გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
ხერხემლიანებისგან განსხვავებით, მწერებს ფართოდ აქვთ გავრცელებული მოსაზრება, რომ მათ არ გააჩნიათ მამრზე ორიენტირებული სასქესო სტეროიდული ჰორმონები. Anopheles gambiae-ში, ეკდიზონის სტეროიდ 20-ჰიდროქსიეკდიზონი (20E), როგორც ჩანს, განვითარდა კვერცხუჯრედის განვითარების კონტროლისთვის, როდესაც ის სინთეზირდება მდედრების მიერ2 და შეჯვარების რეფრაქტერული პერიოდის ინდუცირებისთვის, როდესაც ისინი სქესობრივი გზით გადადიან მამრებზე3. ვინაიდან კვერცხუჯრედის განვითარება და შეჯვარება აუცილებელი რეპროდუქციული თვისებებია, იმის გაგება, თუ როგორ აერთიანებენ მდედრი ანოფელესის კოღოები ამ ჰორმონალურ სიგნალებს, შეიძლება ხელი შეუწყოს მალარიის კონტროლის ახალი პროგრამების შემუშავებას. აქ ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ ეს რეპროდუქციული ფუნქციები რეგულირდება განსხვავებული სასქესო სტეროიდებით ეკდისტეროიდების გამააქტიურებელი/ინაქტივაციის ფერმენტების რთული ქსელის მეშვეობით. ჩვენ გამოვავლინეთ მამრზე სპეციფიკური დაჟანგული ეკდიზონი, 3-დეჰიდრო-20E (3D20E), რომელიც იცავს წარმომავლობას მდედრის სექსუალური მგრძნობელობის გამორთვით სქესობრივი გადაცემის და დეფოსფორილირებით გააქტიურების შემდეგ. აღსანიშნავია, რომ 3D20E გადაცემამ ასევე გამოიწვია რეპროდუქციული გენების ექსპრესია, რომლებიც ინარჩუნებენ კვერცხუჯრედის განვითარებას Plasmodium ინფექციის დროს, რაც უზრუნველყოფს ინფიცირებული მდედრების ჯანმრთელობას. მდედრისგან მიღებული 20E არ იწვევს სექსუალურ... რეაქციას, მაგრამ საშუალებას აძლევს შეჯვარების პროცესში მყოფ ინდივიდებს, კვერცხები დადონ 20E-ინჰიბირების კინაზების ინჰიბირების შემდეგ. ამ მამრ-სპეციფიკური მწერების სტეროიდული ჰორმონის იდენტიფიცირება და მისი როლი ქალის სექსუალური მგრძნობელობის, ნაყოფიერებისა და პლაზმოდიუმთან ურთიერთქმედების რეგულირებაში მიუთითებს მალარიის გადამტანი კოღოების რეპროდუქციული წარმატების შემცირების პოტენციალზე.
მალარიის შემთხვევები და სიკვდილიანობა კვლავ იზრდება4 ანოფელესის კოღოების, ადამიანის მალარიის პარაზიტების ერთადერთ გადამტანში, ინსექტიციდების მიმართ ფართოდ გავრცელებული რეზისტენტობის გამო. ამ კოღოების შეჯვარების ბიოლოგია განსაკუთრებით მიმზიდველი სამიზნეა მალარიის კონტროლის ახალი ინტერვენციებისთვის, რადგან მდედრები მხოლოდ ერთხელ წყვილდებიან5; ამ ერთჯერადი შეჯვარების მოვლენის სტერილიზაციას დიდი პოტენციალი ექნება მინდორში კოღოების პოპულაციის შესამცირებლად.
ქალები სექსუალურად უუნარო ხდებიან მამაკაცებისგან მაღალი ტიტრის მქონე სტეროიდული ჰორმონების მიღების შემდეგ. კვლევებმა აჩვენა, რომ შემდგომი შეჯვარების სირთულეების გამომწვევი მიზეზია 20-ჰიდროქსიეკდიზონი (20E), სტეროიდული ჰორმონი, რომელიც უფრო ცნობილია, როგორც ლარვის სტადიაში დნობის ციკლის რეგულატორი. მამრების 20E-ს სინთეზირებისა და გადაცემის უნარი განვითარდა კონკრეტულად Anopheles-ის სახეობებში, რომლებიც Cellia7 ქვეგვარის ნაწილია, რომელიც გავრცელებულია აფრიკაში და მოიცავს მალარიის ყველაზე საშიშ გადამტანებს, მათ შორის Anopheles gambiae-ს. ეს განსაკუთრებით აღსანიშნავია, რადგან ამ სახეობებში მდედრები ასევე წარმოქმნიან 20E-ს ყოველი სისხლის მიღების შემდეგ, ხოლო 20E მართავს ოოგენეზის ციკლს (იხ. წყარო 8). თუმცა, ცოტა რამ არის ცნობილი იმის შესახებ, თუ როგორ აერთიანებენ მდედრები ეკდიზონის ორი განსხვავებული წყაროდან (მამრების გადაცემა და სისხლით კვების ინდუქცია) მიღებულ სიგნალებს შეჯვარების საკუთარი უნარის კომპრომისის გარეშე. სინამდვილეში, თუ მდედრების მიერ წარმოებული 20E იწვევს სექსუალურ შეუწყნარებლობას, ეს გამოიწვევს უნაყოფობას ქალწულმკვებავ ინდივიდებში, რაც ძალიან გავრცელებული ქცევაა ამ კოღოებში5.
