გმადლობთ, რომ ეწვიეთ nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ ბრაუზერის უახლესი ვერსია (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). გარდა ამისა, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, ეს საიტი არ შეიცავს სტილებს ან JavaScript-ს.
სინთონ 3-(ანტრაცენ-9-ილ)-2-ციანოაკრილოლილ ქლორიდი 4 სინთეზირებული იქნა და გამოყენებული იქნა სხვადასხვა მაღალაქტიური ჰეტეროციკლური ნაერთების სინთეზირებისთვის სხვადასხვა აზოტის ნუკლეოფილებთან რეაქციის გზით. თითოეული სინთეზირებული ჰეტეროციკლური ნაერთის სტრუქტურა საფუძვლიანად დახასიათდა სპექტროსკოპიული და ელემენტარული ანალიზის გამოყენებით. ცამეტი ახალი ჰეტეროციკლური ნაერთიდან ათმა აჩვენა წამლის მიმართ რეზისტენტული ბაქტერიების (MRSA) წინააღმდეგ წამლის მიმართ რეზისტენტული ბაქტერიების (MRSA) წინააღმდეგ წამლის მიმართ რეზისტენტული ბაქტერიების (MRSA) წინააღმდეგ წამლის მიმართ რეზისტენტული ზონების ყველაზე მაღალი ანტიბაქტერიული აქტივობა აჩვენა. მათ შორის, ნაერთებმა 6, 7, 10, 13b და 14 აჩვენეს ყველაზე მაღალი ანტიბაქტერიული აქტივობა 4 სმ-თან ახლოს ინჰიბირების ზონებით. თუმცა, მოლეკულური დოკინგის კვლევებმა აჩვენა, რომ ნაერთებს განსხვავებული შეკავშირების აფინურობა ჰქონდათ პენიცილინ-შემაკავშირებელ ცილა 2a-სთან (PBP2a), რომელიც MRSA-ს მიმართ რეზისტენტობის მთავარი სამიზნეა. ზოგიერთმა ნაერთმა, როგორიცაა 7, 10 და 14, აჩვენა უფრო მაღალი შეკავშირების აფინურობა და ურთიერთქმედების სტაბილურობა PBP2a-ს აქტიურ ცენტრში, თანაკრისტალიზებული ქინაზოლინონის ლიგანდთან შედარებით. ამის საპირისპიროდ, ნაერთებს 6 და 13b ჰქონდათ უფრო დაბალი დოკინგის ქულა, მაგრამ მაინც ავლენდნენ მნიშვნელოვან ანტიბაქტერიულ აქტივობას, ნაერთ 6-ს ჰქონდა ყველაზე დაბალი MIC (9.7 μg/100 μL) და MBC (78.125 μg/100 μL) მნიშვნელობები. დოკინგის ანალიზმა გამოავლინა ძირითადი ურთიერთქმედებები, მათ შორის წყალბადური ბმები და π-სტაკინგი, განსაკუთრებით ისეთ ნარჩენებთან, როგორიცაა Lys 273, Lys 316 და Arg 298, რომლებიც იდენტიფიცირებული იყო, როგორც ურთიერთქმედების მქონე PBP2a-ს კრისტალურ სტრუქტურაში თანაკრისტალიზებული ლიგანდის მიმართ. ეს ნარჩენები აუცილებელია PBP2a-ს ფერმენტული აქტივობისთვის. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ სინთეზირებული ნაერთები შეიძლება წარმოადგენდეს პერსპექტიულ ანტი-MRSA პრეპარატებს, რაც ხაზს უსვამს მოლეკულური დოკინგის ბიოანალიზებთან შერწყმის მნიშვნელობას ეფექტური თერაპიული კანდიდატების იდენტიფიცირებისთვის.
ამ საუკუნის პირველ რამდენიმე წელიწადში კვლევითი ძალისხმევა ძირითადად ორიენტირებული იყო ანტიმიკრობული აქტივობის მქონე რამდენიმე ინოვაციური ჰეტეროციკლური სისტემის სინთეზისთვის ახალი, მარტივი პროცედურებისა და მეთოდების შემუშავებაზე, ადვილად ხელმისაწვდომი საწყისი მასალების გამოყენებით.
აკრილონიტრილის ფრაგმენტები მრავალი შესანიშნავი ჰეტეროციკლური სისტემის სინთეზისთვის მნიშვნელოვან საწყის მასალებად ითვლება, რადგან ისინი მაღალრეაქტიული ნაერთებია. გარდა ამისა, 2-ციანოაკრილოლილ ქლორიდის წარმოებულები ბოლო წლებში ფართოდ გამოიყენება ფარმაკოლოგიური გამოყენების სფეროში სასიცოცხლოდ მნიშვნელოვანი პროდუქტების შემუშავებისა და სინთეზისთვის, როგორიცაა წამლის შუალედური პროდუქტები1,2,3, ანტივირუსული, კიბოს საწინააღმდეგო, ანტიბაქტერიული, ანტიდეპრესანტული და ანტიოქსიდანტური საშუალებების წინამორბედები4,5,6,7,8,9,10. ბოლო დროს, ანტრაცენის და მისი წარმოებულების ბიოლოგიურმა ეფექტურობამ, მათ შორის მათმა ანტიბიოტიკურმა, კიბოს საწინააღმდეგო11,12, ანტიბაქტერიულმა13,14,15 და ინსექტიციდურმა თვისებებმა16,17, დიდი ყურადღება მიიპყრო18,19,20,21. აკრილონიტრილისა და ანტრაცენის ფრაგმენტების შემცველი ანტიმიკრობული ნაერთები ნაჩვენებია ნახაზებში 1 და 2.
ჯანდაცვის მსოფლიო ორგანიზაციის (WHO) (2021) მონაცემებით, ანტიმიკრობული რეზისტენტობა (AMR) ჯანმრთელობისა და განვითარების გლობალურ საფრთხეს წარმოადგენს22,23,24,25. პაციენტების განკურნება შეუძლებელია, რაც იწვევს საავადმყოფოში უფრო ხანგრძლივ ყოფნას და უფრო ძვირადღირებული მედიკამენტების საჭიროებას, ასევე სიკვდილიანობისა და ინვალიდობის ზრდას. ეფექტური ანტიმიკრობული საშუალებების ნაკლებობა ხშირად იწვევს სხვადასხვა ინფექციების მკურნალობის წარუმატებლობას, განსაკუთრებით ქიმიოთერაპიისა და დიდი ოპერაციების დროს.
