ცილების დახარისხება სეკრეტორულ გზაზე აუცილებელია უჯრედის კომპარტმენტალიზაციისა და ჰომეოსტაზის შესანარჩუნებლად. გარსით განპირობებული დახარისხების გარდა, ლიპიდების როლი კინეზინის დახარისხებაში სეკრეტორული ტრანსპორტის პროცესში დიდი ხნის ძირითადი კითხვაა, რომელზეც პასუხი ჯერ არ არის გაცემული. აქ ჩვენ ვატარებთ 3D ერთდროულ მრავალფეროვან მაღალი გარჩევადობის რეალურ დროში გამოსახულებას, რათა დავამტკიცოთ in vivo, რომ ახლად სინთეზირებული გლიკოზილფოსფატიდილინოზიტოლ-იმობილიზებული ცილები ძალიან გრძელი ცერამიდის ლიპიდური ფრაგმენტებით ჯგუფდება და კლასიფიცირდება სპეციალიზებულ ენდოპლაზმებად - წმინდა გასასვლელ ადგილას, რომელიც განსხვავდება ტრანსმემბრანული ცილებისგან. გარდა ამისა, ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ ენდოპლაზმური ბადის მემბრანაში ცერამიდის ჯაჭვის სიგრძე კრიტიკულია ამ დახარისხების სელექციურობისთვის. ჩვენი კვლევა იძლევა პირველ პირდაპირ in vivo მტკიცებულებას, რათა ცილოვანი ტვირთები კლასიფიცირდეს ლიპიდური ჯაჭვის სიგრძის მიხედვით სელექციურ ექსპორტის ადგილებში სეკრეტორულ გზაზე.
ეუკარიოტულ უჯრედებში, ენდოპლაზმურ ბადეში (ER) სინთეზირებული ცილები შემდეგ დახარისხდება ტრანსპორტირების დროს სეკრეტორული გზით, რათა მიაღწიონ მათ შესაბამის უჯრედულ დანიშნულების ადგილს (1). გარსით განპირობებული დახარისხების გარდა, დიდი ხნის განმავლობაში ითვლებოდა, რომ გარკვეული ლიპიდები ასევე შეიძლება იმოქმედონ როგორც შერჩევითი გასასვლელი წერტილები, მათი სპეციფიკური მემბრანული დომენების, კონკრეტული ცილების დაჯგუფებით (2-5). თუმცა, ჯერ კიდევ არ არსებობს პირდაპირი in vivo მტკიცებულება, რომელიც დაამტკიცებს ამ შესაძლო ლიპიდურ მექანიზმს. ამ ძირითადი პრობლემის გადასაჭრელად, ჩვენ შევისწავლეთ საფუარაში, თუ როგორ ხდება გლიკოზილფოსფატიდილინოზიტოლის (GPI) მიმაგრებული ცილების (GPI-APs) დიფერენცირებადი ექსპორტი ER-დან. GPI-APs წარმოადგენს ლიპიდებთან დაკავშირებული უჯრედის ზედაპირის ცილების ნაირსახეობას (6, 7). GPI-AP არის სეკრეტირებული ცილა, რომელიც მიმაგრებულია პლაზმური მემბრანის გარეთა ფურცლებზე გლიკოლიპიდური ნაწილის (GPI მიმაგრება) მეშვეობით. ისინი იღებენ GPI მიმაგრებებს, როგორც კონსერვატიულ პოსტ-ტრანსლაციურ მოდიფიკაციებს ER სანათურში (8). მიმაგრების შემდეგ, GPI-AP გადის გოლჯის აპარატში (5, 9) ეროზიული გარსიდან პლაზმურ მემბრანაში. GPI-ის მიმაგრების კვანძების არსებობა იწვევს GPI-AP-ის ტრანსპორტირებას ტრანსმემბრანული სეკრეციის ცილებისგან (მათ შორის სხვა პლაზმური მემბრანის ცილებისგან) განცალკევებით სეკრეტორული გზით (5, 9, 10). საფუარის უჯრედებში, GPI-AP-ები გამოყოფილია სხვა სეკრეციის ცილებისგან ენდოპლაზმურ ბადეში და შემდეგ იფუთება უნიკალურ ვეზიკულებში, რომლებიც შემოხვეულია გარსის ცილის კომპლექსით II (COPII) (6, 7). ეროზიული გარსის ექსპორტის პროცესში ამ კლასიფიკაციის პროცესის განმსაზღვრელი ფაქტორები გაურკვეველია, მაგრამ ვარაუდობენ, რომ ამ მექანიზმს შეიძლება დასჭირდეს ლიპიდები, განსაკუთრებით GPI-ის მიმაგრების ლიპიდური ნაწილის სტრუქტურული რემოდელირება (5, 8). საფუარში, GPI-ის ლიპიდური რემოდელირება იწყება GPI-ის მიმაგრებისთანავე და ბევრ შემთხვევაში, ეს იწვევს ცერამიდის შეკავშირებას 26-ნახშირბადიან გრძელჯაჭვიან ნაჯერ ცხიმოვან მჟავასთან (C26:0) (11, 12). C26 ცერამიდი დღემდე საფუარის უჯრედების მიერ წარმოებული ძირითადი ცერამიდია. ის სინთეზირდება ეროზიტოლ ფოსფატ ცერამიდში და მისი უმეტესი ნაწილი გოლჯის აპარატში COPII ვეზიკულების მეშვეობით ექსპორტირდება (13). GPI-AP-ის ეროზიტოლ ფოსფატ ცერამიდში ექსპორტი კონკრეტულად მოითხოვს ცერამიდის მიმდინარე სინთეზს (14, 15) და, თავის მხრივ, ცერამიდის ინოზიტოლ ფოსფატ ცერამიდად (IPC) გოლჯის აპარატში გარდაქმნა დამოკიდებულია GPI-ის წამყვანის სინთეზზე (16). ხელოვნური მემბრანების გამოყენებით ჩატარებულმა ბიოფიზიკურმა კვლევებმა აჩვენა, რომ ძალიან გრძელი აცილის ჯაჭვის ცერამიდები შეიძლება გაერთიანდნენ და შექმნან მოწესრიგებული დომენები უნიკალური ფიზიკური თვისებებით (17, 18). ეს მონაცემები იწვევს ჰიპოთეზას, რომ C26 ცერამიდი და GPI-AP C26 ცერამიდით იყენებენ თავიანთ ფიზიკურ თვისებებს მოწესრიგებულ რეგიონებად ან რეგიონებად გაერთიანდნენ შედარებით არეულ ეროზიტოლ ფოსფატ მემბრანის ლიპიდურ გარემოში. ის ძირითადად შედგება მოკლე და უჯერი გლიცეროლიპიდებისგან (C16:1 და C18:1) (19, 20). ეს რეგიონები შერჩევითად იქნება ფოკუსირებული ER-ის კონკრეტულ გასასვლელ ადგილებზე (ERES), სადაც კერამიდი და კერამიდზე დაფუძნებული GPI-AP შეიძლება ერთად გადაიტანონ გოლჯის აპარატში იმავე სპეციალურ COPII ვეზიკულაში (5).
ამ კვლევაში, ჩვენ პირდაპირ გამოვცადეთ ლიპიდებზე დაფუძნებული ეს მექანიზმი სუპერგარჩევადობის კონფოკალური რეალურ დროში ვიზუალიზაციის მიკროსკოპიის (SCLIM) გამოყენებით, რომელიც წარმოადგენს ულტრათანამედროვე მიკროსკოპიის ტექნიკას, რომელსაც შეუძლია ერთდროულად დააკვირდეს ფლუორესცენციულად მონიშნულ ცილებს. სამფეროვან და სამგანზომილებიან (3D) გამოსახულებებს აქვთ უკიდურესად მაღალი გარჩევადობა და სიჩქარე ცოცხალ უჯრედებში (21, 22).
თავდაპირველად, ჩვენ გამოვიყენეთ SCLIM ტექნოლოგია, რათა უფრო დეტალურად გაგვერკვია, თუ როგორ მოწმდებოდა S. cerevisiae-ში ტრანსმემბრანული სეკრეციის მქონე ცილებიდან ნორმალური GPI-AP C26 ცერამიდის ჯგუფით, ER-დან გამოსვლის შემდეგ. ER-ის კლასიფიკაციის შესამოწმებლად, ჩვენ გამოვიყენეთ გენეტიკური სისტემა, რომელსაც შეუძლია პირდაპირ ვიზუალიზაცია გაუკეთოს ახლად სინთეზირებულ ტვირთს ERES-ში in vivo (7, 23). ტვირთად ავირჩიეთ C26 ცერამიდზე დაფუძნებული GPI-AP Gas1, მონიშნული მწვანე ფლუორესცენტული ცილით (GFP) და ტრანსმემბრანული სეკრეციის მქონე ცილა Mid2, მონიშნული ახლო ინფრაწითელი ფლუორესცენტული ცილით (iRFP), რომელთაგან ორივე პლაზმურ მემბრანაზეა ორიენტირებული (24–26). sec31-1 ტემპერატურისადმი მგრძნობიარე მუტანტში, ეს ორი ტვირთი ექსპრესირდება გალაქტოზას ინდუცირებადი პრომოტერის და კონსტიტუციური ERES მარკერის ქვეშ. ექსტრემალურ ტემპერატურაზე (37°C), რადგან sec31-1 მუტაცია გავლენას ახდენს COPII გარსის კომპონენტის Sec31 ფუნქციაზე, რათა დათრგუნოს COPII-ის გაღივება და ER ექსპორტი, ახლად სინთეზირებული ტვირთი გროვდება ER-ში (23). დაბალ ტემპერატურამდე (24°C) გაგრილების შემდეგ, sec31-1 მუტანტური უჯრედები აღდგა სეკრეტორული ზონიდან და დაგროვილი ახალი სინთეზური ტვირთის ექსპორტი დაიწყო ეროზიული უჯრედიდან. CLIM ვიზუალიზაციამ აჩვენა, რომ ახლად სინთეზირებული Gas1-GFP და Mid2-iRFP-ის უმეტესი ნაწილი კვლავ გროვდებოდა sec31-1 მუტანტური უჯრედების ეროზიულ უჯრედში 37°C-ზე ინკუბაციის შემდეგ და შემდეგ გამოთავისუფლდებოდა 24°C-ზე 5 წუთის განმავლობაში (სურათი 1). ვინაიდან Mid2-iRFP განაწილებულია მთელ ეროზიული უჯრედის მემბრანაზე, ხოლო Gas1-GFP კონცენტრირებული და გროვდება ეროზიული უჯრედის მემბრანის წყვეტილ არეალში, მათი განაწილება სრულიად განსხვავებულია (სურათი 1, A-დან C-მდე და ფილმი S1). გარდა ამისა, როგორც ნაჩვენებია სურათ 1D-ზე, Gas1-GFP კლასტერს არ აქვს Mid2-iRFP. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ GPI-AP და ტრანსმემბრანული ცილები ადრეულ ეტაპზევე გამოიყო ეროზიული უჯრედის მემბრანის სხვადასხვა რეგიონად. Gas1-GFP კლასტერი მიმდებარედ მდებარეობს სპეციფიკურ ERES-თან, რომელიც მონიშნულია mCherry-ის COPII გარსის ცილით Sec13 (სურათი 1, E და F, და ფილმი S1) (23).