შესაძლო ახსნა ის არის, რომ A. gambiae მამრები გადასცემენ მოდიფიცირებულ მამრ-სპეციფიკურ ეკდიზონს, რომელიც ააქტიურებს სიგნალიზაციის კასკადს მდედრის რეპროდუქციულ ტრაქტში, რაც იწვევს შეჯვარების არასტაბილურობას. თუმცა, მიუხედავად იმისა, რომ ხერხემლიანებს აქვთ მრავალი სტეროიდული ჰორმონი, როგორიცაა ესტროგენი და ანდროგენი (განხილულია 9-ე ბმულში), ჩვენი ინფორმაციით, ანდროგენზე ორიენტირებული სტეროიდები არ არის გამოვლენილი მწერებში.
ჩვენ გადავწყვიტეთ, გაგვეგო სტეროიდული ჰორმონების რეპერტუარი სქესობრივად მომწიფებული A. gambiae-ს მამრობითი სქესის დამატებით ჯირკვალში (MAG) შესაძლო მოდიფიცირებადი სტეროიდების მოსაძებნად. ადრე გამოყენებული ნაკლებად სპეციფიკური მეთოდის ნაცვლად, მაღალი ხარისხის თხევადი ქრომატოგრაფიისა და ტანდემური მას-სპექტრომეტრიის (HPLC-MS/MS) გამოყენებით, ამ ქსოვილში აღმოვაჩინეთ ეკდიზონი (E) და 20E, რითაც დავადასტურეთ წინა შედეგი. თუმცა, ნიმუშში დომინირებდა დაჟანგული ფოსფორილირებული სტეროიდები, რაც შეესაბამება ფორმულას 3-დეჰიდრო-20E-22-ფოსფატი (3D20E22P)12 (სურათი 1). სხვა ფორმებს მიეკუთვნება 3-დეჰიდრო-20E (3D20E) და 20E-22-ფოსფატი (20E22P). 3D20E22P-ის HPLC-MS/MS სიგნალის ინტენსივობა ორი რიგით მაღალი იყო, ვიდრე მისი დეფოსფორილირებული ფორმა, 3D20E, და სამი რიგით მაღალი, ვიდრე E და 20E (სურათი 1). მიუხედავად იმისა, რომ სხეულის სხვა ნაწილებსა და ქვედა... რეპროდუქციული ტრაქტი (LRT; გაფართოებული მონაცემები სურ. 1ა). ჩვენ ასევე გავაანალიზეთ ეკდისტეროიდები ახლად დახურულ (<1 დღის) მამრებსა და მდედრებში და აღმოვაჩინეთ 3D20E და 3D20E22P მხოლოდ MAG-ში; E, 20E და 20E22P ორივე სქესში იყო წარმოდგენილი (გაფართოებული მონაცემები სურ. 1ბ). ეს მონაცემები მიუთითებს, რომ A. gambiae ზრდასრული მამრები თავიანთ MAG-ებში წარმოქმნიან მოდიფიცირებადი ჰორმონების მაღალ ტიტრებს, რომლებიც მდედრების მიერ არ სინთეზირდება.
MAG და მდედრი LRT (მათ შორის წინაგულები, სათესლე ბუშტუკები და პაროვარიუმი) დისექცია განხორციელდა 4 დღის (4 დღის) ქალწული მამრებისა და ქალწული და შეწყვილებული მდედრებისგან (0.5, 3 და 12 hpm). ამ ქსოვილებში ეკდიზონი გაანალიზდა HPLC-MS/MS-ით (საშუალო ± sem; დაუწყვილებელი t-ტესტი, ორმხრივი, ცრუ აღმოჩენის მაჩვენებელი (FDR) კორექტირებული; NS, არ არის მნიშვნელოვანი; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 საათი 0.5 საათის წინააღმდეგ, P = 0.035; 12 საათი 3 საათის წინააღმდეგ, P = 0.0015; 12 საათი 0.5 საათის წინააღმდეგ, P = 0.030. 3D20E22P: 3 საათი 0.5 საათის წინააღმდეგ, P = 0.25; 12 საათი 3 საათის წინააღმდეგ, P = 0.0032; 12 საათი 0.5 საათის წინააღმდეგ, P = 0.015). მონაცემები აღებულია სამი ბიოლოგიური რეპლიკიდან. თითოეული საინტერესო ეკდიზონის პიკის ფართობი გამოითვალა და ნორმალიზებული იქნა კოღოების რაოდენობის მიხედვით. ეკდიზონი წარმოდგენილია შემდეგი ფერით: E, მწვანე; 20E, ნარინჯისფერი; 20E22P, იისფერი; 3D20E, ლურჯი; 3D20E22P, ვარდისფერი. ჩანართი ზრდის მასშტაბს y ღერძზე, რათა აჩვენოს ეკდიზონის დაბალი დონეები.
იმის გამოსაკვლევად, გადადის თუ არა 3D20E22P და 3D20E შეჯვარების დროს, ჩვენ დავაანალიზეთ მდედრი LRT-ები შეჯვარების შემდეგ სხვადასხვა დროს. მიუხედავად იმისა, რომ ეკდიზონი ქალწულებში არ აღმოჩნდა, ჩვენ დავაკვირდით 3D20E22P-ის მნიშვნელოვან რაოდენობას LRT-ში შეჯვარებისთანავე (შეჯვარებიდან 0.5 საათი, hpm), რომელიც დროთა განმავლობაში შემცირდა, ხოლო 3D20E-ს დონე მნიშვნელოვნად გაიზარდა (სურ. 1). ქიმიურად სინთეზირებული 3D20E-ს სტანდარტად გამოყენებით, ჩვენ დავადგინეთ, რომ ამ სტეროიდული ჰორმონის დონე შეჯვარების LRT-ებში მინიმუმ 100-ჯერ მეტი იყო, ვიდრე 20E (გაფართოებული მონაცემთა ცხრილი 1). ამრიგად, 3D20E22P არის მამრის ძირითადი ეკდიზონი, რომელიც გადადის მდედრი LRT-ში შეჯვარების დროს და მისი დეფოსფორილირებული ფორმა, 3D20E, შეჯვარებისთანავე ძალიან უხვად ხდება. ეს მიუთითებს ამ უკანასკნელის მნიშვნელოვან როლზე მდედრის შეჯვარების შემდგომ ბიოლოგიაში.