ჯანდაცვის მსოფლიო ორგანიზაციის 2024 წლის ანგარიშის თანახმად, მეთიცილინ-რეზისტენტული Staphylococcus aureus (MRSA) და E. coli შეტანილია პრიორიტეტული პათოგენების სიაში. ორივე ბაქტერია მდგრადია მრავალი ანტიბიოტიკის მიმართ, ამიტომ ისინი წარმოადგენენ ინფექციებს, რომელთა მკურნალობა და კონტროლი რთულია და ამ პრობლემის გადასაჭრელად აუცილებელია ახალი და ეფექტური ანტიმიკრობული ნაერთების შემუშავება. ანტრაცენი და მისი წარმოებულები ცნობილი ანტიმიკრობული საშუალებებია, რომლებსაც შეუძლიათ როგორც გრამდადებით, ასევე გრამუარყოფით ბაქტერიებზე მოქმედება. ამ კვლევის მიზანია ახალი წარმოებულის სინთეზირება, რომელსაც შეუძლია ებრძოლოს ამ ჯანმრთელობისთვის საშიშ პათოგენებს.
ჯანდაცვის მსოფლიო ორგანიზაციის (WHO) მონაცემებით, ბაქტერიული პათოგენების უმეტესობა მდგრადია მრავალი ანტიბიოტიკის მიმართ, მათ შორის მეთიცილინ-რეზისტენტული ოქროსფერი სტაფილოკოკი (MRSA), რომელიც ინფექციის გავრცელებული მიზეზია საზოგადოებასა და ჯანდაცვის დაწესებულებებში. MRSA ინფექციის მქონე პაციენტებს, როგორც აღნიშნულია, 64%-ით მაღალი სიკვდილიანობის მაჩვენებელი აქვთ, ვიდრე წამლის მიმართ მგრძნობიარე ინფექციების მქონე პაციენტებს. გარდა ამისა, E. coli გლობალურ საფრთხეს წარმოადგენს, რადგან კარბაპენემ-რეზისტენტული ენტერობაქტერიების (ანუ E. coli) წინააღმდეგ დაცვის ბოლო ხაზი კოლისტინია, თუმცა კოლისტინის მიმართ რეზისტენტული ბაქტერიების შემთხვევები ბოლო დროს რამდენიმე ქვეყანაში დაფიქსირდა. 22,23,24,25
ამიტომ, მსოფლიო ჯანდაცვის ორგანიზაციის ანტიმიკრობული რეზისტენტობის გლობალური სამოქმედო გეგმის26 თანახმად, ახალი ანტიმიკრობული საშუალებების აღმოჩენისა და სინთეზის გადაუდებელი აუცილებლობა არსებობს. ანტრაცენისა და აკრილონიტრილის, როგორც ანტიბაქტერიული27, სოკოს საწინააღმდეგო28, კიბოს საწინააღმდეგო29 და ანტიოქსიდანტური30 საშუალებების დიდი პოტენციალი ხაზგასმულია მრავალრიცხოვან გამოქვეყნებულ ნაშრომებში. ამ მხრივ, შეიძლება ითქვას, რომ ეს წარმოებულები კარგი კანდიდატებია მეთიცილინ-რეზისტენტული ოქროსფერი სტაფილოკოკის (MRSA) წინააღმდეგ გამოსაყენებლად.
წინა ლიტერატურულმა მიმოხილვებმა მოგვცა სტიმული, რომ ამ კლასებში ახალი წარმოებულები სინთეზირებულიყო. ამიტომ, ამ კვლევის მიზანი იყო ანტრაცენისა და აკრილონიტრილის ფრაგმენტების შემცველი ახალი ჰეტეროციკლური სისტემების შემუშავება, მათი ანტიმიკრობული და ანტიბაქტერიული ეფექტურობის შეფასება და პენიცილინ-შემაკავშირებელ ცილა 2a-სთან (PBP2a) მათი პოტენციური შეკავშირების ურთიერთქმედების შესწავლა მოლეკულური დოკინგის გზით. წინა კვლევებზე დაყრდნობით, ამ კვლევამ განაგრძო ჰეტეროციკლური სისტემების სინთეზი, ბიოლოგიური შეფასება და გამოთვლითი ანალიზი, რათა გამოვლენილიყო პერსპექტიული ანტიმეთიცილინ-რეზისტენტული Staphylococcus aureus (MRSA) აგენტები, რომლებსაც აქვთ ძლიერი PBP2a ინჰიბიტორული აქტივობა31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49.
ჩვენი მიმდინარე კვლევა ფოკუსირებულია ანტრაცენისა და აკრილონიტრილის ფრაგმენტების შემცველი ახალი ჰეტეროციკლური ნაერთების სინთეზსა და ანტიმიკრობულ შეფასებაზე. 3-(ანტრაცენ-9-ილ)-2-ციანოაკრილოლილ ქლორიდი 4 მომზადდა და გამოყენებული იქნა ახალი ჰეტეროციკლური სისტემების ასაგებად საშენ მასალად.
ნაერთი 4-ის სტრუქტურა განისაზღვრა სპექტრული მონაცემების გამოყენებით. 1H-NMR სპექტრმა აჩვენა CH=-ის არსებობა 9.26 ppm-ზე, ინფრაწითელმა სპექტრმა აჩვენა კარბონილის ჯგუფის არსებობა 1737 სმ−1-ზე და ციანო ჯგუფის არსებობა 2224 სმ−1-ზე, ხოლო 13CNMR სპექტრმა ასევე დაადასტურა შემოთავაზებული სტრუქტურა (იხილეთ ექსპერიმენტული ნაწილი).
3-(ანტრაცენ-9-ილ)-2-ციანოაკრილოლილ ქლორიდის 4 სინთეზი განხორციელდა არომატული ჯგუფების 250, 41, 42, 53 ჰიდროლიზით ეთანოლური ნატრიუმის ჰიდროქსიდის ხსნარით (10%), მჟავების 354, 45, 56 მისაღებად, რომლებიც შემდეგ დამუშავდა თიონილ ქლორიდით წყლის აბაზანაზე, აკრილოილ ქლორიდის წარმოებულის 4 მაღალი მოსავლიანობით (88.5%) მისაღებად, როგორც ეს ნაჩვენებია ნახაზ 3-ზე.
მოსალოდნელი ანტიბაქტერიული ეფექტურობის მქონე ახალი ჰეტეროციკლური ნაერთების შესაქმნელად, ჩატარდა აცილქლორიდის 4-ის რეაქცია სხვადასხვა დინუკლეოფილებთან.