sec31-1 უჯრედები გამოხატავენ გალაქტოზით ინდუცირებულ სეკრეციას, გრძელ აცილის ჯაჭვის (C26) კერამიდს GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, მწვანე) და ტრანსმემბრანულ ცილას Mid2-iRFP (TMP, ლურჯი) და ეს კონსტრუქციული ERES მარკირება Sec13-mCherry (ERES, მეწამული) ინკუბირებული იქნა 37°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში, გადატანილი იქნა 24°C-ზე და 5 წუთის შემდეგ გადაღებულია SCLIM-ით. (A-დან C-მდე) გვიჩვენებს სიბრტყის წარმომადგენლობით გაერთიანებულ ან ერთ 2D გამოსახულებას (A), 10 z-სექციანის 2D პროექციულ გამოსახულებას (B) ან ტვირთისა და ERES მარკერების 3D უჯრედის ნახევარსფეროს გამოსახულებას (C). მასშტაბის ზოლი 1μm (A და B). მასშტაბის ერთეულია 0.551μm (C). Gas1-GFP აღმოჩენილი იქნა დისკრეტულ ER რეგიონებში ან კლასტერებში, ხოლო Mid2-iRFP აღმოჩენილი და გავრცელებული იქნა ER მემბრანაში (C). (D) გრაფიკი აჩვენებს Gas1-GFP-ის და Mid2-iRFP-ის ფარდობით ფლუორესცენციის ინტენსივობას Gas1-GFP კლასტერში თეთრი ისრის ხაზის გასწვრივ (მარცხნივ). AU, თვითნებური ერთეული. (E და F) წარმოადგენს 3D გამოსახულებას, რომელიც აერთიანებს საქონლისა და ERES ნიშანს. Gas1-GFP კლასტერები აღმოჩენილი იქნა კონკრეტული ERES-ის მახლობლად. მასშტაბის ერთეულია 0.551μm. (F) თეთრი უწყვეტი ისარი აღნიშნავს ERES-თან დაკავშირებულ Gas1-GFP კლასტერს. შუა და მარჯვენა პანელები აჩვენებს გაერთიანებულ გადიდებულ 3D გამოსახულებას და შერჩეული Gas1-GFP კლასტერის ბრუნვით ხედს.
Gas1-GFP კლასტერსა და კონკრეტულ ERES-ს შორის მჭიდრო სივრცითი კავშირი მიუთითებს, რომ Gas1-GFP-ს შეუძლია შერჩევით ERES-ში შესვლა, რაც განსხვავდება Mid2-iRFP-ის მიერ ER-დან გასასვლელად გამოყენებული შერჩევითობისგან. ამ შესაძლებლობის გამოსასწორებლად, ჩვენ განვსაზღვრეთ ERES-ის თანაფარდობა მხოლოდ ერთი ან ორი საქონლისთვის (სურათი 2, A-დან C-მდე). აღმოვაჩინეთ, რომ ERES-ის უმეტესობა (70%) შეიცავს მხოლოდ ერთი ტიპის ტვირთს. სურათი 2C-ის ქვედა სურათზე ნაჩვენებია ERES-ის ორი ტიპიური მაგალითი მხოლოდ Gas1-GFP-ით (სურათი 1) ან მხოლოდ Mid2-iRFP-ით (სურათი 2). ამის საპირისპიროდ, ERES-ის დაახლოებით 20% შეიცავს ორ ტვირთს, რომლებიც ერთსა და იმავე არეალში გადაფარავს ერთმანეთს. აღმოჩნდა, რომ ზოგიერთი ERES (10%) შეიცავდა ორი ტიპის ტვირთს, მაგრამ ისინი იზოლირებული იყო აშკარად განსხვავებულ არეალში. ამიტომ, ეს სტატისტიკური ანალიზი აჩვენებს, რომ ER-ის ექსპორტის შემდეგ, GPI-AP Gas1-GFP და ტრანსმემბრანული ტვირთი Mid2-iRFP იყოფა სხვადასხვა ERES-ად (სურათი 2D). ეს დახარისხების ეფექტურობა ძალიან შეესაბამება წინა ბიოქიმიურ ანალიზს (6) და მორფოლოგიურ განსაზღვრას (7). ჩვენ ასევე შეგვიძლია დავაკვირდეთ ERES-ში შემავალი კარანტინირებული ტვირთის ქცევას (სურათი 2E და ვიდეო S2). სურათი 2E აჩვენებს, რომ Gas1-GFP-ის (პანელი 3) ან Mid2-iRFP-ის (პანელი 4) მხოლოდ მცირე ნაწილი შედის ERES-ში ერთი მხრიდან და შემოიფარგლება დისკრეტულ არეალში. სურათი 2E-ს მე-5 პანელი აჩვენებს, რომ Gas1-GFP და Mid2-iRFP ზოგჯერ გვხვდება ერთსა და იმავე ERES-ში, მაგრამ ისინი შედიან სხვადასხვა მხრიდან და კონცენტრირებულნი არიან ცალკეულ რეგიონებში, რომლებიც შეიძლება წარმოადგენდნენ სხვადასხვა COPII ვეზიკულებს. ჩვენ ასევე დავადასტურეთ, რომ C26 კერამიდზე დაფუძნებული GPI-AP Gas1-ის, როგორც სელექციური ERES-ის, დაკვირვებული გამოყოფა და კლასიფიკაცია სპეციფიკურია, რადგან კიდევ ერთი ტრანსმემბრანული სეკრეციის ტვირთი, GFP-ნიშანდებული პლაზმური მემბრანის ცილა Axl2 (27), ავლენს Mid2-iRFP-ის მსგავს ქცევას. (სურათი S1 და ვიდეო S3). ახლად სინთეზირებული Axl2-GFP ნაწილდება ER მემბრანაში Mid2-iRFP-ის მსგავსად (სურათი S1, A და B) და თანალოკალიზებულია Mid2-iRFP-თან ERES-ის უმეტესობაში (სურათი S1, B-დან D-მდე). სურათი 1-ის S1C პანელები 1 და 2 გვიჩვენებს ERES-ის ორ ტიპურ მაგალითს, სადაც ორი ტრანსმემბრანული ტვირთი გადაფარავს ერთმანეთს. ამ შემთხვევებში, ორივე საქონელი ერთად შედის ERES-ში (სურათი S1E, პანელი 3 და ფილმი S3).
გალაქტოზით ინდუცირებადი სეკრეციის გამომხატველი sec31-1 უჯრედები, Gas1-GFP (GPI-AP, მწვანე) და Mid2-iRFP (TMP, ლურჯი) და ERES-ის კონსტიტუციური მარკირება Sec13-mCherry (ERES, მეწამული) მოათავსეს 37°C-ზე. 30 წუთიანი ინკუბაციის შემდეგ °C-ზე, სეკრეციის ბლოკის გამოსათავისუფლებლად გადაიტანეთ 24°C-ზე და 20 წუთის შემდეგ გადაიღეთ გამოსახულება SCLIM-ით. (A-დან C-მდე) ტვირთის წარმომადგენლობითი 2D პროექციის სურათები (A; მასშტაბის ზოლი, 1μm) ან 3D უჯრედული ნახევარსფეროს სურათები (B და C; მასშტაბის ერთეული, 0.456μm) და ERES-ით მონიშნული 10 z-სექცია. (B)-ში ქვედა პანელი და (C)-ში პანელი აჩვენებს დამუშავებულ სურათებს მხოლოდ ERES-ში (მეწამული) არსებული საქონლის საჩვენებლად [Gas1-GFP (ნაცრისფერი) და Mid2-iRFP (ღია ლურჯი)]. (C) ღია ისარი: ERES შეიცავს ტვირთის მხოლოდ ერთ ნაწილს (1-დან 4-მდე). ნაცრისფერი ისარი: ERES შეიცავს განცალკევებულ ტვირთს (5). თეთრი უწყვეტი ისარი: ERES შეიცავს ერთად განლაგებულ ტვირთს. ქვემოთ: შერჩეული ერთი ERES შეიცავს მხოლოდ Gas1-GFP (1) ან Mid2-iRFP (2). მასშტაბის ზოლი, 100 ნმ. (D) (C)-ში აღწერილი ფოტომიკროგრაფიის რაოდენობრივი განსაზღვრა. ERES-ის საშუალო პროცენტული მაჩვენებელი, რომელიც შეიცავს მხოლოდ ერთ ტვირთს (Gas1-GFP ან Mid2-iRFP), განცალკევებულ ტვირთს და გადაფარულ ტვირთს. სამ დამოუკიდებელ ექსპერიმენტში, n=432 54 უჯრაში. შეცდომის ზოლი = სტანდარტული გადახრა. ორმხრივი შეუწყვილებელი t ტესტი. *** P = 0.0002. (E) კარანტინში მყოფი ტვირთის შერჩეული ERES-ის 3D გამოსახულება, რომელიც აღნიშნულია (C). Gas1-GFP (მწვანე) (3) ან Mid2-iRFP (ლურჯი) (4) შედის ERES-ში (მეწამული) ერთი მხრიდან და შემოიფარგლება ERES-ის მცირე ფართობით. ზოგჯერ, ორივე ტიპის ტვირთი ერთსა და იმავე ERES-ში (5) ერთი და იგივე მხრიდან შედის და ERES-ის შიგნით იზოლირებულ ტერიტორიაზეა შემოფარგლული. მასშტაბის ზოლი, 100 ნმ.