რნმ-ის ახალი სეკვენირების (RNA-seq) მონაცემთა ნაკრების გენერირების შემდეგ (სურ. 2ა), სპეციალურად შექმნილი ბიოინფორმატიკური მილსადენის გამოყენებით, ჩვენ მოვიძიეთ ეკდიზონ კინაზა (EcK), ეკდიზონ ოქსიდაზა (EO) და ეკდიზონი, რომელიც აკოდირებს 20E-მოდიფიცირებულ ფოსფატაზას გენს (EPP) რეპროდუქციულ ქსოვილებში. ჩვენ დავადგინეთ ერთი კანდიდატი EPP გენი და ორი პოტენციური EcK გენი (EcK1 და EcK2), მაგრამ ვერ ვიპოვეთ კარგი კანდიდატი EO გენი. აღსანიშნავია, რომ ცალკეული EPP გენები მაღალი დონით (98.9-ე პროცენტილი) იყო გამოხატული გამბიის MAG-ებში, მაგრამ არა მდედრობითი LRT-ებში (სურ. 2ბ), ჩვენი მოლოდინების საწინააღმდეგოდ, რადგან 3D20E22P-ის დეფოსფორილირება მოხდა ამ მდედრობითი ქსოვილში. ამიტომ, ჩვენ გვჯერა, რომ მამრობითი EPP შეიძლება გადავიდეს შეჯვარების დროს. მართლაც, ჩვენ გამოვიყენეთ in vivo სტაბილური იზოტოპის მარკირება შეჯვარების შემდეგ მდედრობითი ცილის დასაფარად, ფერმენტი, რომელიც იდენტიფიცირებულია MS-ით მდედრობითი წინაგულში (სურ. 2გ და დამატებითი ცხრილი 1). EPP-ის არსებობა MAG-სა და შეწყვილებულ (მაგრამ არა ქალწულ) მდედრ LRT-ში ასევე დადასტურდა სპეციფიკური ანტისხეულების გამოყენებით (სურ. 2დ).
ა, ინდივიდუალურად შექმნილი ბიოინფორმატიკული მილსადენი თითოეული სქესის რეპროდუქციული ქსოვილების მოსაძებნად, რომლებიც აკოდირებენ EcK-ებს, EO-ებს და EPP-ებს. ისრების გვერდით მოცემული რიცხვები მიუთითებს მამრობითი და მდედრობითი სქესის კანდიდატების რაოდენობას თითოეულ ეტაპზე. ამ ანალიზმა გამოავლინა ერთი EPP გენი (EPP) და ერთი EcK გენი (EcK1), რომლებიც გამოხატულია მამრებში, და ერთი EcK გენი (EcK2), რომელიც გამოხატულია ორივე სქესში, მაგრამ არ იძლევა კანდიდატ EO გენს. ბ, სითბური რუკა, რომელიც ადარებს კანდიდატი გენის ექსპრესიას ქალიშვილობის (V) და შეჯვარების (M) Anopheles gambiae-ს და Anopheles albicans-ის ქსოვილებში. Spca, განაყოფიერება; MAG-ები, დამხმარე ჯირკვლები მამრებში; სხეულის სხვა ნაწილები, მათ შორის მკერდი, ფრთები, ფეხები, ცხიმოვანი სხეულები და შინაგანი ორგანოები ორივე სქესში და საკვერცხეები მდედრებში. EcK2 მაღალი ექსპრესიით ხასიათდება როგორც გამბიის MAG-ში, ასევე წინაგულებში, მაშინ როცა EPP მხოლოდ MAG-შია.c, მამრის ეაკულატის ჯგუფის მდედრის წინაგულებში ტრანსლოკაციის პროტეომიკური ანალიზი 3, 12 და 24 hpm სიჩქარით, რაც აჩვენებს 67 ყველაზე გავრცელებულ ცილას. მდედრები გაიზარდნენ დიეტაზე, რომელიც შეიცავდა 15N-ს ყველა ცილის მარკირებისთვის (და შენიღბვისთვის). დაუნიშნული მამრები შეწყვილდნენ მონიშნულ მდედრებთან და მდედრი LRT-ები დაიშალა 3, 12 და 24 hpm სიჩქარით პროტეომიკური ანალიზისთვის (იხილეთ დამატებითი ცხრილი 1 ეაკულაციური ცილების სრული სიისთვის). ჩანართში, EPP, Eck1 და EcK2 აღმოჩენილი იქნა ქალწული მამრების MAG-ში ამ ქსოვილების პროტეომიკური ანალიზით.d, EPP აღმოჩენილი იქნა Western blot-ით შეწყვილებული მდედრების MAG-სა და LRT-ში, მაგრამ არა ქალწულ მდედრებში ან მამრებში ან მდედრის დანარჩენ ნაწილში. სხეული. მემბრანები ერთდროულად გამოიკვლიეს ანტი-აქტინის (დატვირთვის კონტროლი) და ანტი-EPP ანტისხეულებით. ყველა მამრი ქალწულია. გელის წყაროს მონაცემების სანახავად იხილეთ დამატებითი სურათი 1. Western blots ჩატარდა ორჯერ მსგავსი შედეგებით.