მჟავა ქლორიდი 4 დამუშავდა ჰიდრაზინის ჰიდრატით 0° ტემპერატურაზე ერთი საათის განმავლობაში. სამწუხაროდ, პირაზოლონ 5 არ იქნა მიღებული. პროდუქტი იყო აკრილამიდის წარმოებული, რომლის სტრუქტურა დადასტურდა სპექტრული მონაცემებით. მის ინფრაწითელ სპექტრში ნაჩვენები იყო C=O შთანთქმის ზოლები 1720 სმ−1-ზე, C≡N 2228 სმ−1-ზე და NH 3424 სმ−1-ზე. 1H-NMR სპექტრმა აჩვენა ოლეფინის პროტონებისა და NH პროტონების გაცვლითი სინგლეტის სიგნალი 9.3 ppm-ზე (იხილეთ ექსპერიმენტული ნაწილი).
მჟავა ქლორიდის 4 ორი მოლი რეაქციაში შევიდა ფენილჰიდრაზინის ერთ მოლთან, რათა მიღებულ იქნას N-ფენილაკრილოლჰიდრაზინის წარმოებული 7 კარგი მოსავლიანობით (77%) (სურათი 5). 7-ის სტრუქტურა დადასტურდა ინფრაწითელი სპექტროსკოპიის მონაცემებით, რომლებმაც აჩვენა ორი C=O ჯგუფის შთანთქმა 1691 და 1671 სმ−1-ზე, CN ჯგუფის შთანთქმა 2222 სმ−1-ზე და NH ჯგუფის შთანთქმა 3245 სმ−1-ზე, ხოლო მისმა 1H-NMR სპექტრმა აჩვენა CH ჯგუფი 9.15 და 8.81 ppm-ზე და NH პროტონი 10.88 ppm-ზე (იხილეთ ექსპერიმენტული განყოფილება).
ამ კვლევაში გამოკვლეული იქნა აცილქლორიდის 4-ის რეაქცია 1,3-დინუკლეოფილებთან. აცილქლორიდის 4-ის 1,4-დიოქსანში 2-ამინოპირიდინით დამუშავებამ TEA-ს ფუძესთან ერთად ოთახის ტემპერატურაზე მოგვცა აკრილამიდის წარმოებული 8 (სურათი 5), რომლის სტრუქტურა იდენტიფიცირებული იქნა სპექტრული მონაცემების გამოყენებით. ინფრაწითელი სპექტრები აჩვენებდა ციანოს შთანთქმის ზოლებს 2222 სმ−1-ზე, NH3148 სმ−1-ზე და კარბონილის ზოლებს 1665 სმ−1-ზე; 1H NMR სპექტრებმა დაადასტურა ოლეფინის პროტონების არსებობა 9.14 ppm-ზე (იხილეთ ექსპერიმენტული ნაწილი).
ნაერთი 4 რეაგირებს თიოშარდოვანასთან პირიმიდინეთიონის 9 წარმოქმნით; ნაერთი 4 რეაგირებს თიოსემიკარბაზიდთან თიოპირაზოლის წარმოებულის 10 წარმოქმნით (სურათი 5). ნაერთების 9 და 10 სტრუქტურები დადასტურდა სპექტრული და ელემენტარული ანალიზით (იხილეთ ექსპერიმენტული განყოფილება).
ტეტრაზინ-3-თიოლი 11 მომზადდა ნაერთი 4-ის რეაქციით თიოკარბაზიდთან, როგორც 1,4-დინუკლეოფილთან (სურათი 5), და მისი სტრუქტურა დადასტურდა სპექტროსკოპიით და ელემენტარული ანალიზით. ინფრაწითელ სპექტრში C=N ბმა გამოჩნდა 1619 სმ−1-ზე. ამავდროულად, მის 1H-NMR სპექტრში შენარჩუნებული იყო არომატული პროტონების მრავალფირფიტიანი სიგნალები 7.78–8.66 ppm-ზე და SH პროტონების 3.31 ppm-ზე (იხილეთ ექსპერიმენტული ნაწილი).
აკრილოილქლორიდი 4 რეაგირებს 1,2-დიამინობენზოლთან, 2-ამინოთიოფენოლთან, ანტრანილის მჟავასთან, 1,2-დიამინოეთანთან და ეთანოლამინთან 1,4-დინუკლეოფილების სახით ახალი ჰეტეროციკლური სისტემების წარმოსაქმნელად (13–16).
ამ ახლად სინთეზირებული ნაერთების სტრუქტურები დადასტურდა სპექტრული და ელემენტარული ანალიზით (იხ. ექსპერიმენტული ნაწილი). 2-ჰიდროქსიფენილაკრილამიდის წარმოებული 17 მიღებული იქნა 2-ამინოფენოლთან, როგორც დინუკლეოფილთან რეაქციით (სურათი 6), ხოლო მისი სტრუქტურა დადასტურდა სპექტრული და ელემენტარული ანალიზით. ნაერთი 17-ის ინფრაწითელმა სპექტრმა აჩვენა, რომ C=O და C≡N სიგნალები შესაბამისად 1681 და 2226 სმ−1-ზე გამოჩნდა. ამასობაში, მისმა 1H-NMR სპექტრმა შეინარჩუნა ოლეფინის პროტონის სინგლეტური სიგნალი 9.19 ppm-ზე, ხოლო OH პროტონი 9.82 ppm-ზე გამოჩნდა (იხ. ექსპერიმენტული ნაწილი).
ოთახის ტემპერატურაზე მჟავა ქლორიდის 4-ის რეაქციამ ერთ ნუკლეოფილთან (მაგ., ეთილამინი, 4-ტოლუიდინი და 4-მეტოქსიანილინი) დიოქსანში, როგორც გამხსნელში და TEA-ში, როგორც კატალიზატორში, მოგვცა მწვანე კრისტალური აკრილამიდის წარმოებულები 18, 19a და 19b. ნაერთების 18, 19a და 19b ელემენტარული და სპექტრული მონაცემებით დადასტურდა ამ წარმოებულების სტრუქტურები (იხ. ექსპერიმენტული ნაწილი) (სურათი 7).
