვული პრეგნან X რეცეპტორის (PXR), კასპაზა 8-ის (CASP8), MAPKAPK3-ის, B-უჯრედის α ინჰიბიტორის, ბირთვული ფაქტორი κ გენის მსუბუქი პეპტიდის გამაძლიერებლის (NFκB1A) და ბირთვული ფაქტორი κB კინაზას ქვეერთეულის β ინჰიბიტორის (IKBKB) mRNA დონეები (სურათი 5A–D). TGF-β1 მკურნალობასთან შედარებით, TGF-β1-ით და IPA-თი კომბინირებული მკურნალობა ამცირებდა COL1A2-ის და MMP2-ის ექსპრესიას, მაგრამ ზრდიდა PXR-ის, TIMP1-ის, B-უჯრედული ლიმფომა-2-ის (BCL-2), CASP8-ის, NFκB1A-ს, NFκB1-β-ის და IKBKB-ის mRNA დონეს. IPA მკურნალობამ მნიშვნელოვნად შეამცირა MMP2-ის, Bcl-2-ასოცირებული ცილა X-ის (BAX), AKT1-ის, ოპტიკური ნერვის ატროფიის ცილა 1-ის (OPA1) და მიტოქონდრიული შერწყმული ცილა 2-ის (MFN2) ექსპრესიას, მაშინ როდესაც CASP8-ის, NFκB1A-ს, NFκB1B-ის და IKBKB-ის ექსპრესია გაზრდილი იყო საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით. თუმცა, განსხვავება არ დაფიქსირებულა კასპაზა-3-ის (CASP3), აპოპტოზური პეპტიდაზას გააქტიურების ფაქტორი 1-ის (APAF1), მიტოქონდრიული შერწყმული ცილა 1-ის (MFN1) და დაშლის ცილა 1-ის (FIS1) ექსპრესიაში. ერთობლივად, ეს შედეგები მიუთითებს, რომ IPA მკურნალობა მოდულირებს ფიბროზთან, აპოპტოზთან, გადარჩენასთან და მიტოქონდრიულ დინამიკასთან დაკავშირებული გენების ექსპრესიას. ჩვენი მონაცემები მიუთითებს, რომ IPA მკურნალობა ამცირებს ფიბროზს LX-2 უჯრედებში; ამავდროულად, ის ასტიმულირებს გადარჩენას ფენოტიპის ინაქტივაციისკენ გადაადგილებით.
IPA მოდულირებს ფიბრობლასტური, აპოპტოზური, სიცოცხლისუნარიანობისა და მიტოქონდრიული დინამიკის გენების ექსპრესიას LX-2 უჯრედებში. ჰისტოგრამები აჩვენებს mRNA ექსპრესიას ენდოგენურ კონტროლთან (RPLP0 ან PPIA) მიმართ, მას შემდეგ, რაც LX-2 უჯრედები ინდუცირებული იქნა TGF-β1-ით და IPA-თი შრატისგან თავისუფალ გარემოში 24 საათის განმავლობაში. A მიუთითებს ფიბრობლასტებზე, B მიუთითებს აპოპტოზურ უჯრედებზე, C მიუთითებს გადარჩენილ უჯრედებზე და D მიუთითებს მიტოქონდრიული დინამიკის გენის ექსპრესიაზე. მონაცემები წარმოდგენილია საშუალო ± სტანდარტული გადახრის (SD) სახით, n = 3 დამოუკიდებელი ექსპერიმენტი. სტატისტიკური შედარებები ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA-სა და Bonferroni-ს პოსტ ჰოკ ტესტის გამოყენებით. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
შემდეგ, უჯრედების ზომის ცვლილებები (FSC-H) და ციტოპლაზმური კომპლექსურობა (SSC-H) შეფასდა ნაკადური ციტომეტრიით (სურათი 6A,B), ხოლო IPA დამუშავების შემდეგ უჯრედების მორფოლოგიის ცვლილებები შეფასდა ტრანსმისიული ელექტრონული მიკროსკოპიით (TEM) და ფაზური კონტრასტული მიკროსკოპიით (დამატებითი სურათი 6A-B). როგორც მოსალოდნელი იყო, TGF-β1-ით დამუშავებული ჯგუფის უჯრედები ზომაში გაიზარდა საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (სურათი 6A,B), რაც ავლენს უხეშ ენდოპლაზმური ბადის (ER*) და ფაგოლიზოსომების (P) კლასიკურ გაფართოებას, რაც მიუთითებს ჰემატოპოეტური ღეროვანი უჯრედების (HSC) აქტივაციაზე (დამატებითი სურათი 6A). თუმცა, TGF-β1-ით დამუშავებულ ჯგუფთან შედარებით, უჯრედების ზომა, ციტოპლაზმური კომპლექსურობა (სურათი 6A,B) და ER* შემცველობა შემცირდა TGF-β1 და IPA კომბინირებული მკურნალობის ჯგუფში (დამატებითი სურათი 6A). გარდა ამისა, IPA-თი მკურნალობამ შეამცირა უჯრედის ზომა, ციტოპლაზმური სირთულე (სურ. 6A, B), P და ER* შემცველობა (დამატებითი სურ. 6A) საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით. გარდა ამისა, აპოპტოზური უჯრედების შემცველობა გაიზარდა IPA-თი მკურნალობის 24 საათის შემდეგ საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (თეთრი ისრები, დამატებითი სურ. 6B). ერთობლივად, ეს შედეგები მიუთითებს, რომ 1 mM IPA-ს შეუძლია სტიმულირება HSC აპოპტოზში და შეცვალოს TGF-β1-ით გამოწვეული უჯრედის მორფოლოგიური პარამეტრების ცვლილებები, რითაც არეგულირებს უჯრედის ზომას და სირთულეს, რაც შეიძლება დაკავშირებული იყოს HSC ინაქტივაციასთან.
IPA ცვლის უჯრედის ზომას და ციტოპლაზმურ სირთულეს LX-2 უჯრედებში. ნაკადური ციტომეტრიის ანალიზის წარმომადგენლობითი გამოსახულებები. ანალიზში გამოყენებული იყო LX-2 უჯრედებისთვის სპეციფიკური კარიბჭის სტრატეგია: SSC-A/FSC-A უჯრედული პოპულაციის დასადგენად, FSC-H/FSC-A დუბლეტების იდენტიფიცირებისთვის და SSC-H/FSC-H უჯრედის ზომისა და სირთულის ანალიზისთვის. უჯრედები ინკუბირებული იყო TGF-β1-თან (5 ნგ/მლ) და 1 mM IPA-სთან ერთად შრატისგან თავისუფალ გარემოში 24 საათის განმავლობაში. LX-2 უჯრედები გადანაწილდა ქვედა მარცხენა კვადრანტში (SSC-H-/FSC-H-), ზედა მარცხენა კვადრანტში (SSC-H+/FSC-H-), ქვედა მარჯვენა კვადრანტში (SSC-H-/FSC-H+) და ზედა მარჯვენა კვადრანტში (SSC-H+/FSC-H+) უჯრედის ზომისა და ციტოპლაზმური სირთულის ანალიზისთვის. B. უჯრედის მორფოლოგია გაანალიზდა ნაკადური ციტომეტრიით FSC-H-ის (წინა გაფანტვა, უჯრედის ზომა) და SSC-H-ის (გვერდითი გაფანტვა, ციტოპლაზმური სირთულე) გამოყენებით (30,000 მოვლენა). მონაცემები წარმოდგენილია საშუალო ± სტანდარტული გადახრის სახით, n = 3 დამოუკიდებელი ექსპერიმენტი. სტატისტიკური შედარებები ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA-სა და ბონფერონის პოსტ ჰოკ ტესტის გამოყენებით. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 და ****p < 0.0001
ნაწლავის მეტაბოლიტები, როგორიცაა IPA, კვლევის ცხელი თემა გახდა, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ნაწლავის მიკრობიოტაში შესაძლოა ახალი სამიზნეები აღმოაჩინონ. ამიტომ საინტერესოა, რომ IPA, მეტაბოლიტი, რომელიც ჩვენ ადამიანებში ღვიძლის ფიბროზთან დავუკავშირეთ [15], ცხოველურ მოდელებში პოტენციურ ანტიფიბროზულ ნაერთად იქნა ნაჩვენები [13, 14]. აქ ჩვენ პირველად ვაჩვენებთ კავშირს შრატის IPA-სა და გლობალურ ღვიძლის ტრანსკრიპტომიკასა და დნმ-ის მეთილირებას შორის მე-2 ტიპის დიაბეტის (T2D) არმქონე სიმსუქნით დაავადებულ პირებში, რაც ხაზს უსვამს აპოპტოზს, მიტოფაგიას და სიცოცხლის ხანგრძლივობას, ასევე ღვიძლის ჰომეოსტაზის მარეგულირებელ შესაძლო კანდიდატ გენ AKT1-ს. ჩვენი კვლევის კიდევ ერთი სიახლე ის არის, რომ ჩვენ ვაჩვენეთ IPA-ს მკურნალობის ურთიერთქმედება აპოპტოზთან, უჯრედების მორფოლოგიასთან, მიტოქონდრიულ ბიოენერგეტიკასთან და დინამიკასთან LX-2 უჯრედებში, რაც მიუთითებს უფრო დაბალ ენერგეტიკულ სპექტრზე, რომელიც HSC ფენოტიპს ინაქტივაციისკენ გადააქვს, რაც IPA-ს ღვიძლის ფიბროზის გაუმჯობესების პოტენციურ კანდიდატად აქცევს.
ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ აპოპტოზი, მიტოფაგია და სიცოცხლის ხანგრძლივობა ყველაზე მნიშვნელოვანი კანონიკური გზები იყო, რომლებიც გამდიდრებული იყო ღვიძლის გენებში, რომლებიც დაკავშირებულია შრატში მოცირკულირე IPA-სთან. მიტოქონდრიული ხარისხის კონტროლის (MQC) სისტემის დარღვევამ შეიძლება გამოიწვიოს მიტოქონდრიული დისფუნქცია, მიტოფაგია და აპოპტოზი, რითაც ხელს უწყობს MASLD-ის წარმოქმნას [33, 34]. ამიტომ, შეგვიძლია ვივარაუდოთ, რომ IPA შეიძლება მონაწილეობდეს უჯრედული დინამიკის და მიტოქონდრიული მთლიანობის შენარჩუნებაში ღვიძლში აპოპტოზის, მიტოფაგიის და სიცოცხლის ხანგრძლივობის მეშვეობით. ჩვენი მონაცემები აჩვენებს, რომ სამივე ანალიზში ორი გენი საერთო იყო: YKT6 და AKT1. აღსანიშნავია, რომ YKT6 არის SNARE ცილა, რომელიც მონაწილეობს უჯრედის მემბრანის შერწყმის პროცესში. ის მნიშვნელოვან როლს ასრულებს აუტოფაგიასა და მიტოფაგიაში, ავტოფაგოსომაზე STX17-თან და SNAP29-თან ინიციაციის კომპლექსის წარმოქმნით, რითაც ხელს უწყობს აუტოფაგოსომებისა და ლიზოსომების შერწყმას [35]. გარდა ამისა, YKT6 ფუნქციის დაკარგვა იწვევს მიტოფაგიის დარღვევას[36], ხოლო YKT6-ის აქტივაცია დაკავშირებულია ჰეპატოცელულარული კარცინომის (HCC) პროგრესირებასთან, რაც აჩვენებს უჯრედების გადარჩენის ზრდას[37]. მეორეს მხრივ, AKT1 არის ყველაზე მნიშვნელოვანი ურთიერთქმედი გენი და მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ღვიძლის დაავადებებში, მათ შორის PI3K/AKT სასიგნალო გზაში, უჯრედულ ციკლში, უჯრედების მიგრაციაში, პროლიფერაციაში, ფოკალურ ადჰეზიაში, მიტოქონდრიულ ფუნქციასა და კოლაგენის სეკრეციაში[38–40]. გააქტიურებულ PI3K/AKT სასიგნალო გზას შეუძლია გაააქტიუროს ჰემატოპოეტური ღეროვანი უჯრედები (HSC), რომლებიც წარმოადგენენ უჯრედებს, რომლებიც პასუხისმგებელნი არიან უჯრედგარე მატრიქსის (ECM) წარმოებაზე, და მისმა დისრეგულაციამ შეიძლება ხელი შეუწყოს ღვიძლის ფიბროზის წარმოქმნას და პროგრესირებას[40]. გარდა ამისა, AKT არის უჯრედების გადარჩენის ერთ-ერთი მთავარი ფაქტორი, რომელიც აფერხებს p53-დამოკიდებული უჯრედების აპოპტოზს, ხოლო AKT-ის აქტივაცია შეიძლება დაკავშირებული იყოს ღვიძლის უჯრედების აპოპტოზის ინჰიბირებასთან[41, 42]. მიღებული შედეგები მიუთითებს, რომ IPA შესაძლოა მონაწილეობდეს ღვიძლის მიტოქონდრიასთან ასოცირებულ აპოპტოზში, ჰეპატოციტების აპოპტოზში შესვლასა და გადარჩენას შორის გადაწყვეტილებაზე ზემოქმედებით. ეს ეფექტები შეიძლება რეგულირდება AKT და/ან YKT6 კანდიდატი გენებით, რომლებიც კრიტიკულად მნიშვნელოვანია ღვიძლის ჰომეოსტაზისთვის.
ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ 1 mM IPA იწვევდა აპოპტოზს და ამცირებდა მიტოქონდრიულ სუნთქვას LX-2 უჯრედებში TGF-β1 მკურნალობისგან დამოუკიდებლად. აღსანიშნავია, რომ აპოპტოზი ფიბროზის რეზოლუციისა და ჰემატოპოეტური ღეროვანი უჯრედების (HSC) აქტივაციის მთავარი გზაა და ასევე ღვიძლის ფიბროზის შექცევადი ფიზიოლოგიური პასუხის ძირითადი მოვლენაა [4, 43]. გარდა ამისა, კომბინირებული მკურნალობის შემდეგ LX-2 უჯრედებში BHI-ის აღდგენამ ახალი წარმოდგენა შეგვიქმნა IPA-ს პოტენციურ როლზე მიტოქონდრიული ბიოენერგეტიკის რეგულირებაში. მოსვენების და არააქტიურ პირობებში, ჰემატოპოეტური უჯრედები ჩვეულებრივ იყენებენ მიტოქონდრიულ ჟანგვით ფოსფორილირებას ATP-ის წარმოსაქმნელად და აქვთ დაბალი მეტაბოლური აქტივობა. მეორეს მხრივ, HSC-ის აქტივაცია აძლიერებს მიტოქონდრიულ სუნთქვას და ბიოსინთეზს, რათა კომპენსირება გაუწიოს გლიკოლიზურ მდგომარეობაში შესვლის ენერგეტიკულ მოთხოვნილებებს [44]. ის ფაქტი, რომ IPA-მ გავლენა არ მოახდინა მეტაბოლურ პოტენციალზე და ECAR-ზე, მიუთითებს, რომ გლიკოლიზურ გზას ნაკლები პრიორიტეტი აქვს. ანალოგიურად, კიდევ ერთმა კვლევამ აჩვენა, რომ 1 mM IPA-ს შეეძლო მიტოქონდრიული რესპირატორული ჯაჭვის აქტივობის მოდულირება კარდიომიოციტებში, ადამიანის ჰეპატოციტების უჯრედულ ხაზში (Huh7) და ადამიანის ჭიპლარის ვენის ენდოთელურ უჯრედებში (HUVEC); თუმცა, IPA-ს არანაირი გავლენა არ აღმოჩნდა კარდიომიოციტებში გლიკოლიზზე, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ IPA-მ შეიძლება გავლენა მოახდინოს სხვა ტიპის უჯრედების ბიოენერგეტიკაზე [45]. ამიტომ, ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ 1 mM IPA-მ შეიძლება იმოქმედოს როგორც მსუბუქი ქიმიური განმათავისუფლებელი საშუალება, რადგან მას შეუძლია მნიშვნელოვნად შეამციროს ფიბროგენული გენის ექსპრესია, უჯრედის მორფოლოგია და მიტოქონდრიული ბიოენერგეტიკა mtDNA-ს რაოდენობის შეცვლის გარეშე [46]. მიტოქონდრიულ განმათავისუფლებლებს შეუძლიათ კულტურით გამოწვეული ფიბროზის და HSC აქტივაციის დათრგუნვა [47] და შეამცირონ მიტოქონდრიული ATP-ის წარმოება, რომელიც რეგულირდება ან ინდუცირდება გარკვეული ცილებით, როგორიცაა განმათავისუფლებელი ცილები (UCP) ან ადენინ ნუკლეოტიდ ტრანსლოკაზა (ANT). უჯრედის ტიპიდან გამომდინარე, ამ ფენომენს შეუძლია დაიცვას უჯრედები აპოპტოზისგან და/ან ხელი შეუწყოს აპოპტოზს [46]. თუმცა, საჭიროა შემდგომი კვლევები IPA-ს, როგორც მიტოქონდრიული განმაცალკევებელი ფაქტორის, როლის გასარკვევად ჰემატოპოეტური ღეროვანი უჯრედების ინაქტივაციაში.