შემდეგ, ჩვენ გამოვცადეთ ჰიპოთეზა, რომ ER მემბრანაში არსებული გრძელი აცილის ჯაჭვის ცერამიდი (C26) განაპირობებს Gas1-ის სპეციფიკურ კლასტერიზაციას და დახარისხებას სელექციურ ERES-ად. ამ მიზნით, ჩვენ გამოვიყენეთ მოდიფიცირებული საფუარის შტამი GhLag1, რომელშიც ორი ენდოგენური ცერამიდის სინთაზა Lag1 და Lac1 შეიცვალა GhLag1-ით (ბამბის Lag1 ჰომოლოგი), რის შედეგადაც მივიღეთ საფუარის შტამი უჯრედის მემბრანის ცერამიდის შტამით, რომელიც უფრო მოკლეა, ვიდრე ველური ტიპი (სურათი 3A) (28). მას-სპექტრომეტრიის (MS) ანალიზმა აჩვენა, რომ ველური ტიპის შტამებში, ცერამიდის მთლიანი რაოდენობის 95% ძალიან გრძელი (C26) ჯაჭვის ცერამიდია, ხოლო GhLag1-ში ცერამიდის 85% ძალიან გრძელი (C18 და C16) ჯაჭვის ცერამიდია, ცერამიდის მხოლოდ 2% არის ძალიან გრძელი (C26) ჯაჭვის ცერამიდი. მიუხედავად იმისა, რომ GhLag1 მემბრანაში აქამდე აღმოჩენილი ძირითადი ცერამიდები C18 და C16 ცერამიდებია, MS ანალიზმა ასევე დაადასტურა, რომ GhLag1 შტამში ექსპრესირებული Gas1-GFP-ის GPI ღუზა შეიცავს C26 ცერამიდს, რომელიც შედარებადია ველური ტიპის ლიპიდებთან. ხარისხი იგივეა (სურ. 3A) (26). შესაბამისად, ეს ნიშნავს, რომ ცერამიდის რემოდელირების ფერმენტი Cwh43 მაღალსელექტიურია C26 ცერამიდის მიმართ, როგორც ეს ნაჩვენებია სურათ 26-ზე, ის უპირატესად აერთიანებს GPI ღუზას მცირე რაოდენობით C26 ცერამიდიდან GhLag1 შტამში. S2 (29). მიუხედავად ამისა, GhLag1-ის უჯრედის მემბრანა ძირითადად შეიცავს მხოლოდ C18-C16 ცერამიდს, ხოლო Gas1-GFP კვლავ შეიცავს C26 ცერამიდს. ეს ფაქტი ამ შტამს იდეალურ ინსტრუმენტად აქცევს ER-ში მემბრანული ცერამიდის აცილის ჯაჭვის სიგრძის პრობლემის კონკრეტულად გადასაჭრელად. კლასისა და დახარისხების ჰიპოთეტური როლი. შემდეგ, ჩვენ თავდაპირველად შევისწავლეთ C26 Gas1-GFP-ის უნარი, დაგროვებულიყო კლასტერებად GhLag1-ში sec31-1 ტემპერატურისადმი მგრძნობიარე მუტანტური ალელით ჩვეულებრივი ფლუორესცენტული მიკროსკოპიის საშუალებით, სადაც მხოლოდ გრძელი (C18-C16) ჯაჭვი არსებობს ER მემბრანაში (კერამიდი) (სურ. 3). ჩვენ დავაკვირდით, რომ sec31-1-ში Gas1-GFP-ის უმეტესი ნაწილი კონცენტრირებული იყო კლასტერებად, ხოლო Gas1-GFP sec31-1 GhLag1-ში გრძელი (C18-C16) გრძელი კერამიდის ER მემბრანით ძირითადად არ იყო კლასტერიზებული და განაწილებული მთელ ER მემბრანაში. უფრო ზუსტად რომ ვთქვათ, რადგან C26 კერამიდზე დაფუძნებული კლასტერიზაცია მჭიდრო კავშირშია სპეციფიკურ ERES-თან (სურათი 1), შემდეგ გამოვიკვლიეთ, შეიძლება თუ არა ამ პროცესში ასევე ჩართული იყოს ER ექსპორტის ცილის მექანიზმის ფუნქცია. GPI-AP იყენებს სპეციალურ COPII სისტემას ER ექსპორტისთვის, რომელიც აქტიურად რეგულირდება GPI წამყვანის გლიკანური ნაწილის Ted1-ის სტრუქტურული რემოდელირებით (30, 31). რეკომბინანტული GPI-გლიკანი შემდეგ ამოიცნობა ტრანსმემბრანული ტვირთ რეცეპტორის p24 კომპლექსის მიერ, რომელიც თავის მხრივ შერჩევით იზიდავს Lst1-ს, რომელიც წარმოადგენს COPII ტვირთის შემაკავშირებელი ძირითადი ქვეერთეულის Sec24 სპეციფიკურ იზოფორმას, რაც ქმნის GPI-AP-ით მდიდარ COPII ვეზიკულებს (31-33). ამიტომ, ჩვენ შევქმენით ორმაგი მუტანტი, რომელიც აერთიანებდა ამ ცალკეული ცილების (p24 კომპლექსის კომპონენტი Emp24, GPI-გლიკანის რემოდელირების ფერმენტი Ted1 და სპეციფიკური COPII ქვეერთეული Lst1) წაშლას sec31-1 მუტანტურ შტამთან და შევისწავლეთ ისინი, შესაძლებელია თუ არა Gas1-კლასტერული GFP-ის წარმოქმნა (სურათი 3). ჩვენ დავაკვირდით, რომ sec31-1emp24Δ-სა და sec31-1ted1Δ-ში, Gas1-GFP ძირითადად არ არის კლასტერიზებული და განაწილებულია ER მემბრანაში, როგორც ეს ადრე იყო ნაჩვენები sec31-1 GhLag1-ში, ხოლო sec31-1lst1Δ-ში, Gas1-GFP მსგავსია sec31-1-ის. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ ER მემბრანაში C26 ცერამიდის არსებობის გარდა, Gas1-GFP-ის კლასტერიზაცია ასევე საჭიროებს p24 კომპლექსთან დაკავშირებას და არ საჭიროებს Lst1-ის სპეციფიკურ რეკრუტირებას. შემდეგ, ჩვენ შევისწავლეთ შესაძლებლობა, რომ ER მემბრანაში ცერამიდის ჯაჭვის სიგრძეს შეუძლია Gas1-GFP-ის p24-თან შეკავშირების რეგულირება. თუმცა, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ მემბრანაში C18-C16 ცერამიდის არსებობა გავლენას არ ახდენს p24 კომპლექსით რეკონსტრუირებულ GPI-გლიკანებზე (სურათები S3 და S4, A და B) ან GPI-AP-თან შეკავშირებისა და GPI-AP-ის ექსპორტის უნარზე. COPII ქვეტიპის Lst1 რეკრუტირების უნარი (სურათი S4C). ამრიგად, C26 ცერამიდ-დამოკიდებული კლასტერიზაცია არ საჭიროებს ცილების ურთიერთქმედებას ER ექსპორტის ცილის სხვადასხვა მექანიზმთან, მაგრამ მხარს უჭერს ლიპიდების სიგრძით განპირობებულ ალტერნატიულ დახარისხების მექანიზმს. შემდეგ, ჩვენ გავაანალიზეთ, მნიშვნელოვანია თუ არა ერ მემბრანაში ცერამიდის აცილის ჯაჭვის სიგრძე Gas1-GFP-ის, როგორც სელექციური ERES-ის ეფექტური კლასიფიკაციისთვის. ვინაიდან GhLag1 შტამში მოკლეჯაჭვიანი კერამიდით შემავალი Gas1 ტოვებს ეროზიულ-რეზონანსულ უჯრედს და შედის პლაზმურ მემბრანაში (სურათი S5), ჩვენ გვჯერა, რომ თუ დახარისხება განპირობებულია კერამიდის აცილის ჯაჭვის სიგრძით, GhLag1 შტამში არსებული Gas1 შეიძლება გადამისამართდეს და გადაკვეთოს. ERES პროდუქტები იგივე მემბრანით.
(A) GhLag1-ის უჯრედის მემბრანა ძირითადად შეიცავს უფრო მოკლე C18-C16 ცერამიდებს, ხოლო Gas1-GFP-ის GPI ღუზას კვლავ იგივე C26 IPC აქვს, როგორც ველური ტიპის უჯრედებს. ზემოთ: ცერამიდის აცილის ჯაჭვის სიგრძის ანალიზი ველური ტიპის (Wt) და GhLag1p შტამების უჯრედის მემბრანაში მას-სპექტრომეტრიით (MS). მონაცემები წარმოადგენს ცერამიდის საერთო შემცველობის პროცენტულ მაჩვენებელს. სამი დამოუკიდებელი ექსპერიმენტის საშუალო. შეცდომის ზოლი = სტანდარტული გადახრა. ორმხრივი შეუწყვილებელი t ტესტი. **** P <0.0001. ქვედა პანელი: Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI ღუზაში არსებული IPC-ის აცილის ჯაჭვის სიგრძის MS ანალიზი, რომელიც გამოხატულია ველური ტიპის და GhLag1p შტამებში. მონაცემები წარმოადგენს IPC სიგნალის საერთო შემცველობის პროცენტულ მაჩვენებელს. ხუთი დამოუკიდებელი ექსპერიმენტის საშუალო. შეცდომის ზოლი = სტანდარტული გადახრა. ორმხრივი შეუწყვილებელი t ტესტი. ns, არ არის მნიშვნელოვანი. P = 0.9134. (B) გალაქტოზით ინდუცირებული Gas1-GFP-ის გამომხატველი sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ და sec31-1lst1Δ უჯრედების ფლუორესცენტული მიკროგრაფიები ინკუბირებული იქნა 37°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში და გადაეცა რუტინული ფლუორესცენტული მიკროსკოპიის ჩასატარებლად 24°C-ის შემდეგ. თეთრი ისარი: ER Gas1-GFP კლასტერი. ღია ისარი: დაუკლასტერებელი Gas1-GFP განაწილებულია მთელ ER მემბრანაზე, რაც აჩვენებს ER-ისთვის დამახასიათებელ ბირთვული რგოლის შეღებვას. მასშტაბის ზოლი, 5μm. (C) (B)-ში აღწერილი ფოტომიკროგრაფიის რაოდენობრივი განსაზღვრა. წერტილოვანი Gas1-GFP სტრუქტურის მქონე უჯრედების საშუალო პროცენტული მაჩვენებელი. სამ დამოუკიდებელ ექსპერიმენტში, n≥300 უჯრედი. შეცდომის ზოლი = სტანდარტული გადახრა. ორმხრივი დაუწყვილებელი t ტესტი. **** P <0.0001.