სხვადასხვა სინთეზური ნაერთის ანტიმიკრობული აქტივობის სკრინინგის შემდეგ, მიღებული იქნა სხვადასხვა შედეგი, როგორც ეს ნაჩვენებია ცხრილში 1 და ნახაზ 8-ში (იხილეთ სურათის ფაილი). ყველა ტესტირებულმა ნაერთმა აჩვენა ინჰიბირების სხვადასხვა ხარისხი გრამდადებითი ბაქტერიის MRSA-ს მიმართ, ხოლო გრამუარყოფითმა ბაქტერიამ Escherichia coli-მ აჩვენა სრული რეზისტენტობა ყველა ნაერთის მიმართ. ტესტირებული ნაერთები შეიძლება დაიყოს სამ კატეგორიად MRSA-ს მიმართ ინჰიბირების ზონის დიამეტრის მიხედვით. პირველი კატეგორია იყო ყველაზე აქტიური და შედგებოდა ხუთი ნაერთისგან (6, 7, 10, 13b და 14). ამ ნაერთების ინჰიბირების ზონის დიამეტრი თითქმის 4 სმ იყო; ამ კატეგორიაში ყველაზე აქტიური ნაერთები იყო ნაერთები 6 და 13b. მეორე კატეგორია იყო ზომიერად აქტიური და შედგებოდა კიდევ ხუთი ნაერთისგან (11, 13a, 15, 18 და 19a). ამ ნაერთების ინჰიბირების ზონა მერყეობდა 3.3-დან 3.65 სმ-მდე, ნაერთი 11 აჩვენებდა ყველაზე დიდ ინჰიბირების ზონას 3.65 ± 0.1 სმ. მეორე მხრივ, ბოლო ჯგუფი შეიცავდა სამ ნაერთს (8, 17 და 19b), რომლებსაც ყველაზე დაბალი ანტიმიკრობული აქტივობა ჰქონდათ (3 სმ-ზე ნაკლები). სურათი 9 გვიჩვენებს სხვადასხვა ინჰიბირების ზონების განაწილებას.
ტესტირებული ნაერთების ანტიმიკრობული აქტივობის შემდგომი კვლევა მოიცავდა თითოეული ნაერთისთვის MIC და MBC-ის განსაზღვრას. შედეგები ოდნავ განსხვავდებოდა (როგორც ნაჩვენებია ცხრილებში 2, 3 და ნახაზ 10-ში (იხილეთ სურათის ფაილი)), ნაერთები 7, 11, 13a და 15, როგორც ჩანს, საუკეთესო ნაერთებად გადაიქცნენ. მათ ჰქონდათ იგივე ყველაზე დაბალი MIC და MBC მნიშვნელობები (39.06 μg/100 μL). მიუხედავად იმისა, რომ ნაერთებს 7 და 8 ჰქონდათ უფრო დაბალი MIC მნიშვნელობები (9.7 μg/100 μL), მათი MBC მნიშვნელობები უფრო მაღალი იყო (78.125 μg/100 μL). ამიტომ, ისინი უფრო სუსტად ითვლებოდნენ, ვიდრე ადრე ნახსენები ნაერთები. თუმცა, ეს ექვსი ნაერთი ყველაზე ეფექტური იყო ტესტირებული ნაერთებიდან, რადგან მათი MBC მნიშვნელობები 100 μg/100 μL-ზე ნაკლები იყო.
ნაერთები (10, 14, 18 და 19b) ნაკლებად აქტიური იყო სხვა ტესტირებულ ნაერთებთან შედარებით, რადგან მათი MBC მნიშვნელობები მერყეობდა 156-დან 312 μg/100 μL-მდე. მეორეს მხრივ, ნაერთები (8, 17 და 19a) ყველაზე ნაკლებად პერსპექტიული იყო, რადგან მათ ჰქონდათ MBC-ის ყველაზე მაღალი მნიშვნელობები (შესაბამისად, 625, 625 და 1250 μg/100 μL).
და ბოლოს, ცხრილში 3 მოცემული ტოლერანტობის დონეების მიხედვით, გამოცდილი ნაერთები შეიძლება დაიყოს ორ კატეგორიად მათი მოქმედების რეჟიმის მიხედვით: ბაქტერიციდული ეფექტის მქონე ნაერთები (7, 8, 10, 11, 13a, 15, 18, 19b) და ანტიბაქტერიული ეფექტის მქონე ნაერთები (6, 13b, 14, 17, 19a). მათ შორის, უპირატესობა ენიჭება ნაერთებს 7, 11, 13a და 15, რომლებიც ძალიან დაბალ კონცენტრაციაზე (39.06 μg/100 μL) ავლენენ მკვლელობის აქტივობას.
ცამეტი გამოცდილი ნაერთიდან ათმა აჩვენა პოტენციალი ანტიბიოტიკების მიმართ რეზისტენტული მეთიცილინ-რეზისტენტული Staphylococcus aureus-ის (MRSA) წინააღმდეგ. ამიტომ, რეკომენდებულია შემდგომი სკრინინგი ანტიბიოტიკების მიმართ რეზისტენტულ პათოგენებზე (განსაკუთრებით პათოგენური გრამდადებითი და გრამუარყოფითი ბაქტერიების შემცველი ადგილობრივი იზოლატები) და პათოგენური საფუარის სოკოებზე, ასევე თითოეული ნაერთის ციტოტოქსიკური ტესტირება მისი უსაფრთხოების შესაფასებლად.
სინთეზირებული ნაერთების პოტენციალის შესაფასებლად, როგორც პენიცილინისადმი მდგრადი Staphylococcus aureus-ის (MRSA) ინჰიბიტორების, ჩატარდა მოლეკულური დოკინგის კვლევები. PBP2a არის ბაქტერიული უჯრედის კედლის ბიოსინთეზში ჩართული ძირითადი ფერმენტი და ამ ფერმენტის ინჰიბირება ხელს უშლის უჯრედის კედლის ფორმირებას, რაც საბოლოოდ იწვევს ბაქტერიულ ლიზისს და უჯრედის სიკვდილს1. დოკინგის შედეგები ჩამოთვლილია ცხრილში 4 და უფრო დეტალურად აღწერილია დამატებით მონაცემთა ფაილში, და შედეგები აჩვენებს, რომ რამდენიმე ნაერთმა აჩვენა ძლიერი შეკავშირების აფინურობა PBP2a-ს მიმართ, განსაკუთრებით აქტიური ცენტრის ძირითადი ნარჩენებისთვის, როგორიცაა Lys 273, Lys 316 და Arg 298. ურთიერთქმედებები, მათ შორის წყალბადური ბმები და π-სტაკინგი, ძალიან ჰგავდა კოკრისტალიზებული ქინაზოლინონის ლიგანდის (CCL) ურთიერთქმედებებს, რაც მიუთითებს ამ ნაერთების, როგორც ძლიერი ინჰიბიტორების პოტენციალზე.