EPP-ის ეკდისტეროიდული ფოსფოფოსფატაზას აქტივობა დადასტურდა HPLC-MS/MS-ით ინკუბაციის შემდეგ MAG-დან იზოლირებული 3D20E22P-ით (გაფართოებული მონაცემები სურ. 2ა). გარდა ამისა, როდესაც EPP რნმ-შუამავლობით ინტერფერენციით (RNAi) გავაჩუმეთ, ამ მამრების რეპროდუქციულ ქსოვილებში ფოსფატაზას აქტივობის ძლიერი შემცირება აღმოვაჩინეთ (სურ. 3ა) და EPP-გაჩუმებულ მამრებთან შეჯვარებულმა მდედრებმა აჩვენეს დეფოსფორილირებული 3D20E-ს მნიშვნელოვნად დაბალი პროპორცია (სურ. 3ბ) გენის ნაწილობრივი გაჩუმების მიუხედავად (გაფართოებული მონაცემები სურ. 2ბ,გ). ამის საპირისპიროდ, იმავე კოღოებში 20E22P/20E თანაფარდობის მნიშვნელოვანი ცვლილებები არ აღმოვაჩინეთ, რაც შეიძლება იმაზე მიუთითებდეს, რომ ფერმენტი სპეციფიკურია 3D20E22P-სთვის (სურ. 3ბ).
ა, MAG-ში ფოსფატაზას აქტივობის შემცირება, გამოწვეული EPP-ის ორჯაჭვიანი EPP RNA-ს (dsEPP) ან ორჯაჭვიანი GFP RNA-ს (dsGFP) კონტროლის გამოყენებით EPP-ის ჩახშობით. თითოეულ რეპლიკატში გამოყენებული იქნა ოცი MAG ჯგუფი (P = 0.0046, დაწყვილებული t-ტესტი, ორმხრივი), რომლებიც წარმოდგენილია ცალკეული წერტილებით. ბ, EPP-ით ჩახშულ მამრებთან შეწყვილებულ მდედრებს ჰქონდათ დეფოსფორილირებული 3D20E-ს მნიშვნელოვნად დაბალი პროპორცია 3 hpm-ზე (P = 0.0043, დაუწყვილებელი t-ტესტი, ორმხრივი), მაშინ როდესაც 20E-ს დონეები უცვლელი დარჩა (P = 0.063, დაუწყვილებელი). t-ტესტი, ორმხრივი). მონაცემები წარმოდგენილია საშუალო ± სემ-ის სახით სამი ჯგუფიდან, თითოეული 13, 16 და 19 მდედრისგან. გ, EPP-ის მიერ გაჩუმებულ მამრებთან შეწყვილებულ მდედრებს ხელახალი შეწყვილების მნიშვნელოვნად მაღალი მაჩვენებლები ჰქონდათ (P = 0.0002, ფიშერის ზუსტი ტესტი, ორმხრივი). მდედრები თავდაპირველად იძულებით შეწყვილდნენ, რათა უზრუნველყოფილიყო მათი შეჯვარების სტატუსი; 2 დღის შემდეგ, მათ დაუკავშირდნენ ტრანსგენური სპერმის მატარებელ სხვა მამრებს, რათა შეფასებულიყო ტრანსგენის რაოდენობრივი PCR გამოვლენით ხელახალი შეჯვარების მაჩვენებლები.d, სისხლით კვებაზე მყოფ მდედრებს, რომლებიც შეჯვარებულნი იყვნენ EPP-ით გაჩუმებულ მამრებთან, მნიშვნელოვნად შემცირებული ჰქონდათ ნაყოფიერება (P < 0.0001; მან-უიტნის ტესტი, ორმხრივი) და ოდნავ შემცირებული კვერცხუჯრედების რაოდენობა (P = 0.088, მან-უიტნის ტესტი, ორმხრივი), ხოლო ქვირითობის სიჩქარეზე გავლენა არ მოუხდენია (P = 0.94, ფიშერის ზუსტი ტესტი, ორმხრივი). ყველა პანელში, n წარმოადგენს ბიოლოგიურად დამოუკიდებელი კოღოს ნიმუშების რაოდენობას. NS, არ არის მნიშვნელოვანი.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
შემდეგ, ჩვენ შევაფასეთ, მნიშვნელოვანია თუ არა ეკდიზონის დეფოსფორილირება მდედრებში შეჯვარებისადმი რეზისტენტობის გამოწვევისთვის. აღსანიშნავია, რომ მდედრები, რომლებიც შეჯვარდნენ EPP-ის უკმარისობის მქონე მამრებთან, ხელახლა შეჯვარდნენ გაცილებით მაღალი სიხშირით (44.9%), ვიდრე საკონტროლო მდედრები (10.4%), როდესაც შეეხნენ დამატებით (ტრანსგენურ) მამრებს (სურ. 3გ). ჩვენ ასევე დავაკვირდით ნაყოფიერების მნიშვნელოვან შემცირებას (სურ. 3დ, მარცხნივ) და ამ მდედრების მიერ დადებული კვერცხების რაოდენობის უმნიშვნელო შემცირებას (სურ. 3დ, შუაში), ხოლო მდედრების მიერ დადებული კვერცხების პროცენტულ მაჩვენებელზე (დედლებში შეჯვარების შედეგად გამოწვეული კიდევ ერთი რეაქცია) გავლენა არ მოუხდენია (სურ. 3დ, მარჯვნივ). 3D20E22P-სთვის EPP-ის დაკვირვებული სპეციფიკურობის გათვალისწინებით, ეს შედეგები მიუთითებს, რომ შეჯვარების დროს გადაცემული EPP-ის მიერ 3D20E-ს აქტივაციას შეიძლება მნიშვნელოვანი როლი ჰქონდეს მდედრების შემდგომი შეჯვარებისადმი მგრძნობელობის გამორთვაში, ქცევა, რომელიც ადრე 20E-ს სექსუალურ გადაცემას მიეწერებოდა. ამიტომ, ეს მამრობითი სქესის სპეციფიკური ჰორმონი ასევე ძლიერ გავლენას ახდენს მდედრების ნაყოფიერებაზე.