ამ პრობლემის უშუალოდ გადასაჭრელად, ჩვენ ჩავატარეთ Gas1-GFP-ის და Mid2-iRFP-ის SCLIM ვიზუალიზაცია GhLag1-ში sec31-1 ტემპერატურისადმი მგრძნობიარე მუტანტური ალელით (სურათი 4 და ვიდეო S4). მას შემდეგ, რაც ER შეინარჩუნა 37°C-ზე და შემდგომში გამოთავისუფლდა 24°C-ზე, ახლად სინთეზირებული Gas1-GFP-ის უმეტესი ნაწილი არ იყო დაჯგუფებული და განაწილებული ER მემბრანაში, როგორც ეს ჩვეულებრივი მიკროსკოპებით დაფიქსირდა (სურათი 4, A და B). გარდა ამისა, ERES-ის დიდი პროცენტი (67%) მოიცავს მასში განლაგებულ ორი ტიპის ტვირთს (სურათი 4D). სურათი 4C-ის პანელები 1 და 2 აჩვენებს ERES-ის ორ ტიპურ მაგალითს Gas1-GFP-ის და Mid2-GFP-ის გადაფარვით. გარდა ამისა, ორივე საქონელი ერთსა და იმავე ERES-ში იქნა შეყვანილი (სურათი 4E, პანელი 3 და ვიდეო S4). ამიტომ, ჩვენი შედეგები მიუთითებს, რომ ER მემბრანაში ცერამიდის აცილის ჯაჭვის სიგრძე ER ცილის აგრეგაციისა და კლასიფიკაციის მნიშვნელოვანი განმსაზღვრელი ფაქტორია.
Sec31-1 GhLag1 უჯრედები, რომლებიც გამოხატავენ გალაქტოზით ინდუცირებულ სეკრეციას, Gas1-GFP (GPI-AP, მწვანე) და Mid2-iRFP (TMP, ლურჯი) და კონსტიტუციურ ERES-ით მონიშნულ Sec13-mCherry-ს (ERES, მეწამული). ინკუბაცია 37°C-ზე. გააგრძელეთ 30 წუთის განმავლობაში, სეკრეტის გამოსაყოფად ტემპერატურა დაწიეთ 24°C-მდე და 20 წუთის შემდეგ გადაიღეთ გამოსახულება SCLIM-ით. (A-დან C-მდე) ტვირთით და ERES-ით მონიშნული 10 z-სექციების წარმომადგენლობითი 2D პროექციის სურათები (A; მასშტაბის ზოლი, 1μm) ან 3D უჯრედული ნახევარსფეროს სურათები (B და C; მასშტაბის ერთეული, 0.45μm). (B)-ში ქვედა პანელი და (C)-ში პანელი აჩვენებს დამუშავებულ სურათებს მხოლოდ ERES-ში (მეწამული) არსებული პროდუქტების საჩვენებლად [Gas1-GFP (ნაცრისფერი) და Mid2-iRFP (ღია ლურჯი)]. (C) თეთრით შევსებული ისარი: ERES, პროდუქტები ერთმანეთს ემთხვევა. ღია ისარი: ERES შეიცავს მხოლოდ ერთ ელემენტს. ქვედა პანელი: არჩეულ ERES-ზე (C) მონიშნულია გადაფარვითი საქონელი (1 და 2). მასშტაბის ზოლი, 100 ნმ. (D) (C)-ში აღწერილი ფოტომიკროგრაფიის რაოდენობრივი განსაზღვრა. sec31-1 და sec31-1 GhLag1 ერთეულებში შედის მხოლოდ ერთი ტვირთი (Gas1-GFP ან Mid2-iRFP) და ERES-ის საშუალო პროცენტული მაჩვენებელი იზოლირებული და გადაფარვითი ტვირთისთვის. სამ დამოუკიდებელ ექსპერიმენტში, n = 432 54 უჯრედში (sec31-1) და n = 430 47 უჯრედში (sec31-1 GhLag1). შეცდომის ზოლი = SD. ორმხრივი დაუწყვილებელი t ტესტი. *** P = 0.0002 (sec31-1) და ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) (C)-ში მონიშნული გადაფარვითი ტვირთით (3) შერჩეული ERES-ის 3D გამოსახულება. Gas1-GFP (მწვანე) და Mid2-iRFP (ლურჯი) ERES-ს (მეწამული) ერთი და იგივე მხრიდან უახლოვდებიან და იმავე ERES შეზღუდულ არეალში რჩებიან. მასშტაბის ზოლი, 100 ნმ.
ეს კვლევა იძლევა პირდაპირ in vivo მტკიცებულებას, რომ ლიპიდებზე დაფუძნებული ცილოვანი ტვირთები კლასიფიცირდება სეკრეტორულ გზაზე სელექციურ ექსპორტის ადგილებში და ავლენს აცილის ჯაჭვის სიგრძის მნიშვნელობას კლასიფიკაციის სელექციურობისთვის. SCLIM-ის სახელით ცნობილი ძლიერი და უახლესი მიკროსკოპიული ტექნიკის გამოყენებით, ჩვენ ვაჩვენეთ ახლად სინთეზირებული Gas1-GFP (პლაზმური მემბრანის მთავარი GPI-AP ძალიან გრძელი აცილის ჯაჭვის (C26) კერამიდის ლიპიდური ნაწილით) საფუარაში. დისკრეტულ ER-ებში დაჯგუფებული რეგიონები ასოცირდება სპეციფიკურ ERES-თან, ხოლო ტრანსმემბრანული სეკრეციული ცილები განაწილებულია ER მემბრანაში (სურათი 1). გარდა ამისა, ეს ორი ტიპის საქონელი სელექციურად შედის სხვადასხვა ERES-ში (სურათი 2). მემბრანაში უჯრედული კერამიდის აცილის ჯაჭვის სიგრძე მცირდება C26-დან C18-C16-მდე, Gas1-GFP კლასტერი იშლება დისკრეტულ ER რეგიონში და Gas1-GFP გადამისამართებულია ER-დან ტრანსმემბრანულ ცილასთან ერთად იმავე ERES-ის მეშვეობით (სურათი 3 და სურათი 3). 4).
მიუხედავად იმისა, რომ GPI-AP იყენებს სპეციალიზებულ ცილოვან მექანიზმს ERES-დან გამოსასვლელად, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ C26 ცერამიდ-დამოკიდებული გამოყოფა არ ეყრდნობა დიფერენციალურ ცილოვან ურთიერთქმედებებს, რამაც შეიძლება გამოიწვიოს ERES სპეციალიზაცია (სურათები S4 და S5). ამის ნაცვლად, ჩვენი დასკვნები ადასტურებს ალტერნატიულ კლასიფიკაციის მექანიზმს, რომელიც განპირობებულია ლიპიდებზე დაფუძნებული ცილების კლასტერიზაციით და შემდგომი სხვა ტვირთების გამორიცხვით. ჩვენი დაკვირვებები მიუთითებს, რომ კონკრეტულ ERES-თან ასოცირებულ Gas1-GFP რეგიონს ან კლასტერს არ აქვს ტრანსმემბრანული სეკრეტირებული ცილა Mid2-iRFP, რაც მიუთითებს, რომ C26 ცერამიდ-დამოკიდებული GPI-AP კლასტერი ხელს შეუწყობს მათ შესვლას შესაბამის ERES-ში და ამავე დროს, გამორიცხავს ტრანსმემბრანულ სეკრეტებს ამ კონკრეტულ ERES-ში (სურათები 1 და 2). ამის საპირისპიროდ, C18-C16 ცერამიდების არსებობა ER მემბრანაში არ იწვევს GPI-AP-ის რეგიონების ან კლასტერების წარმოქმნას, ამიტომ ისინი არ გამორიცხავენ ან არ ცვლიან ტრანსმემბრანული სეკრეტირებული ცილებს იმავე ERES-ში (სურათები 3 და 4). ამიტომ, ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ C26 კერამიდი განაპირობებს გამოყოფას და კლასიფიკაციას სპეციფიკურ ERES-თან დაკავშირებული ცილების კლასტერიზაციის ხელშეწყობით.