მოლეკულური დოკინგის მონაცემები, სხვა გამოთვლით პარამეტრებთან ერთად, მტკიცედ მიუთითებს, რომ PBP2a-ს ინჰიბირება იყო ამ ნაერთების დაკვირვებული ანტიბაქტერიული აქტივობის მთავარი მექანიზმი. დოკინგის ქულები და საშუალო კვადრატული გადახრის (RMSD) მნიშვნელობები კიდევ უფრო ავლენს შეკავშირების აფინურობას და სტაბილურობას, რაც ადასტურებს ამ ჰიპოთეზას. როგორც ცხრილი 4-შია ნაჩვენები, მიუხედავად იმისა, რომ რამდენიმე ნაერთმა აჩვენა კარგი შეკავშირების აფინურობა, ზოგიერთ ნაერთს (მაგ., 7, 9, 10 და 14) ჰქონდა უფრო მაღალი დოკინგის ქულები, ვიდრე თანაკრისტალიზებული ლიგანდი, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ მათ შეიძლება ჰქონდეთ უფრო ძლიერი ურთიერთქმედება PBP2a-ს აქტიური ცენტრის ნარჩენებთან. თუმცა, ყველაზე ბიოაქტიურმა ნაერთებმა 6 და 13b აჩვენეს ოდნავ დაბალი დოკინგის ქულები (შესაბამისად, -5.98 და -5.63) სხვა ლიგანდებთან შედარებით. ეს მიუთითებს იმაზე, რომ მიუხედავად იმისა, რომ დოკინგის ქულების გამოყენება შესაძლებელია შეკავშირების აფინურობის პროგნოზირებისთვის, სხვა ფაქტორებიც (მაგ., ლიგანდის სტაბილურობა და მოლეკულური ურთიერთქმედებები ბიოლოგიურ გარემოში) ასევე მნიშვნელოვან როლს თამაშობენ ანტიბაქტერიული აქტივობის განსაზღვრაში. აღსანიშნავია, რომ ყველა სინთეზირებული ნაერთის RMSD მნიშვნელობები 2 Å-ზე ნაკლები იყო, რაც ადასტურებს, რომ მათი დოკინგის პოზები სტრუქტურულად შეესაბამება კო-კრისტალიზებული ლიგანდის შეკავშირების კონფორმაციას, რაც კიდევ უფრო ადასტურებს მათ პოტენციალს, როგორც ძლიერი PBP2a ინჰიბიტორების.
მიუხედავად იმისა, რომ დოკინგის ქულები და RMS მნიშვნელობები ღირებულ პროგნოზებს იძლევა, ერთი შეხედვით, ამ დოკინგის შედეგებსა და ანტიმიკრობულ აქტივობას შორის კორელაცია ყოველთვის ნათელი არ არის. მიუხედავად იმისა, რომ PBP2a ინჰიბირება მტკიცედ არის დადასტურებული, როგორც ანტიმიკრობული აქტივობის ზეგავლენის მთავარი ფაქტორი, რამდენიმე განსხვავება მიუთითებს, რომ სხვა ბიოლოგიურ თვისებებსაც მნიშვნელოვანი როლი აქვთ. ნაერთებმა 6 და 13b აჩვენეს ყველაზე მაღალი ანტიმიკრობული აქტივობა, როგორც 4 სმ ინჰიბირების ზონის დიამეტრით, ასევე ყველაზე დაბალი MIC (9.7 μg/100 μL) და MBC (78.125 μg/100 μL) მნიშვნელობებით, მიუხედავად მათი დაბალი დოკინგის ქულებისა 7, 9, 10 და 14 ნაერთებთან შედარებით. ეს მიუთითებს, რომ მიუხედავად იმისა, რომ PBP2a ინჰიბირება ხელს უწყობს ანტიმიკრობულ აქტივობას, ისეთი ფაქტორები, როგორიცაა ხსნადობა, ბიოშეღწევადობა და ურთიერთქმედების დინამიკა ბაქტერიულ გარემოში, ასევე გავლენას ახდენს საერთო აქტივობაზე. სურათი 11 გვიჩვენებს მათ დოკინგის პოზებს, რაც მიუთითებს, რომ ორივე ნაერთი, შედარებით დაბალი შეკავშირების ქულების მიუხედავად, მაინც შეუძლია ურთიერთქმედება PBP2a-ს ძირითად ნარჩენებთან, პოტენციურად სტაბილიზაცია მოახდინოს ინჰიბირების კომპლექსთან. ეს ხაზს უსვამს იმას, რომ მიუხედავად იმისა, რომ მოლეკულური დოკინგი PBP2a ინჰიბირების შესახებ მნიშვნელოვან ინფორმაციას იძლევა, ამ ნაერთების რეალურ სამყაროში ანტიმიკრობული ეფექტების სრულად გასაგებად სხვა ბიოლოგიური ფაქტორებიც უნდა იქნას გათვალისწინებული.
PBP2a-ს კრისტალური სტრუქტურის (PDB ID: 4CJN) გამოყენებით, აგებული იქნა მეთიცილინ-რეზისტენტული Staphylococcus aureus-ის (MRSA) პენიცილინ-შემაკავშირებელი ცილა 2a-სთან (PBP2a) შეერთებული ყველაზე აქტიური ნაერთების 6 და 13b 2D და 3D ურთიერთქმედების რუკები. ეს რუკები ადარებს ამ ნაერთების ურთიერთქმედების ნიმუშებს ხელახლა შეერთებული კოკრისტალიზებული ქინაზოლინონის ლიგანდთან (CCL), ხაზს უსვამს ისეთ ძირითად ურთიერთქმედებებს, როგორიცაა წყალბადური ბმები, π-დაწყობა და იონური ურთიერთქმედებები.
მსგავსი სურათი დაფიქსირდა ნაერთი 7-ის შემთხვევაშიც, რომელმაც ნაერთი 10-ის მსგავსად შედარებით მაღალი დოკინგის ქულა (-6.32) და მსგავსი ინჰიბირების ზონის დიამეტრი (3.9 სმ) აჩვენა. თუმცა, მისი მცირე მიკოდირებადი კონცენტრაცია (MIC) (39.08 μg/100 μL) და მინერალური ბაზური კონცენტრატი (MBC) (39.06 μg/100 μL) მნიშვნელოვნად მაღალი იყო, რაც მიუთითებს, რომ ანტიბაქტერიული ეფექტის გამოსავლენად მას უფრო მაღალი კონცენტრაციები სჭირდებოდა. ეს იმაზე მიუთითებს, რომ მიუხედავად იმისა, რომ ნაერთი 7-მა დოკინგის კვლევებში ძლიერი შეკავშირების აფინურობა აჩვენა, ისეთმა ფაქტორებმა, როგორიცაა ბიოშეღწევადობა, უჯრედული შეწოვა ან სხვა ფიზიკურ-ქიმიური თვისებები, შეიძლება შეზღუდოს მისი ბიოლოგიური ეფექტურობა. მიუხედავად იმისა, რომ ნაერთი 7-მა ბაქტერიციდული თვისებები გამოავლინა, ის ნაკლებად ეფექტური იყო ბაქტერიების ზრდის ინჰიბირებაში ნაერთებთან 6 და 13b შედარებით.