შემდეგ ჩვენ გამოვიკვლიეთ, აისახება თუ არა მიტოქონდრიული სუნთქვის ცვლილებები მიტოქონდრიულ მორფოლოგიაზე ცოცხალ LX-2 უჯრედებში. საინტერესოა, რომ TGF-β1-ით მკურნალობა ცვლის მიტოქონდრიულ პროპორციას სფერულიდან შუალედურამდე, მიტოქონდრიული განშტოების შემცირებით და DRP1-ის ექსპრესიის გაზრდით, რაც მიტოქონდრიული დაშლის ძირითადი ფაქტორია [48]. გარდა ამისა, მიტოქონდრიული ფრაგმენტაცია დაკავშირებულია ქსელის საერთო სირთულესთან და შერწყმიდან დაშლაზე გადასვლა კრიტიკულია ჰემატოპოეტური ღეროვანი უჯრედების (HSC) აქტივაციისთვის, მაშინ როდესაც მიტოქონდრიული დაშლის ინჰიბირება იწვევს HSC აპოპტოზს [49]. ამრიგად, ჩვენი შედეგები მიუთითებს, რომ TGF-β1-ით მკურნალობამ შეიძლება გამოიწვიოს მიტოქონდრიული ქსელის კომპლექსურობის შემცირება განშტოების შემცირებით, რაც უფრო ხშირია მიტოქონდრიულ დაშლაში, რომელიც დაკავშირებულია გააქტიურებულ ჰემატოპოეტურ ღეროვან უჯრედებთან (HSC). გარდა ამისა, ჩვენმა მონაცემებმა აჩვენა, რომ IPA-ს შეუძლია შეცვალოს მიტოქონდრიების პროპორცია სფერულიდან შუალედურ ფორმამდე, რითაც ამცირებს OPA1-ის და MFN2-ის ექსპრესიას. კვლევებმა აჩვენა, რომ OPA1-ის დაქვეითებამ შეიძლება გამოიწვიოს მიტოქონდრიული მემბრანული პოტენციალის შემცირება და უჯრედის აპოპტოზის გამოწვევა [50]. ცნობილია, რომ MFN2 ხელს უწყობს მიტოქონდრიული შერწყმისა და აპოპტოზის შუამავლობას [51]. მიღებული შედეგები მიუთითებს, რომ LX-2 უჯრედების ინდუქცია TGF-β1-ით და/ან IPA-თი, როგორც ჩანს, ახდენს მიტოქონდრიის ფორმისა და ზომის, ასევე აქტივაციის მდგომარეობისა და ქსელის სირთულეების მოდულირებას.