შემდეგ, ჩვენ შევადარეთ 20E-სა და 3D20E-ს აქტივობები სქესობრივად მომწიფებულ ქალწულებში ინექციის ექსპერიმენტებში, ქიმიურად სინთეზირებული 3D20E-ს (სურ. 4ა-გ) და კომერციულად ხელმისაწვდომი 20E-ს გამოყენებით. ჩვენ დავაკვირდით, რომ 3D20E მნიშვნელოვნად უფრო ეფექტური იყო, ვიდრე 20E დედლების შეჯვარებისადმი მგრძნობელობის გამორთვაში ორივე კონცენტრაციით (სურ. 4დ). აღსანიშნავია, რომ LRT-ში 3D20E-ს ფიზიოლოგიური დონის ნახევარი (1,066 pg ინექციის შემდეგ 2,022 pg-ის წინააღმდეგ შეჯვარების შემდეგ) იწვევდა რეფრაქტერული დედლების პროპორციას, რომელიც 20-ჯერ მეტი იყო 20E-ს ფიზიოლოგიურ დონესთან (361 pg ინექციის შემდეგ) შეჯვარების შემდეგ ყველაზე მაღალი კონცენტრაციით 18 pg; გაფართოებული მონაცემების ცხრილი 1). ეს შედეგი თანხვედრაშია იმ მოსაზრებასთან, რომ 20E-ს სქესობრივი გადაცემა არ იწვევს შეჯვარების რეფრაქტერულ პერიოდებს და დამატებით მიუთითებს 3D20E-ზე, როგორც მშობელ-შვილის ურთიერთობის უზრუნველყოფის მთავარ ფაქტორზე. 3D20E ასევე მნიშვნელოვნად უფრო აქტიური იყო, ვიდრე 20E ქალწულ დედლებში კვერცხდების ანალიზებში (სურ. 4e), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ EPP-ს ნაწილობრივი ჩახშობის შემდეგ ჩვენს მიერ დაფიქსირებული ნორმალური კვერცხდების მაჩვენებელი განპირობებული იყო შეჯვარებით გამოწვეული დედლების ფაქტორებით კვლავ წარმოქმნილი 3D20E-ს ნარჩენი აქტივობის არსებობით.
(ა,ბ) 3D20E ქიმიურად სინთეზირებული 20E-დან (ა) ძალიან მაღალი გარდაქმნის/ეფექტურობით (მონაცემები წარმოდგენილია სამი დამოუკიდებელი სინთეზის რეაქციიდან მიღებული საშუალო ± სემ-ის სახით) (ბ).გ, მასის სპექტრი (ქვედა ნახევარი) ზუსტად ემთხვევა შეწყვილებულ მდედრ LRT-ში აღმოჩენილ ეკდიზონს (ზედა ნახევარი).დ, შედარებით 20E-სთან (0.63 მკგ, P = 0.02; 0.21 მკგ, P < 0.0001; ფიშერის ზუსტი ტესტი, ორმხრივი) და 10%-იან ეთანოლთან (0.63 მკგ, P < 0.0001; 0.21 მკგ, P < 0.0001; ფიშერის ზუსტი ტესტი, ორმხრივი), მაშინ როდესაც 20E მნიშვნელოვნად მაღალი იყო კონტროლთან შედარებით მხოლოდ უფრო მაღალი დოზებით (0.63 მკგ, P = 0.0002; 0.21 მკგ, P = 0.54; ფიშერის ზუსტი ტესტი, ორმხრივი).ე, 3D20E ინექციით გამოწვეული ქალწულ დედლებში მნიშვნელოვნად მაღალი ქვირითობის მაჩვენებელი დაფიქსირდა 10%-იანი ეთანოლის საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (0.21 მკგ, P < 0.0001; 0.13 მკგ, P = 0.0003; ფიშერის ზუსტი ტესტი, ორმხრივი), ხოლო 20E საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით მხოლოდ უფრო მაღალი დოზებით (0.21 მკგ, P = 0.022; 0.13 მკგ, P = 0.0823; ფიშერის ზუსტი ტესტი, ორმხრივი). 3D20E-მ გამოიწვია მნიშვნელოვნად მაღალი ქვირითობის მაჩვენებელი, ვიდრე 20E-მ უფრო მაღალი დოზებით (0.21 მკგ, P = 0.0019; 0.13 მკგ, P = 0.075; ფიშერის ზუსტი ტესტი, ორმხრივი). ყველა პანელში, n წარმოადგენს ბიოლოგიურად დამოუკიდებელი კოღოს ნიმუშების რაოდენობას. NS, არ არის მნიშვნელოვანი.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. მონაცემები აღებულია სამიდან. იმეორებს.