ნაერთი 10-მა აჩვენა უფრო მკვეთრი განსხვავება ყველაზე მაღალი დოკინგის ქულით (-6.40), რაც მიუთითებს PBP2a-სთან ძლიერ შეკავშირების აფინურობაზე. თუმცა, მისი ინჰიბირების ზონის დიამეტრი (3.9 სმ) შედარებადი იყო ნაერთი 7-თან, ხოლო მისი MBC (312 μg/100 μL) მნიშვნელოვნად მაღალი იყო ნაერთებთან შედარებით 6, 7 და 13b, რაც მიუთითებს ბაქტერიციდულ აქტივობაზე. ეს მიუთითებს, რომ დოკინგის კარგი პროგნოზების მიუხედავად, ნაერთი 10 ნაკლებად ეფექტური იყო MRSA-ს განადგურებაში სხვა შემზღუდავი ფაქტორების გამო, როგორიცაა ხსნადობა, სტაბილურობა ან ბაქტერიული მემბრანის ცუდი გამტარიანობა. ეს შედეგები ადასტურებს იმ გაგებას, რომ მიუხედავად იმისა, რომ PBP2a-ს ინჰიბირება მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ანტიბაქტერიულ აქტივობაში, ის სრულად არ ხსნის ტესტირებულ ნაერთებს შორის დაფიქსირებულ ბიოლოგიურ აქტივობის განსხვავებებს. ეს განსხვავებები მიუთითებს, რომ საჭიროა შემდგომი ექსპერიმენტული ანალიზები და სიღრმისეული ბიოლოგიური შეფასებები ჩართული ანტიბაქტერიული მექანიზმების სრულად გასარკვევად.
ცხრილში 4 და დამატებით მონაცემთა ფაილში მოცემული მოლეკულური დოკინგის შედეგები ხაზს უსვამს დოკინგის ქულებსა და ანტიმიკრობულ აქტივობას შორის რთულ ურთიერთობას. მიუხედავად იმისა, რომ ნაერთებს 6 და 13b უფრო დაბალი დოკინგის ქულები აქვთ, ვიდრე ნაერთებს 7, 9, 10 და 14, ისინი ავლენენ ყველაზე მაღალ ანტიმიკრობულ აქტივობას. მათი ურთიერთქმედების რუკები (ნაჩვენებია ნახაზ 11-ში) მიუთითებს, რომ დაბალი შეკავშირების ქულების მიუხედავად, ისინი მაინც ქმნიან მნიშვნელოვან წყალბადურ ბმებს და π-დაწყობის ურთიერთქმედებებს PBP2a-ს ძირითად ნარჩენებთან, რომლებსაც შეუძლიათ ფერმენტ-ინჰიბიტორის კომპლექსის ბიოლოგიურად სასარგებლო გზით სტაბილიზაცია. 6 და 13b-ის შედარებით დაბალი დოკინგის ქულების მიუხედავად, მათი გაძლიერებული ანტიმიკრობული აქტივობა მიუთითებს, რომ ინჰიბიტორის პოტენციალის შეფასებისას დოკინგის მონაცემებთან ერთად უნდა იქნას გათვალისწინებული სხვა თვისებები, როგორიცაა ხსნადობა, სტაბილურობა და უჯრედული შთანთქმა. ეს ხაზს უსვამს დოკინგის კვლევების ექსპერიმენტულ ანტიმიკრობულ ანალიზთან შერწყმის მნიშვნელობას ახალი ნაერთების თერაპიული პოტენციალის ზუსტად შესაფასებლად.
ეს შედეგები ხაზს უსვამს იმას, რომ მიუხედავად იმისა, რომ მოლეკულური დოკინგი შეკავშირების აფინურობის პროგნოზირებისა და ინჰიბირების პოტენციური მექანიზმების იდენტიფიცირების ძლიერი ინსტრუმენტია, ანტიმიკრობული ეფექტურობის დასადგენად მხოლოდ მასზე არ უნდა დავეყრდნოთ. მოლეკულური მონაცემები მიუთითებს, რომ PBP2a-ს ინჰიბირება ანტიმიკრობულ აქტივობაზე მოქმედი მთავარი ფაქტორია, მაგრამ ბიოლოგიური აქტივობის ცვლილებები მიუთითებს, რომ თერაპიული ეფექტურობის გასაძლიერებლად სხვა ფიზიკურ-ქიმიური და ფარმაკოკინეტიკური თვისებები უნდა იყოს ოპტიმიზებული. მომავალი კვლევები უნდა ფოკუსირებული იყოს ნაერთების 7 და 10 ქიმიური სტრუქტურის ოპტიმიზაციაზე, რათა გაუმჯობესდეს ბიოშეღწევადობა და უჯრედული შთანთქმა, რაც უზრუნველყოფს, რომ ძლიერი დოკინგი ურთიერთქმედებები რეალურ ანტიმიკრობულ აქტივობად გარდაიქმნება. შემდგომი კვლევები, მათ შორის დამატებითი ბიოანალიზები და სტრუქტურა-აქტივობის ურთიერთობის (SAR) ანალიზი, კრიტიკულად მნიშვნელოვანი იქნება იმის უკეთ გასაგებად, თუ როგორ ფუნქციონირებენ ეს ნაერთები, როგორც PBP2a ინჰიბიტორები, და უფრო ეფექტური ანტიმიკრობული აგენტების შესამუშავებლად.
3-(ანტრაცენ-9-ილ)-2-ციანოაკრილოლის ქლორიდიდან 4 სინთეზირებულმა ნაერთებმა ანტიმიკრობული აქტივობის სხვადასხვა ხარისხი გამოავლინეს, რამდენიმე ნაერთმა კი მეთიცილინ-რეზისტენტული ოქროსფერი სტაფილოკოკის (MRSA) მნიშვნელოვანი ინჰიბირება აჩვენა. სტრუქტურა-აქტივობის ურთიერთობის (SAR) ანალიზმა გამოავლინა ამ ნაერთების ანტიმიკრობული ეფექტურობის საფუძვლად მყოფი ძირითადი სტრუქტურული მახასიათებლები.