როგორ მივაღწიოთ C26 ცერამიდ-დამოკიდებულ კლასტერიზაციას სპეციფიკურ ER არეალში? მემბრანული ცერამიდის გვერდითი გამოყოფის ტენდენციამ შეიძლება გამოიწვიოს GPI-AP-ის და C26 ცერამიდის მიერ მცირე და მყისიერად მოწესრიგებული ლიპიდების წარმოქმნა ER მემბრანის უფრო არარეგულარულ ლიპიდურ გარემოში, რომელიც შეიცავს უფრო მოკლე და უჯერ გლიცეროლიპიდებს. ხარისხიანი კლასტერები (17, 18). ეს მცირე დროებითი კლასტერები შეიძლება შემდგომში შერწყმული იყოს უფრო დიდ, უფრო სტაბილურ კლასტერებად p24 კომპლექსთან შეკავშირების შემდეგ (34). ამასთან შესაბამისობაში, ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ C26 Gas1-GFP-ს სჭირდება ურთიერთქმედება p24 კომპლექსთან უფრო დიდი ხილული კლასტერების შესაქმნელად (სურათი 3). p24 კომპლექსი არის ჰეტეროზიგოტური ოლიგომერი, რომელიც შედგება საფუარის ოთხი განსხვავებული p24 ტრანსმემბრანული ცილისგან (35), რომელიც უზრუნველყოფს მრავალვალენტიან შეკავშირებას, რამაც შეიძლება გამოიწვიოს მცირე GPI-AP კლასტერების ჯვარედინი შეერთება, რითაც წარმოიქმნება უფრო დიდი სტაბილური კლასტერი (34). GPI-AP-ების ცილოვან ექტოდომენებს შორის ურთიერთქმედებამ შესაძლოა ასევე შეუწყოს ხელი მათ აგრეგაციას, როგორც ეს ნაჩვენებია გოლჯის აპარატის ტრანსპორტირების დროს ძუძუმწოვრების პოლარიზებულ ეპითელურ უჯრედებში (36). თუმცა, როდესაც C18-C16 ცერამიდი წარმოდგენილია ER მემბრანაში, როდესაც p24 კომპლექსი უკავშირდება Gas1-GFP-ს, დიდი ცალკეული კლასტერები არ წარმოიქმნება. ძირითადი მექანიზმი შეიძლება დამოკიდებული იყოს გრძელი აცილის ჯაჭვის ცერამიდის სპეციფიკურ ფიზიკურ და ქიმიურ თვისებებზე. ხელოვნური მემბრანების ბიოფიზიკური კვლევები აჩვენებს, რომ მიუხედავად იმისა, რომ როგორც გრძელი (C24), ასევე მოკლე (C18-C16) აცილის ჯაჭვის ცერამიდებს შეუძლიათ ფაზების გამოყოფა, მხოლოდ გრძელი აცილის ჯაჭვის ცერამიდებს (C24) შეუძლიათ ხელი შეუწყონ მაღალ გამრუდებას და აპკის მოხრას აპკის ფორმის შესაცვლელად. ურთიერთმიმართების გზით (17, 37, 38). ნაჩვენებია, რომ TMED2-ის ტრანსმემბრანული სპირალი, Emp24-ის ადამიანის ჰომოლოგი, შერჩევით ურთიერთქმედებს C18 ცერამიდზე დაფუძნებულ სფინგომიელინთან ციტოპლაზმურ ლობულებში (39). მოლეკულური დინამიკის (MD) სიმულაციების გამოყენებით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ როგორც C18, ასევე C26 ცერამიდები გროვდება Emp24 ტრანსმემბრანული სპირალის ციტოპლაზმურ ლობულებში და მათ მსგავსი პრეფერენციები აქვთ (სურათი S6). აღსანიშნავია, რომ ეს მიუთითებს, რომ Emp24-ის ტრანსმემბრანულმა სპირალმა შეიძლება გამოიწვიოს ლიპიდების ასიმეტრიული განაწილება მემბრანაში. ეს არის ბოლოდროინდელი შედეგი, რომელიც დაფუძნებულია ძუძუმწოვრების უჯრედებზე. მსგავსი MD სიმულაციები ასევე აჩვენებს ეთერული ლიპიდების არსებობას (40). ამიტომ, ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ ER26-ის ორ ლობულაში C26 ცერამიდი ლოკალურად გამდიდრებულია. როდესაც GPI-AP ლუმინალურ ლობულებში პირდაპირ უკავშირდება მულტივალენტურ p24-ს და C26 ცერამიდის დაგროვება p24-ის გარშემო ციტოპლაზმურ ლობულებში, მას შეუძლია ხელი შეუწყოს თანმხლებ ცილის აგრეგაციას და მემბრანის გამრუდებას, რომელიც წარმოიქმნება თითების მეშვეობით (41), რაც იწვევს GPI-AP-ის გამოყოფას ERES-ის მიმდებარე დისკრეტულ რეგიონებად, რაც ასევე ხელს უწყობს ER მემბრანის ძლიერ გამრუდებულ რეგიონებს (42). წინა ანგარიშები ადასტურებდა შემოთავაზებულ მექანიზმს (43, 44). ოლიგოლექტინების, პათოგენების ან ანტისხეულების მრავალვალენტიანი შეკავშირება ცერამიდზე დაფუძნებულ გლიკოსფინგოლიპიდებთან (GSL) პლაზმურ მემბრანაზე იწვევს GSL-ის დიდ აგრეგაციას, აძლიერებს ფაზების გამოყოფას და იწვევს მემბრანის დეფორმაციას და ინტერნალიზაციას (44). ივაბუჩი და ა.შ. (43) აღმოჩნდა, რომ გრძელი (C24), მაგრამ არა მოკლე (C16) აცილის ჯაჭვების არსებობისას, GSL ლაქტოზილცერამიდთან დაკავშირებული მრავალვალენტიანი ლიგანდი იწვევდა დიდი კლასტერების და მემბრანის ინვაგინაციის წარმოქმნას, ხოლო ციტოპლაზმაში Lyn-ის შუამავლობით მიმდინარე სიგნალის ტრანსდუქცია ფოთლებზე გადაჯაჭვულია აცილის ჯაჭვებით შეწყვილებულ ნეიტროფილებში.
ძუძუმწოვრების პოლარიზებულ ეპითელურ უჯრედებში, ანტი-გოლჯის ქსელის (TGN) კონცენტრაცია აპიკალური პლაზმური მემბრანის დონემდე აკონტროლებს GPI-AP-ის გამოყოფას და დახარისხებას (10, 45). ეს აგრეგაცია განპირობებულია GPI-AP ოლიგომერიზაციით (36), მაგრამ ის ასევე შეიძლება დამოკიდებული იყოს საფუარში არსებულ ცერამიდის ჯაჭვის სიგრძეზე. მიუხედავად იმისა, რომ ძუძუმწოვრების GPI-AP-ს აქვს ეთერ-ლიპიდზე დაფუძნებული წამყვანი და მისი ქიმიური სტრუქტურა ძალიან განსხვავდება ძალიან გრძელი აცილის ჯაჭვის ცერამიდისგან, ბოლოდროინდელმა კვლევამ აჩვენა, რომ ორივე ლიპიდს აქვს ევოლუციურად მსგავსი ფიზიკური და ქიმიური თვისებები და ფუნქცია (40). ამრიგად, ძუძუმწოვრების უჯრედებში ეთერ-ლიპიდური ნაწილი შეიძლება მსგავსი იყოს საფუარის C26 ცერამიდისა და მისი როლია მემბრანაში გრძელჯაჭვიან ცერამიდთან დაკავშირება GPI-AP აგრეგაციისა და დახარისხების ხელშესაწყობად. მიუხედავად იმისა, რომ ეს შესაძლებლობა ჯერ კიდევ პირდაპირ უნდა შემოწმდეს, წინა დასკვნები ადასტურებს, რომ გრძელი აცილის ჯაჭვის ცერამიდის გოლჯის სხეულაკში ტრანსპორტირება არ ხორციელდება ციტოპლაზმური გადამცემი ცილებით, არამედ დამოკიდებულია GPI წამყვანების სინთეზზე, როგორიცაა საფუარი. ამგვარად, როგორც ჩანს, ევოლუციური კონსერვატიული მექანიზმი ერთსა და იმავე სატრანსპორტო ბუშტუკში შერჩევით ერთობლივად გადაიტანს ძალიან აცილის ჯაჭვის ცერამიდს და GPI-AP-ს (13, 16, 20, 46, 47).
საფუარის და ძუძუმწოვრების პოლარიზებული ეპითელური უჯრედების სისტემებში, GPI-AP-ის აგრეგაცია და სხვა პლაზმური მემბრანის ცილებისგან გამოყოფა ხდება უჯრედის ზედაპირამდე მიღწევამდე. პალადინომ და სხვებმა (48) აღმოაჩინეს, რომ ძუძუმწოვრების პოლარიზებული ეპითელური უჯრედების TGN-ზე, GPI-AP-ის კლასტერიზაცია აუცილებელია არა მხოლოდ GPI-AP-ების აპიკალურ პლაზმურ მემბრანაზე შერჩევითი კლასიფიკაციისთვის, არამედ არეგულირებს GPI-AP-ების კლასტერიზაციის ორგანიზაციას და მის ბიოლოგიურ აქტივობას. უჯრედის ზედაპირი. საფუარში, ამ კვლევამ აჩვენა, რომ C26 ცერამიდ-დამოკიდებულ GPI-AP კლასტერს ER-ზე შეუძლია დაარეგულიროს GPI-AP-ის კლასტერული ორგანიზაცია და ფუნქციური აქტივობა პლაზმურ მემბრანაზე (24, 49). ამ მოდელთან შესაბამისობაში, GhLag1 უჯრედები ალერგიული არიან GPI ინჰიბიტორების ან უჯრედის კედლის მთლიანობაზე მოქმედი პრეპარატების მიმართ (28), და საფუარის უჯრედების შეჯვარებისას პროეცირებული წვერის კერამიდის ფუნქციური Gas1-GFP კლასტერების (49) საჭიროება მიუთითებს G-ზე. hLag1 უჯრედების შესაძლო ფიზიოლოგიური შედეგები. GPI-AP შეცდომა. თუმცა, ჩვენი მომავალი კვლევის საგანი იქნება იმის შემდგომი შემოწმება, დაპროგრამდა თუ არა უჯრედის ზედაპირის ფუნქციური ორგანიზაცია ER-დან ლიპიდების სიგრძეზე დაფუძნებული დახარისხების მეთოდით.