წინა კვლევებში ჩვენ დავადგინეთ, რომ სტეროიდული ჰორმონების სქესობრივი გადაცემა იწვევს MISO-ს (შეწყვილებით გამოწვეული ოოგენეზის სტიმულატორი 11) ექსპრესიას, მდედრის რეპროდუქციული გენის, რომელიც იცავს A. gambiae მდედრებს P. falciparum ინფექციისგან. ჯანმრთელობის ხარჯები, რაც გამოწვეულია 13-ით, ადამიანის მალარიის ყველაზე სასიკვდილო პარაზიტით. MISO-ს მნიშვნელობის გათვალისწინებით ანოფელეს რეპროდუქციული ვარგისიანობისთვის მალარიის ენდემურ რაიონებში, ჩვენ გადავწყვიტეთ დაგვედგენინა, რომელი ჰორმონი, 3D20E თუ 20E, იწვევს ამ გენის ექსპრესიას. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ მიუხედავად იმისა, რომ 20E ინექცია სპეციფიკურად ან უფრო ძლიერად იწვევდა ზოგიერთ ბირთვულ ჰორმონალურ რეცეპტორს (HR), როგორიცაა HR3 და HR4, და ტიპურ სტეროიდულ სამიზნეებს, როგორიცაა იოლგენური გენები Vg14, 15, 16, MISO უფრო ძლიერად იყო ინდუცირებული 3D20E-ით (გაფართოებული მონაცემები სურ. 3). ამრიგად, ამ ანდროგენული სტეროიდული ჰორმონის სქესობრივი გადაცემა, როგორც ჩანს, იწვევს მექანიზმებს, რომლებიც იცავს მდედრებს პარაზიტული ინფექციის მიერ გამოწვეული ხარჯებისგან. გარდა ამისა, 3D20E დიფერენცირებულად მოქმედებს ორივე იზოფორმაზე. E რეცეპტორის EcR-ის ინდუცირება, EcR-A-ს ინდუცირება და EcR-B-ს თრგუნვა და უფრო ძლიერად სხვა შეჯვარების გამომწვევი გენების გააქტიურება, მათ შორის HPX15-ის, რაც გავლენას ახდენს ქალის ნაყოფიერებაზე. ამან შეიძლება ახსნას მნიშვნელოვანი უნაყოფობა, რომელიც დაფიქსირდა EPP-ჩახშულ მამრებთან შეჯვარებულ ქალებში (გაფართოებული მონაცემები სურ. 3). ეს მონაცემები მიუთითებს ქვედა დინების გზების არსებობაზე, რომლებიც უპირატესად აქტიურდება ორი ეკდიზონის ჰორმონით, რომლებიც შეიძლება სქესის სპეციფიკური ფუნქციის საფუძველი იყოს.
შემდეგ, ჩვენ გამოვცადეთ ჩვენს ბიოინფორმატიკულ მილსადენში იდენტიფიცირებული ორი EcK გენის ფუნქცია. EcK1-ის ან EcK2-ის გაჩუმებამ მამრებში მნიშვნელოვანი სიკვდილიანობა გამოიწვია (გაფართოებული მონაცემები სურ. 4ა), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ეკდიზონის ფოსფორილირება და შესაბამისად, ინაქტივაცია მნიშვნელოვანია გადარჩენისთვის. იმის გამო, რომ EcK2 ექსპრესირდებოდა EcK1-ზე მაღალ დონეზე და აღმოჩენილი იყო MAG-ებში პროტეომიკის საშუალებით (სურ. 2ბ, გ და დამატებითი ცხრილი 2), ჩვენ დავადასტურეთ მისი ეკდისტეროიდული კინაზას აქტივობა 20E-სთან ინკუბაციით, რამაც გამოიწვია 20E22P-ის ფოსფორილირება (გაფართოებული მონაცემები სურ. 2). 3D20E-ს სუბსტრატად გამოყენებისას, ჩვენ ვერ შევძელით ფოსფორილირებული პროდუქტის 3D20E22P აღმოჩენა (გაფართოებული მონაცემები სურ. 4გ), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ 20E და არა 3D20E შეიძლება იყოს EcK2-ის სასურველი სამიზნე.
ჩვენი RNA-seq ანალიზის მიხედვით, EcK2 ასევე მაღალი ექსპრესიით გამოირჩეოდა ქალწული დედლების LRT-ში, სადაც ის შეჯვარების შემდეგ გამორთული იყო (სურ. 2ბ). ჩვენ დავადასტურეთ ეს მონაცემები და დავადგინეთ, რომ სისხლით კვება გავლენას არ ახდენდა EcK2-ის ექსპრესიაზე (გაფართოებული მონაცემები სურ. 5ა). ჩვენი საწყისი MS ექსპერიმენტების გაფართოებით, ჩვენ დავადგინეთ, რომ 20E22P-ის პიკი მჭიდრო კავშირში იყო 20E-ს პიკთან (სისხლის მიღებიდან 22-26 საათის შემდეგ; გაფართოებული მონაცემები სურ. 5ბ). ქალწულ დედლებში EcK2-ის გაჩუმებამ გამოიწვია 20E-სა და 20E22P-ს ფარდობითი თანაფარდობის 3-ჯერ გაზრდა სისხლის მიღებიდან 26 საათის შემდეგ (გაფართოებული მონაცემები სურ. 2გ და 5გ), რაც ადასტურებს, რომ EcK2 ასევე ფოსფორილებს 20E-ს დედლებში. აღსანიშნავია, რომ EcK2-ით დაცლილმა ქალწულებმა შეინარჩუნეს სრული სექსუალური მგრძნობელობა (გაფართოებული მონაცემები სურ. 5დ,ე), რაც კიდევ ერთხელ მიუთითებს, რომ დედლების მიერ 20E-ს წარმოება არ იწვევს შეჯვარების რეფრაქტერულ პერიოდებს. თუმცა, ეს დედლები საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით, ქალწულებში მნიშვნელოვნად გაზრდილი კვერცხდების მაჩვენებელი იყო, ქალწულების 30%-ზე მეტმა კი კვერცხები დადო (გაფართოებული მონაცემები სურ. 5f). თუ სისხლით კვების შემდეგ ორჯაჭვიანი Eck2 RNA (dsEcK2) ინექციები ჩატარდა, ქვირითობა არ მომხდარა, რის შემდეგაც სისხლის გადაყლაპვის შედეგად მიღებული 20E პიკი შემცირდა. საერთო ჯამში, ეს შედეგები ადასტურებს მოდელს, რომ სისხლის წოვის შემდეგ წარმოქმნილ 20E-ს შეუძლია ქვირითობის გამოწვევა, მაგრამ მხოლოდ მაშინ, როდესაც ქვირითობის ბლოკი (EcK2 და შესაძლოა სხვა ფაქტორები) შეჯვარებით გამორთულია. არც 20E-ს და არც 3D20E ინექციებმა არ დათრგუნა EcK2 ექსპრესია ქალწულებში (გაფართოებული მონაცემები სურ. 5g), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ სხვა ფაქტორები ახდენენ ამ კინაზას ინჰიბირებას. თუმცა, სისხლით კვების შემდეგ 20E დონეები არ იყო საკმარისი შეჯვარების დისკომფორტის გამოსაწვევად, არამედ ეფექტურად გამოწვეული იყო სქესობრივი გზით გადაცემული 3D20E-ს მაღალი ტიტრებით.