როგორც აკრილონიტრილის, ასევე ანტრაცენის ჯგუფების არსებობა კრიტიკულად მნიშვნელოვანი აღმოჩნდა ანტიმიკრობული აქტივობის გასაძლიერებლად. აკრილონიტრილში არსებული მაღალრეაქტიული ნიტრილის ჯგუფი აუცილებელია ბაქტერიულ ცილებთან ურთიერთქმედების გასაადვილებლად, რითაც ხელს უწყობს ნაერთის ანტიმიკრობული თვისებების განვითარებას. როგორც აკრილონიტრილის, ასევე ანტრაცენის შემცველი ნაერთები მუდმივად ავლენდნენ უფრო ძლიერ ანტიმიკრობულ ეფექტებს. ანტრაცენის ჯგუფის არომატულობამ კიდევ უფრო სტაბილიზაცია გაუწია ამ ნაერთებს, პოტენციურად გააძლიერა მათი ბიოლოგიური აქტივობა.
ჰეტეროციკლური რგოლების შეყვანამ მნიშვნელოვნად გააუმჯობესა რამდენიმე წარმოებულის ანტიბაქტერიული ეფექტურობა. კერძოდ, ბენზოთიაზოლის წარმოებულმა 13b-მ და აკრილჰიდრაზიდის წარმოებულმა 6-მა აჩვენეს ყველაზე მაღალი ანტიბაქტერიული აქტივობა დაახლოებით 4 სმ ინჰიბირების ზონით. ამ ჰეტეროციკლური წარმოებულებმა აჩვენეს უფრო მნიშვნელოვანი ბიოლოგიური ეფექტები, რაც მიუთითებს, რომ ჰეტეროციკლური სტრუქტურა მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ანტიბაქტერიულ ეფექტებში. ანალოგიურად, ნაერთ 9-ში პირიმიდინეთიონმა, ნაერთ 10-ში თიოპირაზოლმა და ნაერთ 11-ში ტეტრაზინის რგოლმა წვლილი შეიტანა ნაერთების ანტიბაქტერიულ თვისებებში, რაც კიდევ უფრო უსვამს ხაზს ჰეტეროციკლური მოდიფიკაციის მნიშვნელობას.
სინთეზირებულ ნაერთებს შორის, 6 და 13b გამოირჩეოდნენ შესანიშნავი ანტიბაქტერიული აქტივობით. ნაერთი 6-ის მინიმალური ინჰიბიტორული კონცენტრაცია (MIC) იყო 9.7 μg/100 μL, ხოლო მინიმალური ბაქტერიციდული კონცენტრაცია (MBC) იყო 78.125 μg/100 μL, რაც ხაზს უსვამს მის შესანიშნავ უნარს, გაანადგუროს მეთიცილინ-რეზისტენტული Staphylococcus aureus (MRSA). ანალოგიურად, ნაერთ 13b-ს ჰქონდა 4 სმ ინჰიბირების ზონა და დაბალი MIC და MBC მნიშვნელობები, რაც ადასტურებს მის ძლიერ ანტიბაქტერიულ აქტივობას. ეს შედეგები ხაზს უსვამს აკრილჰიდრაზიდის და ბენზოთიაზოლის ფუნქციური ჯგუფების ძირითად როლს ამ ნაერთების ბიოეფექტურობის განსაზღვრაში.
ამის საპირისპიროდ, ნაერთებმა 7, 10 და 14 აჩვენეს ზომიერი ანტიბაქტერიული აქტივობა 3.65-დან 3.9 სმ-მდე ინჰიბირების ზონებით. ამ ნაერთებს ბაქტერიების სრულად გასანადგურებლად უფრო მაღალი კონცენტრაცია სჭირდებოდათ, რაც აისახება მათ შედარებით მაღალ MIC და MBC მნიშვნელობებზე. მიუხედავად იმისა, რომ ეს ნაერთები ნაკლებად აქტიური იყო, ვიდრე ნაერთები 6 და 13b, მათ მაინც აჩვენეს მნიშვნელოვანი ანტიბაქტერიული პოტენციალი, რაც მიუთითებს, რომ აკრილონიტრილისა და ანტრაცენის ფრაგმენტების ჰეტეროციკლურ რგოლში ჩართვა ხელს უწყობს მათ ანტიბაქტერიულ ეფექტს.
ნაერთებს მოქმედების სხვადასხვა რეჟიმი აქვთ, ზოგი ბაქტერიციდულ თვისებებს ავლენს, ზოგი კი ბაქტერიოსტატიკურ ეფექტს. ნაერთები 7, 11, 13a და 15 ბაქტერიციდულია და ბაქტერიების სრულად გასანადგურებლად უფრო დაბალ კონცენტრაციას საჭიროებს. ამის საპირისპიროდ, ნაერთები 6, 13b და 14 ბაქტერიოსტატიკურია და უფრო დაბალ კონცენტრაციებზე შეუძლიათ ბაქტერიების ზრდის დათრგუნვა, მაგრამ ბაქტერიების სრულად გასანადგურებლად უფრო მაღალ კონცენტრაციას საჭიროებენ.
საერთო ჯამში, სტრუქტურა-აქტივობის ურთიერთობის ანალიზი ხაზს უსვამს აკრილონიტრილისა და ანტრაცენის ფრაგმენტების და ჰეტეროციკლური სტრუქტურების შეყვანის მნიშვნელობას მნიშვნელოვანი ანტიბაქტერიული აქტივობის მისაღწევად. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ ამ სტრუქტურული კომპონენტების ოპტიმიზაციამ და ხსნადობისა და მემბრანის გამტარიანობის გასაუმჯობესებლად შემდგომი მოდიფიკაციების შესწავლამ შეიძლება გამოიწვიოს უფრო ეფექტური MRSA-ს საწინააღმდეგო პრეპარატების შემუშავება.
ყველა რეაგენტი და გამხსნელი გაიწმინდა და გაშრა სტანდარტული პროცედურების გამოყენებით (ელ გომჰურია, ეგვიპტე). დნობის წერტილები განისაზღვრა GallenKamp-ის ელექტრონული დნობის წერტილის აპარატის გამოყენებით და მოცემულია კორექტირების გარეშე. ინფრაწითელი (IR) სპექტრები (სმ⁻1) ჩაიწერა ქიმიის დეპარტამენტში, მეცნიერების ფაკულტეტზე, აინ შამსის უნივერსიტეტში, კალიუმის ბრომიდის (KBr) გრანულების გამოყენებით Thermo Electron Nicolet iS10 FTIR სპექტრომეტრზე (Thermo Fisher Scientific, უოლტჰემი, მასაჩუსეტსი, აშშ).