ამ ნაშრომში გამოყენებული Saccharomyces cerevisiae შტამები ჩამოთვლილია ცხრილში S1. ცოცხალი უჯრედების ვიზუალიზაციისთვის SCLIM-ის MMY1583 და MMY1635 შტამები აგებული იქნა W303-ის ფონზე. Sec13-mCherry-ის ფლუორესცენტული ცილის ტეგით გამომხატველი ეს შტამები აგებული იქნა პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (PCR) მეთოდის გამოყენებით, pFA6a პლაზმიდით, როგორც შაბლონით (23). GAL1 პრომოტერის კონტროლის ქვეშ ფლუორესცენტული ცილით მონიშნული Mid2-iRFP-ის გამომხატველი შტამი აგებული იქნა შემდეგნაირად. iRFP-KanMx თანმიმდევრობის PCR ამპლიფიკაცია pKTiRFP-KAN ვექტორიდან (E. O'Shea-ს საჩუქარი, Addgene პლაზმიდის ნომერი 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; კვლევითი რესურსის იდენტიფიკატორი (RRID): Addgene_64687) და ჩასმული ენდოგენური Mid2-ის C-ტერმინუსში. მას შემდეგ, რაც Mid2-iRFP გენომის თანმიმდევრობა გამრავლდა და კლონირებული იქნა GAL1 პრომოტერში, იგი ინტეგრირებული იქნა ინტეგრაციული პლაზმიდის pRS306 Not I-Sac I უბანში. შედეგად მიღებული პლაზმიდი pRGS7 ლინეარიზებული იქნა Pst I-ით URA3 ლოკუსში ინტეგრაციისთვის.
Gas1-GFP შერწყმის გენი ექსპრესირდება GAL1 პრომოტერის კონტროლის ქვეშ ცენტრომერულ (CEN) პლაზმიდში, რომელიც აგებულია შემდეგნაირად. Gas1-GFP თანმიმდევრობა ამპლიფიცირებული იქნა PCR-ით pRS416-GAS1-GFP პლაზმიდიდან (24) (L. Popolo-ს საჩუქარი) და კლონირებული იქნა CEN პლაზმიდის pBEVY-GL LEU2-ის Xma I–Xho I უბანში (C-ს საჩუქარი). მილერი; Addgene პლაზმიდის ნომერი 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). მიღებულ პლაზმიდს დაერქვა pRGS6. Axl2-GFP შერწყმის გენი ასევე ექსპრესირდება pBEVY-GL LEU2 ვექტორის GAL1 პრომოტერის კონტროლის ქვეშ და მისი კონსტრუქცია შემდეგია. Axl2-GFP თანმიმდევრობა ამპლიფიცირებული იქნა pRS304-p2HSE-Axl2-GFP პლაზმიდიდან (23) PCR-ის მეშვეობით და კლონირებული იქნა pBEVY-GL LEU2 ვექტორის Bam HI-Pst I უბანში. მიღებულ პლაზმიდას ეწოდა pRGS12. ამ კვლევაში გამოყენებული ოლიგონუკლეოტიდების თანმიმდევრობა ჩამოთვლილია ცხრილ S2-ში.
შტამს ნახშირბადის წყაროდ დაემატა 0.2% ადენინი და 2% გლუკოზა [YP-დექსტროზა (YPD)], 2% რაფინოზით [YP-რაფინოზი] მდიდარი საფუარის ექსტრაქტით, ცილოვანი p (YP) გარემო (1% საფუარის ექსტრაქტი და 2% ცილოვანი ept). (YPR)] ან 2% გალაქტოზა [YP-გალაქტოზა (YPG)], ან სინთეზურ მინიმალურ გარემოში (0.15% საფუარის აზოტოვანი ფუძე და 0.5% ამონიუმის სულფატი) კვებისთვის საჭირო შესაბამისი ამინომჟავებისა და ფუძეების შესავსებად და ნახშირბადის წყაროდ შეიცავდა 2% გლუკოზას (სინთეზური გლუკოზის მინიმალური გარემო) ან 2% გალაქტოზას (სინთეზური გალაქტოზის მინიმალური გარემო).
რეალურ დროში ვიზუალიზაციისთვის, ტემპერატურაზე მგრძნობიარე sec31-1 მუტანტური უჯრედები, რომლებიც გამოხატავდნენ კონსტრუქტს GAL1 პრომოტერის ქვეშ, გაიზარდა YPR გარემოში 24°C ტემპერატურაზე მთელი ღამის განმავლობაში შუა ლოგარითმული ფაზის მიღწევამდე. YPG-ში 24°C ტემპერატურაზე 1 საათის განმავლობაში ინდუქციის შემდეგ, უჯრედები ინკუბირებული იქნა SG-ში 37°C ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში, შემდეგ კი გადატანილი იქნა 24°C-ზე სეკრეციის ბლოკიდან გამოსათავისუფლებლად. კონკანავალინი A გამოყენებული იქნა უჯრედების მინის სლაიდზე დასაფიქსირებლად და ვიზუალიზაცია მოხდა SCLIM-ით. SCLIM წარმოადგენს Olympus IX-71 ინვერსიული ფლუორესცენტული მიკროსკოპისა და UPlanSApo 100×1.4 რიცხვითი აპერტურის ზეთის ლინზის (Olympus), მაღალსიჩქარიანი და მაღალი სიგნალ-ხმაურის თანაფარდობის მქონე მბრუნავი დისკის კონფოკალური სკანერის (Yokogawa Electric), საკუთარი სპექტრომეტრისა და საკუთარი გაგრილების კომბინაციას. სისტემის გამოსახულების გამაძლიერებელს (Hamamatsu Photonics) შეუძლია უზრუნველყოს გამადიდებელი ლინზების სისტემა ×266.7 საბოლოო გადიდებით და მუხტთან შეერთებული მოწყობილობის კამერით, რომელიც ამრავლებს ელექტრონებს (Hamamatsu Photonics) (21). გამოსახულების მიღება ხორციელდება საკუთარი პროგრამული უზრუნველყოფით (Yokogawa Electric). 3D გამოსახულებებისთვის, ჩვენ გამოვიყენეთ საკუთარი ხელით დამზადებული პიეზოელექტრული აქტივატორი ობიექტივის ვერტიკალურად ვიბრაციისთვის და შევაგროვეთ ოპტიკური ნაწილები ერთმანეთისგან 100 ნმ-ით დაშორებით ერთმანეთზე. Z-დასტის გამოსახულება გარდაიქმნება 3D ვოქსელის მონაცემებად, ხოლო მბრუნავი დისკის კონფოკალური მიკროსკოპისთვის გამოყენებული თეორიული წერტილოვანი გავრცელების ფუნქცია გამოიყენება დეკონვოლუციის დამუშავებისთვის Volocity პროგრამული უზრუნველყოფის (PerkinElmer) მიერ. კოლოკაციის ანალიზისთვის ზღურბლის ავტომატურად განსაზღვრის მიზნით, Volocity პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით, გაიზომა ERES, მათ შორის ტვირთი. ხაზის სკანირების ანალიზი ჩატარდა MetaMorph პროგრამული უზრუნველყოფის (Molecular Devices) გამოყენებით.
სტატისტიკური მნიშვნელობის დასადგენად გამოიყენეთ GraphPad Prism პროგრამული უზრუნველყოფა. ორმხრივი სტუდენტის t-ტესტისა და ვარიაციის ჩვეულებრივი ცალმხრივი ანალიზის (ANOVA) ტესტისთვის, ჯგუფებს შორის განსხვავებებს მნიშვნელოვანი გავლენა აქვს P <0.05 (*)-ზე.
Gas1-GFP-ის ფლუორესცენტული მიკროსკოპიისთვის, ლოგ-ფაზის უჯრედები გაიზარდა YPD-ში ღამით და შეგროვდა ცენტრიფუგირებით, ორჯერ გაირეცხა ფოსფატური ბუფერული ფიზიოლოგიური ხსნარით და ინკუბირებული იქნა ყინულზე მინიმუმ 15 წუთის განმავლობაში, შემდეგ კი მიკროსკოპის ქვეშ დამუშავება განხორციელდა ადრე აღწერილი Check (24)-ის მიხედვით. შეგროვებისთვის გამოყენებული იქნა Leica DMi8 მიკროსკოპი (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS), რომელიც აღჭურვილია ობიექტივით, L5 (GFP) ფილტრით, Hamamatsu კამერით და Application Suite X (LAS X) პროგრამული უზრუნველყოფით.
ნიმუშები დენატურირებული იქნა SDS ნიმუშის ბუფერით 65°C ტემპერატურაზე 10 წუთის განმავლობაში, შემდეგ კი გამოყოფილი იქნა SDS-პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზით (PAGE). იმუნობლოტინგის ანალიზისთვის, თითოეულ ზოლში ჩაიტვირთა 10 μl ნიმუში. პირველადი ანტისხეული: გამოიყენეთ კურდღლის პოლიკლონური ანტი-Gas1 1:3000 განზავებით, კურდღლის პოლიკლონური ანტი-Emp24 1:500 განზავებით და კურდღლის პოლიკლონური ანტი-GFP (საჩუქარი H. Riezman-ისგან) 1:3000 განზავებით. თაგვის მონოკლონური ანტი-Pgk1 ანტისხეული გამოყენებული იქნა 1:5000 განზავებით (საჩუქარი J. de la Cruz-ისგან). მეორადი ანტისხეული: ხრენის პეროქსიდაზასთან (HRP) კონიუგირებული თხის ანტი-კურდღლის იმუნოგლობულინ G (IgG) გამოყენებული იქნა 1:3000 განზავებით (Pierce). HRP-კონიუგირებული თხის ანტი-თაგვის IgG გამოყენებული იქნა 1:3000 განზავებით (Pierce). იმუნური პასუხის ზონა დაფიქსირდა SuperSignal West Pico რეაგენტის (Thermo Fisher Scientific) ქემილუმინესცენციის მეთოდით.