ჩვენი შედეგები მნიშვნელოვან ინფორმაციას გვაწვდის A. gambiae-ს რეპროდუქციული წარმატების მარეგულირებელი მექანიზმების შესახებ. გაჩნდა მოდელი, სადაც მამრები განვითარდნენ 3D20E-ს მაღალი ტიტრების სინთეზირებისთვის, მამრებისთვის სპეციფიკური მოდიფიცირებული ეკდიზონი, რომელიც უზრუნველყოფს წარმომავლობას მდედრების შემდგომი შეჯვარებისადმი დესენსიბილიზაციის გზით. ამავდროულად, ამ მალარიის ვექტორებმა ასევე შეიმუშავეს ეფექტური სისტემა მდედრებში 3D20E-ს გასააქტიურებლად მამრებისთვის სპეციფიკური EPP-ს სქესობრივი გადაცემის საპასუხოდ. ჩვენი ინფორმაციით, ეს არის მამრებისა და მდედრების მიერ დომინირებული სტეროიდული ჰორმონალური სისტემის პირველი მაგალითი, რომელიც ასრულებს უნიკალურ და კრიტიკულ ფუნქციას მწერებში. მამრებისთვის სპეციფიკური ეკდიზონის ფუნქცია პოსტულირებულია, მაგრამ საბოლოოდ არ არის დემონსტრირებული. მაგალითად, დიდწილად უარყოფილი ჰიპოთეზა 18 არის ის, რომ ეს ფუნქციები შეიძლება შესრულდეს 20E წინამორბედი E1-ის მიერ. კარგად არის ცნობილი, რომ დროზოფილაში მონანდრია გამოწვეულია მცირე სასქესო პეპტიდების სქესობრივი გადაცემით 19,20, რომლებიც ურთიერთქმედებენ ნეირონებთან, რომლებიც აინერვებენ ქალის რეპროდუქციულ ტრაქტს სპეციფიკური სასქესო პეპტიდის რეცეპტორების მეშვეობით 21,22. საჭიროა შემდგომი მუშაობა ქვედა დინების დასადგენად. A. gambiae-ს მდედრებში 3D20E-ს მიერ კონტროლირებადი სიგნალიზაციის კასკადების შესწავლა და იმის დადგენა, შესაძლებელია თუ არა ამ კასკადების შენარჩუნება კოღოებსა და დროზოფილას შორის.
ჩვენს კვლევაში გამოვლენილი 3D20E-ს მნიშვნელოვანი როლის გათვალისწინებით მდედრების ნაყოფიერებასა და ქცევაზე, 3D20E სინთეზისა და გააქტიურების გზები ქმნის ახალ შესაძლებლობებს კოღოების კონტროლის სამომავლო სტრატეგიებისთვის, როგორიცაა კონკურენტუნარიანი სტერილური მამრების გენერაცია სტერილური მწერების ტექნოლოგიური სტრატეგიების გამოყენებით ველური ბუნებისთვის ან 3D20E-ს იმიტაციისთვის ქალწულებრივ თამაშში. 3D20E-ს მამრებისთვის სპეციფიკური ფუნქცია შესაძლოა განვითარდა მაშინ, როდესაც A. gambiae-მ და Cellia-ს სხვა სახეობებმა შეიძინეს სპერმის შეჯვარების საცობებად კოაგულაციის უნარი, რადგან ეს საშუალებას იძლევა დიდი რაოდენობით ჰორმონებისა და ჰორმონ-გამააქტიურებელი ფერმენტების ეფექტურად გადატანის. თავის მხრივ, 3D20E ევოლუცია, რომელიც ახორციელებს მონანდრიას, უზრუნველყოფს მექანიზმს მდედრებისთვის (MISO-ს მაღალი ექსპრესიის გზით), რათა ხელი შეუწყონ მათ რეპროდუქციულ ვარგისიანობას მალარიის მაღალი გავრცელების ადგილებში, რაც ირიბად ხელს უწყობს Plasmodium-ის გადაცემას. იმის გათვალისწინებით, რომ მდედრი 20E-ს, როგორც დადასტურებულია, ღრმა გავლენა აქვს P. falciparum-ის გადარჩენასა და ზრდაზე მდედრ Anopheles კოღოებში,24 როგორც მამრი, ასევე მდედრი სტეროიდული ჰორმონების გზები ახლა კოღო-პარაზიტის ურთიერთქმედების ძირითადი ასპექტებია.
A. gambiae G3 შტამები გამოყვანილი იქნა მწერების სტანდარტულ პირობებში (26-28 °C, 65-80% ფარდობითი ტენიანობა, 12:12 სთ სინათლის/სიბნელის ფოტოპერიოდები). ლარვებს კვებავდნენ თევზის ფხვნილით (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets და Tetra Pond Sticks 7:7:2 თანაფარდობით). ზრდასრულ კოღოებს კვებავდნენ ad libitum 10%-იანი დექსტროზის ხსნარით და ყოველკვირეულად ადამიანის სისხლით (საკვლევი სისხლის კომპონენტები). ხელუხლებელი კოღოები მიღებული იქნა სქესის მიხედვით სეგრეგაციით ჭუპრის სტადიაზე, ბოლოების მიკროსკოპიით შესწავლის შემდეგ. DsRed ტრანსგენის მატარებელი მამრები ადრეც იყო აღწერილი.