ჩვენი შედეგები მიუთითებს, რომ TGFβ-1-ისა და IPA-ს კომბინირებული მკურნალობა შეიძლება ამცირებდეს მტდნმ-ს და უჯრედის მორფოლოგიურ პარამეტრებს აპოპტოზისგან თავის არიდების უჯრედებში ფიბროზის, აპოპტოზისა და გადარჩენასთან დაკავშირებული გენების mRNA ექსპრესიის რეგულირებით. მართლაც, IPA-მ შეამცირა AKT1-ის და მნიშვნელოვანი ფიბროზის გენების, როგორიცაა COL1A2 და MMP2, mRNA ექსპრესიის დონე, მაგრამ გაზარდა CASP8-ის ექსპრესიის დონე, რომელიც აპოპტოზთან ასოცირდება. ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ IPA-თი მკურნალობის შემდეგ, BAX-ის ექსპრესია შემცირდა და TIMP1 ოჯახის ქვეერთეულების, BCL-2-ისა და NF-κB-ის mRNA ექსპრესია გაიზარდა, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ IPA-ს შეუძლია გადარჩენის სიგნალების სტიმულირება ჰემატოპოეტურ ღეროვან უჯრედებში (HSCs), რომლებიც აპოპტოზს ერიდებიან. ეს მოლეკულები შეიძლება მოქმედებდნენ როგორც პრო-გადარჩენის სიგნალები გააქტიურებულ ჰემატოპოეტურ ღეროვან უჯრედებში, რაც შეიძლება დაკავშირებული იყოს ანტიაპოპტოზური ცილების (მაგალითად, Bcl-2) ექსპრესიის გაზრდასთან, პრო-აპოპტოზური BAX-ის ექსპრესიის შემცირებასთან და TIMP-სა და NF-κB-ს შორის რთულ ურთიერთქმედებასთან [5, 7]. IPA თავის ეფექტებს PXR-ის მეშვეობით ახდენს და ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ TGF-β1-თან და IPA-სთან კომბინირებული მკურნალობა ზრდის PXR mRNA ექსპრესიის დონეს, რაც მიუთითებს HSC აქტივაციის დათრგუნვაზე. ცნობილია, რომ გააქტიურებული PXR სიგნალიზაცია აფერხებს HSC აქტივაციას როგორც in vivo, ასევე in vitro [52, 53]. ჩვენი შედეგები მიუთითებს, რომ IPA-მ შეიძლება მონაწილეობა მიიღოს გააქტიურებული HSC-ების კლირენსში აპოპტოზის ხელშეწყობით, ფიბროზისა და მიტოქონდრიული მეტაბოლიზმის შემცირებით და გადარჩენის სიგნალების გაძლიერებით, რომლებიც ტიპიური პროცესებია, რომლებიც გააქტიურებულ HSC ფენოტიპს ინაქტივირებულად გარდაქმნის. IPA-ს პოტენციური მექანიზმისა და როლის კიდევ ერთი შესაძლო ახსნა აპოპტოზში არის ის, რომ ის ასუფთავებს დისფუნქციურ მიტოქონდრიებს ძირითადად მიტოფაგიის (შინაგანი გზა) და გარე TNF სიგნალიზაციის გზის მეშვეობით (ცხრილი 1), რომელიც პირდაპირ კავშირშია NF-κB გადარჩენის სიგნალიზაციის გზასთან (დამატებითი სურათი 7). საინტერესოა, რომ IPA-სთან დაკავშირებული გამდიდრებული გენები აპოპტოზურ გზაზე პრო-აპოპტოზური და პრო-გადარჩენის სიგნალების ინდუცირებას ახდენენ [54], რაც იმაზე მიუთითებს, რომ IPA-მ შესაძლოა ამ გენებთან ურთიერთქმედებით აპოპტოზური გზა ან გადარჩენა გამოიწვიოს. თუმცა, გაურკვეველი რჩება, თუ როგორ იწვევს IPA აპოპტოზს ან გადარჩენას HSC აქტივაციის დროს და მისი მექანიზმური გზები.