როგორც აღწერილია (31)-ში, გამდიდრებულ ER ფრაქციაზე ჩატარდა ბუნებრივი იმუნოპრეციპიტაციის ექსპერიმენტი. მოკლედ, საფუარის უჯრედები ორჯერ გარეცხეთ TNE ბუფერით [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ფენილმეთილსულფონილ ფტორიდის და პროტეაზას ინჰიბიტორის ნარევი) 600 ნმ-ზე (OD600) 100 ოპტიკური სიმკვრივით. ის დაიმსხვრა მინის მძივებით, შემდეგ კი უჯრედის ნარჩენები და მინის მძივები ამოიღეს ცენტრიფუგირებით. შემდეგ სუპერნატანტი დაცენტრიფუგირებული იქნა 17,000 გ-ზე 15 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე. ნალექი ხელახლა სუსპენზირებული იქნა TNE-ში და დაემატა დიგიტალისის საპონინი 1%-იანი საბოლოო კონცენტრაციით. სუსპენზია ინკუბირებული იქნა 1 საათის განმავლობაში ბრუნვით 4°C ტემპერატურაზე, შემდეგ კი უხსნადი კომპონენტები ამოიღეს ცენტრიფუგირებით 13,000 გ-ზე 4°C ტემპერატურაზე 60 წუთის განმავლობაში. Gas1-GFP იმუნოპრეციპიტაციისთვის, ჯერ ნიმუში წინასწარ ინკუბირებული უნდა იყოს ცარიელი აგაროზის მძივებით (ChromoTek) 4°C ტემპერატურაზე 1 საათის განმავლობაში, შემდეგ კი ინკუბირებული უნდა იყოს GFP-Trap_A-თი (ChromoTek) 4°C ტემპერატურაზე 3 საათის განმავლობაში. იმუნოპრეციპიტირებული მძივები ხუთჯერ გაირეცხა 0.2%-იანი დიგოქსიგენინის შემცველი TNE-ით, გამოილუცებოდა SDS ნიმუშის ბუფერით, გამოიყოფოდა SDS-PAGE-ზე და გაანალიზებული იყო იმუნობლოტინგის მეთოდით.
როგორც აღწერილია (31)-ში, ჯვარედინი შეკავშირების განსაზღვრა ჩატარდა გამდიდრებულ ER ფრაქციაზე. მოკლედ, გამდიდრებული ER ფრაქცია ინკუბირებული იქნა 0.5 mM დითიობის(სუქცინიმიდილ პროპიონატთან) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 წთ). ჯვარედინი შეკავშირების რეაქცია ჩაქრა გლიცინის დამატებით (50 mM საბოლოო კონცენტრაცია, 5 წუთი, 20°C).
როგორც ადრე იყო აღწერილი (50), ჩატარდა ცერამიდის MS ანალიზი ველური ტიპის და GhLag1 შტამებში. მოკლედ, უჯრედები გაიზარდა ექსპონენციალურ ფაზამდე (3-დან 4 OD600 ერთეულამდე/მლ) YPD-ში 30°C ტემპერატურაზე და შეგროვდა 25×107 უჯრედი. მათი მეტაბოლიზმი ტრიქლორძმარმჟავით ჩერდება. ექსტრაქციის გამხსნელის [ეთანოლი, წყალი, ეთერი, პირიდინი და 4.2 N ამონიუმის ჰიდროქსიდი (15:15:5:1:0.018 v/v)] და 1.2 ნმოლ შიდა სტანდარტის C17 ცერამიდის (860517, Avanti პოლარული ლიპიდი) ხარისხის გამოყენებით, ექსტრაქტის მსუბუქი ტუტე ჰიდროლიზის შესასრულებლად გამოიყენეთ მონომეთილამინის რეაგენტი [მეთანოლი, წყალი, n-ბუტანოლი და მეთილამინის ხსნარი (4:3:1:5 v/v)], შემდეგ კი დემარილიზაციისთვის გამოიყენეთ წყლით გაჯერებული n-ბუტანოლი. და ბოლოს, ექსტრაქტი ხელახლა შესუფრქვეს დადებით რეჟიმში გამხსნელში [ქლოროფორმი/მეთანოლი/წყალი (2:7:1) + 5 mM ამონიუმის აცეტატი] და შეიყვანეს მას-სპექტრომეტრში. სფინგოლიპიდების მოლეკულების იდენტიფიცირებისა და რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის ჩატარდა მრავალრეაქციის მონიტორინგი (MRM). TSQ Vantage-ის მესამეული კვადრუპოლური მას-სპექტრომეტრი (Thermo Fisher Scientific) აღჭურვილია რობოტული ნანონაკადის იონური წყაროთი Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ლიპიდური ანალიზისთვის. შეჯახების ენერგია ოპტიმიზირებულია თითოეული ცერამიდის კატეგორიისთვის. MS მონაცემები მიღებული იქნა დადებით რეჟიმში. თითოეული ბიოლოგიური რეპლიკაციისთვის, ლიპიდური სიგნალი წარმოადგენს სამი დამოუკიდებელი გაზომვის მედიანას.
როგორც აღწერილია (31)-ში, Gas1-GFP-ის გამომხატველი უჯრედები (800×107) დაექვემდებარა ბუნებრივ იმუნოპრეციპიტაციას. გასუფთავებული Gas1-GFP გამოიყო SDS-PAGE-ით და გადაიტანეს პოლივინილიდენფტორიდის (PVDF) მემბრანაზე. ცილა ვიზუალიზებული იქნა PVDF-ის ამიდის შავით შეღებვით. Gas1-GFP ზოლი PVDF-დან მოიჭრა და 5-ჯერ გაირეცხა მეთანოლით და ერთხელ თხევადი ქრომატოგრაფიის-MS (LC-MS) ხარისხის წყლით. მემბრანული ზოლის 500 μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), ბუფერით და 500 μl ახლად გახსნილი 1 M ნატრიუმის ნიტრიტის ნარევით 37°C ტემპერატურაზე 3 საათის განმავლობაში ინკუბაციით, ლიპიდური ფრაქცია გამოიყოფა Gas1-GFP-დან და ლიზირდება. ინოზინ ფოსფატ ცერამიდის გამოყოფა გლუკოზამინსა და ინოზიტოლს შორის (51). ამის შემდეგ, მემბრანული ზოლი ოთხჯერ გაირეცხა LC-MS კლასის წყლით, გაშრა ოთახის ტემპერატურაზე და შეინახეს აზოტის ატმოსფეროში -80°C-ზე ანალიზამდე. კონტროლის სახით, თითოეული ექსპერიმენტისთვის გამოყენებული იქნა PVDF მემბრანის ცარიელი ნიმუში. Gas1-GFP-დან ამოღებული ლიპიდი შემდეგ გაანალიზდა MS მეთოდით, როგორც აღწერილია (50). მოკლედ, GPI-ლიპიდის შემცველი PVDF ზოლები ხელახლა სუსპენზირებული იქნა 75 μl უარყოფით ობის გამხსნელში [ქლოროფორმი/მეთანოლი (1:2) + 5 mM ამონიუმის აცეტატი] და გაიარა სფინგოლიპიდური სახეობების ელექტროსპრეის იონიზაციის (ESI)-MRM/MS ანალიზი (TSQ Vantage). ამ შემთხვევაში, MS მონაცემები მიღებული იქნა უარყოფითი იონების რეჟიმში.
როგორც ადრე აღვნიშნეთ, GPI ღუზას ლიპიდური ნაწილი გამოეყო [3H]-ინოზიტოლით მონიშნულ GPI-AP-ს (16). ლიპიდები გამოეყო თხელფენოვანი ქრომატოგრაფიით გამხსნელის სისტემის გამოყენებით (55:45:10 ქლოროფორმი-მეთანოლი-0.25% KCl) და ვიზუალიზაცია მოახდინა FLA-7000-ის (Fujifilm) გამოყენებით.
Gas1-GFP-ის (600×107) გამომხატველი უჯრედები ორჯერ გაირეცხა TNE ბუფერით TNE ბუფერით და დაიმსხვრა შუშის მძივებით, შემდეგ კი ცენტრიფუგირდა უჯრედის ნარჩენებისა და შუშის მძივების მოსაშორებლად. შემდეგ სუპერნატანტი დაცენტრიფუგდა 17,000 გ-ზე 1 საათის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე. ნალექი გაირეცხა TNE-ში და ინკუბირებული იქნა 1 ერთ PI-PLC-თან (Invitrogen) TNE-ში, რომელიც შეიცავდა 0.2% დიგიტალისის საპონინს 1 საათის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე. ფერმენტული დამუშავების შემდეგ, მემბრანა ამოიღეს ცენტრიფუგირებით 17,000 გ-ზე 4°C ტემპერატურაზე 1 საათის განმავლობაში. Gas1-GFP-ის იმუნოპრეციპიტაციისთვის, სუპერნატანტი ინკუბირებული იქნა GFP-Trap_A-სთან (ChromoTek) 4°C ტემპერატურაზე მთელი ღამის განმავლობაში. SDS-PAGE-ით გამოყოფილი გასუფთავებული Gas1-GFP შეღებილი იქნა Coomassie-ს ბრწყინვალე ლურჯით. Gas1-GFP შეღებვის ზოლი მოკვეთილი იქნა აკვედუკის გარშემო არსებული ნაცრისფერიდან, შემდეგ კი იოდოაცეტამიდით ალკილირებისა და დითიოთრეიტოლით აღდგენის შემდეგ, ჩატარდა გელ-შიდა დაშლა ტრიფსინით. ექსტრაქცია და ტრიპსული პეპტიდების და პეპტიდების გაშრობა GPI-გლიკანებით. გამხმარი პეპტიდი გახსნილი იქნა 20 μl წყალში. ნაწილი (8 μl) შეიყვანეს LC-ში. პეპტიდების გამოსაყოფად გამოყენებული იქნა ოქტადეცილსილანის (ODS) სვეტი (Develosil 300ODS-HG-5; შიდა დიამეტრი 150 მმ × 1.0 მმ; Nomura Chemical, აიჩის პრეფექტურა, იაპონია) სპეციფიკური გრადიენტის პირობებში. მობილური ფაზა არის გამხსნელი A (0.08% ჭიანჭველმჟავა) და გამხსნელი B (0.15% ჭიანჭველმჟავა 80% აცეტონიტრილში). Accela HPLC სისტემა (Thermo Fisher Scientific, ბოსტონი, მასაჩუსეტსი) გამოყენებული იქნა სვეტის გამხსნელით A-თი 55 წუთის განმავლობაში 50 μl min-1 ნაკადის სიჩქარით 5 წუთის განმავლობაში, შემდეგ კი გამხსნელი B-ს კონცენტრაცია გაიზარდა 40%-მდე (აშშ). ელუატი განუწყვეტლივ შეჰყავდათ ESI იონების წყაროში, ხოლო ტრიპსული პეპტიდები და GPI-გლიკანებით პეპტიდები გაანალიზდა LTQ Orbitrap XL-ით (ჰიბრიდული ხაზოვანი იონური ხაფანგ-ორბიტრაპ მას-სპექტრომეტრი; Thermo Fisher Scientific). MS სისტემაში კაპილარული წყაროს ძაბვა დაყენებული იყო 4.5 კვ-ზე, ხოლო გადამცემი კაპილარის ტემპერატურა შენარჩუნებული იყო 300°C-ზე. კაპილარული ძაბვა და მილის ლინზის ძაბვა დაყენებული იყო შესაბამისად 15 ვ-ზე და 50 ვ-ზე. MS მონაცემები მიღებული იქნა დადებითი იონების რეჟიმში (გარჩევადობა 60,000; მასის სიზუსტე 10 ნაწილი მილიონში) 300/მ/ზ მასის/მუხტის თანაფარდობით (მ/ზ) 3000 მასის დიაპაზონში. MS/MS მონაცემები მიღებულია LTQ Orbitrap XL-ში არსებული იონური ხაფანგის მეშვეობით [პირველი 3 ციფრი, რომელზეც დამოკიდებულია მონაცემები, შეჯახებით გამოწვეული დისოციაცია (CID)].