1H ბირთვული მაგნიტური რეზონანსის სპექტრები მიღებული იქნა 300 MHz სიხშირეზე GEMINI ბირთვული მაგნიტური რეზონანსის სპექტრომეტრის (GEMINI Manufacturing & Engineering, ანაჰაიმი, კალიფორნია, აშშ) და BRUKER 300 MHz ბირთვული მაგნიტური რეზონანსის სპექტრომეტრის (BRUKER Manufacturing & Engineering, Inc.) გამოყენებით. ტეტრამეთილსილანი (TMS) გამოყენებული იქნა როგორც შიდა სტანდარტი დეიტერირებულ დიმეთილსულფოქსიდთან (DMSO-d₆). ბირთვული მაგნიტური რეზონანსის გაზომვები ჩატარდა კაიროს უნივერსიტეტის მეცნიერებათა ფაკულტეტზე, გიზა, ეგვიპტე. ელემენტარული ანალიზი (CHN) ჩატარდა Perkin-Elmer 2400 ელემენტარული ანალიზატორის გამოყენებით და მიღებული შედეგები კარგად შეესაბამება გამოთვლილ მნიშვნელობებს.
მჟავა 3-ის (5 მმოლი) და თიონილქლორიდის (5 მლ) ნარევი გაცხელდა წყლის აბაზანაში 65°C ტემპერატურაზე 4 საათის განმავლობაში. ზედმეტი თიონილქლორიდი მოშორდა დისტილაციით შემცირებული წნევის ქვეშ. მიღებული წითელი მყარი ნივთიერება შეგროვდა და გამოყენებული იქნა შემდგომი გაწმენდის გარეშე. დნობის ტემპერატურა: 200-202°C, გამოსავლიანობა: 88.5%. ინფრაწითელი დიაპაზონი (KBr, ν, cm−1): 2224 (C≡N), 1737 (C=O). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 9.26 (s, 1H, CH=), 7.27-8.57 (m, 9H, ჰეტეროარომატიზაცია). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 115.11 (C≡N), 124.82–130.53 (CH ანტრაცენი), 155.34, 114.93 (CH=C–C=O), 162.22 (C=O); HRMS (ESI) m/z [M + H]+: 291.73111. ანალიტიკოსი. გამოთვლილია C18H10ClNO (291.73)-სთვის: C, 74.11; H, 3.46; N, 4.80. ნაპოვნია: C, 74.41; H, 3.34; N, 4.66%.
0°C-ზე, 4 (2 მმოლი, 0.7 გ) გახსნეს უწყლო დიოქსანში (20 მლ) და წვეთ-წვეთობით დაუმატეს ჰიდრაზინის ჰიდრატი (2 მმოლი, 0.16 მლ, 80%) და მოურიეს 1 საათის განმავლობაში. ნალექი შეგროვდა ფილტრაციით და ხელახლა დაკრისტალდა ეთანოლიდან ნაერთი 6-ის მისაღებად.
მწვანე კრისტალები, დნობის წერტილი 190-192℃, გამოსავლიანობა 69.36%; ინფრაწითელი (KBr) ν=3424 (NH), 2228 (C≡N), 1720 (C=O), 1621 (C=N) სმ−1. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 9.3 (br s, H, NH, ურთიერთშემცვლელი), 7.69-8.51 (m, 18H, ჰეტეროარომატული), 9.16 (s, 1H, CH=), 8.54 (s, 1H, CH=); C33H21N3O-სთვის გამოთვლილი მნიშვნელობა (475.53): C, 83.35; H, 4.45; N, 8.84. ნაპოვნია: C, 84.01; H, 4.38; N, 8.05%.
გახსენით 4 (2 მმოლი, 0.7 გ) 20 მლ უწყლო დიოქსანის ხსნარში (რომელიც შეიცავს ტრიეთილამინის რამდენიმე წვეთს), დაამატეთ ფენილჰიდრაზინი/2-ამინოპირიდინი (2 მმოლი) და მოურიეთ ოთახის ტემპერატურაზე, შესაბამისად, 1 და 2 საათის განმავლობაში. გადაასხით რეაქციის ნარევი ყინულში ან წყალში და გაამჟავეთ განზავებული მარილმჟავათი. გაფილტრეთ გამოყოფილი მყარი ნივთიერება და ხელახლა კრისტალიზეთ ეთანოლიდან 7-ის მისაღებად და ხელახლა კრისტალიზეთ ბენზოლიდან 8-ის მისაღებად.
მწვანე კრისტალები, დნობის წერტილი 160-162℃, გამოსავლიანობა 77%; ინფრაწითელი დიაპაზონი (KBr, ν, cm−1): 3245 (NH), 2222 (C≡N), 1691 (C=O), 1671 (C=O) cm−1. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm): 10.88 (s, 1H, NH, ურთიერთშემცვლელი), 9.15 (s, 1H, CH=), 8.81 (s, 1H, CH=), 6.78-8.58 (m, 23H, ჰეტეროარომატული); C42H26N4O2-ის გამოთვლილი მნიშვნელობა (618.68): C, 81.54; H, 4.24; N, 9.06. ნაპოვნია: C, 81.96; H, 3.91; N, 8.91%.
4 (2 მმოლი, 0.7 გ) გახსნეს 20 მლ უწყლო დიოქსანის ხსნარში (რომელიც შეიცავდა ტრიეთილამინის რამდენიმე წვეთს), დაემატა 2-ამინოპირიდინი (2 მმოლი, 0.25 გ) და ნარევი მოურიეს ოთახის ტემპერატურაზე 2 საათის განმავლობაში. რეაქციის ნარევი ჩაასხეს ყინულიან წყალში და გაამჟავეს განზავებული მარილმჟავით. წარმოქმნილი ნალექი გაფილტრეს და ბენზოლიდან ხელახლა დაკრისტალდა, რის შედეგადაც მიიღეს 8-ის მწვანე კრისტალები 146-148 °C დნობის წერტილით და 82.5% გამოსავლიანობით; ინფრაწითელი სპექტრი (KBr) ν: 3148 (NH), 2222 (C≡N), 1665 (C=O) სმ−1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm): 8.78 (s, H, NH, ურთიერთშემცვლელი), 9.14 (s, 1H, CH=), 7.36-8.55 (m, 13H, ჰეტეროარომატიზაცია); გამოთვლილია C23H15N3O-სთვის (348.38): C, 79.07; H, 4.33; N, 12.03. ნაპოვნია: C, 78.93; H, 3.97; N, 12.36%.
ნაერთი 4 (2 მმოლი, 0.7 გ) გახსნეს 20 მლ მშრალ დიოქსანში (რომელიც შეიცავდა ტრიეთილამინის რამდენიმე წვეთს და თიოშარდოვანას/სემიკარბაზიდის 2 მმოლს) და გააცხელეს უკუმაცივარში 2 საათის განმავლობაში. გამხსნელი აორთქლდა ვაკუუმში. ნაშთი ხელახლა დაკრისტალდა დიოქსანიდან ნარევის მისაღებად.