IPA არის მიკრობული მეტაბოლიტი, რომელიც წარმოიქმნება საკვებით მიღებული ტრიპტოფანიდან ნაწლავის მიკრობიოტის მეშვეობით. კვლევებმა აჩვენა, რომ მას აქვს ანთების საწინააღმდეგო, ანტიოქსიდანტური და ეპიგენეტიკური მარეგულირებელი თვისებები ნაწლავის გარემოში.[55] კვლევებმა აჩვენა, რომ IPA-ს შეუძლია მოდულირება მოახდინოს ნაწლავის ბარიერული ფუნქციის და შეამციროს ჟანგვითი სტრესი, რამაც შეიძლება ხელი შეუწყოს მის ადგილობრივ ფიზიოლოგიურ ეფექტებს.[56] სინამდვილეში, IPA სამიზნე ორგანოებამდე გადადის სისხლის მიმოქცევის გზით და რადგან IPA-ს მსგავსი ძირითადი მეტაბოლიტის სტრუქტურა აქვს ტრიპტოფანთან, სეროტონინთან და ინდოლის წარმოებულებთან, IPA ახდენს მეტაბოლურ მოქმედებებს, რაც იწვევს კონკურენტულ მეტაბოლურ ბედს.[52] IPA-მ შეიძლება კონკურენცია გაუწიოს ტრიპტოფანისგან მიღებულ მეტაბოლიტებს ფერმენტებთან ან რეცეპტორებთან შეკავშირების ადგილებისთვის, რაც პოტენციურად არღვევს ნორმალურ მეტაბოლურ გზებს. ეს ხაზს უსვამს მისი ფარმაკოკინეტიკისა და ფარმაკოდინამიკის შემდგომი კვლევების საჭიროებას, რათა უკეთ გავიგოთ მისი თერაპიული ფანჯარა.[57] ჯერ კიდევ გასარკვევია, შეიძლება თუ არა ეს ასევე მოხდეს ჰემატოპოეტურ ღეროვან უჯრედებში (HSCs).
ჩვენ ვაღიარებთ, რომ ჩვენს კვლევას გარკვეული შეზღუდვები აქვს. IPA-სთან დაკავშირებული ასოციაციების კონკრეტულად შესასწავლად, ჩვენ გამოვრიცხეთ მე-2 ტიპის შაქრიანი დიაბეტით (T2DM) დაავადებული პაციენტები. ჩვენ ვაღიარებთ, რომ ეს ზღუდავს ჩვენი დასკვნების ფართო გამოყენებადობას მე-2 ტიპის შაქრიანი დიაბეტით და ღვიძლის შორსწასული დაავადების მქონე პაციენტებზე. მიუხედავად იმისა, რომ IPA-ს ფიზიოლოგიური კონცენტრაცია ადამიანის შრატში 1-10 μM-ია [11, 20], 1 mM IPA კონცენტრაცია შეირჩა უმაღლესი არატოქსიკური კონცენტრაციის [15] და აპოპტოზის ყველაზე მაღალი მაჩვენებლის საფუძველზე, ნეკროზული უჯრედების პოპულაციის პროცენტულ მაჩვენებელში განსხვავების გარეშე. მიუხედავად იმისა, რომ ამ კვლევაში გამოყენებული იყო IPA-ს სუპრაფიზიოლოგიური დონეები, ამჟამად არ არსებობს კონსენსუსი IPA-ს ეფექტურ დოზასთან დაკავშირებით [52]. მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენი შედეგები მნიშვნელოვანია, IPA-ს უფრო ფართო მეტაბოლური ბედი კვლევის აქტიურ სფეროდ რჩება. გარდა ამისა, ჩვენი დასკვნები შრატის IPA-ს დონესა და ღვიძლის ტრანსკრიპტების დნმ-ის მეთილირებას შორის კავშირის შესახებ მიღებული იქნა არა მხოლოდ ჰემატოპოეტური ღეროვანი უჯრედებიდან (HSC), არამედ ღვიძლის ქსოვილებიდანაც. ტრანსკრიპტომური ანალიზის შედეგად მიღებული ჩვენი წინა დასკვნების საფუძველზე, რომ IPA ასოცირდება ჰემატოპოეტური ღეროვანი უჯრედების (HSC) აქტივაციასთან [15], და HSC-ები ღვიძლის ფიბროზის პროგრესირებაში მონაწილე ძირითადი უჯრედებია. ღვიძლი შედგება მრავალი ტიპის უჯრედისგან, ამიტომ IPA-ს როლისა და ღვიძლის სხვა ტიპის უჯრედებთან მისი ურთიერთქმედების შესასწავლად უნდა იქნას გათვალისწინებული სხვა უჯრედული მოდელები, როგორიცაა ჰეპატოციტი-HSC-იმუნური უჯრედების თანაკულტივაციის სისტემა, კასპაზის აქტივაციასთან და დნმ-ის ფრაგმენტაციასთან ერთად, ასევე მოქმედების მექანიზმი, მათ შორის ცილის დონე.