MD სიმულაციები ჩატარდა GROMACS (52) პროგრამული უზრუნველყოფისა და MARTINI 2 ძალის ველის (53-55) გამოყენებით. შემდეგ CHARMM GUI მემბრანული აღმდგენი (56, 57) გამოყენებული იქნა დიოლეოილფოსფატიდილქოლინის (DOPC) და Cer C18-ის ან DOPC-ისა და Cer C26-ის შემცველი ორმაგი შრის ასაგებად. Cer C26-ის ტოპოლოგია და კოორდინატები მიღებულია DXCE-დან სფინგოზინის კუდიდან დამატებითი მძივების მოცილებით. გამოიყენეთ ქვემოთ აღწერილი პროცესი ორმაგი შრის დასაბალანსებლად და გასაშვებად, შემდეგ გამოიყენეთ სისტემის ბოლო კოორდინატები Emp24-ის შემცველი სისტემის ასაგებად. საფუარის Emp24-ის ტრანსმემბრანული დომენი (ნარჩენები 173-დან 193-მდე) აგებული იქნა α-სპირალის სახით ვიზუალური MD (VMD) ინსტრუმენტის მოლეკულური სტრუქტურის (58) გამოყენებით. შემდეგ, გადაფარვის ლიპიდების მოშორების შემდეგ, ცილა უხეშად იქნა გრანულირებული და ჩასმული ორშრეში CHARMM GUI-ის გამოყენებით. საბოლოო სისტემა შეიცავს 1202 DOPC-ს და 302 Cer C26-ს ან 1197 DOPC-ს და 295 Cer C18-ს და Emp24-ს. სისტემა იონიზირებულია 0.150M კონცენტრაციამდე. ორი ორშრიანი შემადგენლობისთვის გაკეთდა ოთხი დამოუკიდებელი რეპლიკაცია.
ლიპიდური ორმაგი შრე დაბალანსებულია CHARMM GUI პროცესის გამოყენებით, რომელიც გულისხმობს 405,000 ნაბიჯის მინიმიზაციას და შემდეგ დაბალანსებას, სადაც პოზიციის შეზღუდვები თანდათან მცირდება და აღმოიფხვრება, ხოლო დროის ნაბიჯი იზრდება 0.005 ps-დან 0.02 ps-მდე. დაბალანსების შემდეგ, ის წარმოქმნის 6 µs-ს 0.02 ps დროის ნაბიჯით. Emp24-ის ჩასმის შემდეგ, გამოიყენეთ იგივე CHARMM GUI პროცესი სისტემის მინიმიზაციისა და დაბალანსებისთვის, შემდეგ კი გაუშვით წარმოებაში 8 წამის განმავლობაში.
ყველა სისტემისთვის, დაბალანსების პროცესის დროს, წნევა კონტროლდება ბერენდსენის ბაროსტატით (59), ხოლო წარმოების პროცესის დროს წნევა კონტროლდება პარინელო-რაჰმანის ბაროსტატით (60). ყველა შემთხვევაში, საშუალო წნევაა 1 ბარი და გამოიყენება ნახევრად იზოტროპული წნევის შეერთების სქემა. დაბალანსებისა და წარმოების პროცესში, თერმოსტატი (61) სიჩქარის უკალიბრაციით გამოიყენება ცილის, ლიპიდის და გამხსნელის ნაწილაკების ტემპერატურის შესაბამისად შესაერთებლად. მთელი ოპერაციის განმავლობაში, სამიზნე ტემპერატურაა 310K. არაშემაკავშირებელი ურთიერთქმედება გამოითვლება დაწყვილების სიის გენერირებით ვერლეს სქემის გამოყენებით 0.005 ბუფერული ტოლერანტობით. კულონის ტერმინი გამოითვლება რეაქციის ველის და 1.1 ნმ გამყოფი მანძილის გამოყენებით. ვანდერ-ვაალსის ტერმინი იყენებს გამყოფი სქემას 1.1 ნმ გამყოფი მანძილით, ხოლო ვერლეს გამყოფი სქემა გამოიყენება პოტენციური დრიფტისთვის (62).
VMD-ის გამოყენებით, DOPC ფოსფატის მძივებს ან კერამიდის AM1 მძივებსა და ცილას შორის ზღვრული ტალღის სიგრძეა 0.7 ნმ და გამოითვლება ცილასთან ურთიერთქმედების მქონე ლიპიდების რაოდენობა. შემდეგი ფორმულის მიხედვით, გამოთვალეთ გამოფიტვის-გამდიდრების (DE) კოეფიციენტი (63)-ის მიხედვით: DE ფაქტორი = (ცილაში ლიპიდების საერთო რაოდენობა 0.7) ცილაში 0.7 (Cer-ის რაოდენობა საერთო ლიპიდებში)
მოხსენებული მნიშვნელობა მიიღება საშუალოდ, ხოლო შეცდომის ზოლები SE-ს ოთხ დამოუკიდებელ ასლს წარმოადგენს. DE ფაქტორის სტატისტიკური მნიშვნელობა გამოითვლება t ტესტით [(საშუალოDE-ფაქტორი-1)/SE]. გამოთვალეთ P მნიშვნელობა ცალმხრივი განაწილებიდან.
GROMACS ინსტრუმენტი გამოყენებული იქნა კვალის ბოლო 250 ns-ში Emp24-ის შემცველი სისტემის 2D გვერდითი სიმკვრივის რუკის გამოსათვლელად. ცერამიდის გამდიდრების/გამოფიტვის რუკის მისაღებად, Cer-ის სიმკვრივის რუკა იყოფა Cer-ისა და DOPC-ის რუკის ჯამზე, შემდეგ კი იყოფა Cer-ის კონცენტრაციაზე სხეულში. გამოყენებულია იგივე ფერის რუკის შკალა.
ამ სტატიის დამატებითი მასალებისთვის იხილეთ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
ეს არის ღია წვდომის სტატია, რომელიც გავრცელებულია Creative Commons Attribution-Non-Commercial License-ის პირობებით, რომელიც იძლევა გამოყენების, გავრცელებისა და რეპროდუცირების საშუალებას ნებისმიერ მედიაში, იმ პირობით, რომ საბოლოო გამოყენება არ არის კომერციული სარგებლის მისაღებად და წინაპირობაა, რომ ორიგინალი ნამუშევარი სწორია. წყარო.
შენიშვნა: ჩვენ მხოლოდ თქვენი ელექტრონული ფოსტის მისამართის მითითებას გთხოვთ, რათა გვერდზე თქვენს მიერ რეკომენდაციის გაწევრიანებულმა პირმა იცოდეს, რომ გსურთ, რომ მათ ელ.წერილი ნახონ და რომ ის სპამი არ არის. ჩვენ არ შევინახავთ ელექტრონული ფოსტის მისამართებს.
ეს კითხვა გამოიყენება იმის შესამოწმებლად, ხართ თუ არა ვიზიტორი და ავტომატური სპამის გაგზავნის თავიდან ასაცილებლად.
სოფია როდრიგეს-გალარდო, კაზუო კუროკავა, სუზანა საბიდო-ბოზო, ალეხანდრო კორტესი · გომესი (ალეხანდრო კორტეს-გომესი), აცუკო იკედა (აცუკო იკედა), ვალერია ზონი (ვალერია ზონი), აუქსილიადორა აგილერა-რომერო - ანა პერეზიო (ანა პერეზიო) ვაგა (მიჰო ვაგა), მისაკო არმანი (მისაკო არმანი), მიაკო რიმანი (მიაკო რიმანი), პროუ აკირა, სტეფანო ფანი, აკიჰიკო ნაკანო, მანუელ მუნიზი
3D მაღალი გარჩევადობის რეალურ დროში გამოსახულება ავლენს კერამიდის ჯაჭვის სიგრძის მნიშვნელობას ცილის დახარისხებისთვის შერჩევით გამოსავალ ადგილებში.
სოფია როდრიგეს-გალარდო, კაზუო კუროკავა, სუზანა საბიდო-ბოზო, ალეხანდრო კორტესი · გომესი (ალეხანდრო კორტეს-გომესი), აცუკო იკედა (აცუკო იკედა), ვალერია ზონი (ვალერია ზონი), აუქსილიადორა აგილერა-რომერო - ანა პერეზიო (ანა პერეზიო) ვაგა (მიჰო ვაგა), მისაკო არმანი (მისაკო არმანი), მიაკო რიმანი (მიაკო რიმანი), პროუ აკირა, სტეფანო ფანი, აკიჰიკო ნაკანო, მანუელ მუნიზი
3D მაღალი გარჩევადობის რეალურ დროში გამოსახულება ავლენს კერამიდის ჯაჭვის სიგრძის მნიშვნელობას ცილის დახარისხებისთვის შერჩევით გამოსავალ ადგილებში.
©2020 ამერიკის ასოციაცია მეცნიერების წინსვლისთვის. ყველა უფლება დაცულია. AAAS არის HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef და COUNTER-ის პარტნიორი. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.