იძულებითი შეჯვარების ექსპერიმენტები ჩატარდა ადრე აღწერილი პროტოკოლების მიხედვით. ბუნებრივი შეჯვარებისთვის, 4 დღის ქალწული დედლები ორი ღამის განმავლობაში 1:3 თანაფარდობით შეინახეს სქესობრივად მომწიფებულ ქალწულ მამრებთან ერთად. ექსპერიმენტებში, რომლებშიც მამრებს dsEPP შეჰყავდათ, ერთობლივი გალიაში განთავსება დაემთხვა ინექციიდან 3-4 დღეს, როდესაც ფოსფატაზას აქტივობა მაქსიმალურად იყო შემცირებული (გაფართოებული მონაცემები სურ. 2ბ).
კოღოს ქსოვილები, დარჩენილი გვამები (სხეულის დანარჩენი ნაწილი) ან მთელი სხეული დაიშალა 100%-იან მეთანოლში და ჰომოგენიზირებული იქნა მძივებით (2 მმ-იანი შუშის მძივები, 2400 ბრ/წთ, 90 წმ). ქსოვილის რაოდენობა და მეთანოლის მოცულობები შემდეგი იყო: სხეულის დანარჩენი ნაწილი, 50 1000 µლ-ში; MAG, 50–100 80 µლ; მდედრი LRT, 25–50 80 µლ. ნალექი დაექვემდებარა მეთანოლის მეორე ექსტრაქციას მეთანოლის იგივე მოცულობით. უჯრედის ნარჩენები ამოიღეს ცენტრიფუგირებით. ორივე ექსტრაქციიდან მიღებული მეთანოლი შეურიეს და გააშრეს აზოტის ნაკადის ქვეშ, შემდეგ ხელახლა შესუსტდა წყალში 80%-იანი მეთანოლის შემდეგი მოცულობებით: სხეულის დანარჩენი ნაწილი, 50 µლ; MAG-ები და მდედრი LRT, 30 µლ.
ნიმუშები გაანალიზდა მას-სპექტრომეტრზე (ID-X, Thermo Fisher), რომელიც შეერთებული იყო LC ინსტრუმენტთან (Vanquish, Thermo Fisher). ნიმუშის 5 µლ შეიყვანეს 3 µm, 100 × 4.6 მმ სვეტში (Inspire C8, Dikma), რომელიც შენარჩუნებული იყო 25°C ტემპერატურაზე. LC-ს მობილური ფაზები იყო A (წყალი, 0.1% ჭიანჭველმჟავა) და B (აცეტონიტრილი, 0.1% ჭიანჭველმჟავა). LC გრადიენტი იყო შემდეგი: 5% B 1 წუთის განმავლობაში, შემდეგ გაიზარდა 100%-მდე B 11 წუთის განმავლობაში. 8 წუთის შემდეგ 100%-იან ტემპერატურაზე, ხელახლა დააბალანსეთ სვეტი 5% B 4 წუთის განმავლობაში. ნაკადის სიჩქარე იყო 0.3 მლ წთ-1. MS წყაროში იონიზაცია ხორციელდება გაცხელებული ელექტროსპრეის იონიზაციით დადებით და უარყოფით რეჟიმებში.
მას-სპექტრომეტრი ზომავს მონაცემებს m/z დიაპაზონში 350-დან 680-მდე, 60,000 გარჩევადობით, სრული MS რეჟიმში. MS/MS მონაცემები მიღებული იქნა [M + H]+ (ყველა სამიზნე), [M - H2O + H]+ (ყველა სამიზნე) და [M - H]- (ფოსფორილირებული სამიზნეები)-ზე. MS/MS მონაცემები გამოყენებული იქნა იმ სამიზნეების ეკდიზონის თვისებების დასადასტურებლად, რომელთათვისაც სტანდარტი არ არსებობდა. არასამიზნე ეკდისტეროიდების იდენტიფიცირებისთვის, გაანალიზდა ყველა HPLC პიკის MS/MS მონაცემები >15%-იანი ფარდობითი სიჭარბით. რაოდენობრივი განსაზღვრა განხორციელდა სუფთა სტანდარტებიდან (20E, 3D20E) შექმნილი სტანდარტული მრუდების გამოყენებით, რათა გამოითვალოს ერთი კონკრეტული ნიმუშის (ყველა სხვა სამიზნე) აბსოლუტური რაოდენობები ან განზავებები, რათა გამოითვალოს მათი ეკვივალენტობა ერთ მამრში ნაპოვნი რაოდენობებთან. 3D20E-სთვის, რაოდენობრივი განსაზღვრა ჩატარდა შემდეგი ადუქტების ჯამის გამოყენებით: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. მონაცემები ამოღებული და რაოდენობრივად განსაზღვრული იქნა Tracefinder-ის (ვერსია 4.1) გამოყენებით. MS/MS მონაცემები გაანალიზდა Xcalibur-ის (ვერსია 4.4) გამოყენებით. E, 20E და 3D20E-ს MS სპექტრები შედარებული იქნა შესაბამის სტანდარტებთან. 3D20E22P გაანალიზდა ჟირარის რეაგენტით წარმოებულებით. 20E22P გაანალიზდა m/z თანაფარდობით.
3D20E22P გაიწმინდა MAG-დან. გაწმენდა ჩატარდა ანალიტიკური მასშტაბით ულტრაეფექტური თხევადი ქრომატოგრაფის (Acquity, Waters) გამოყენებით კვადრუპოლური მასაზე დაფუძნებული დეტექტორით (QDa, Acquity, Waters) იმავე LC პირობებში, როგორც HPLC-MS/MS ანალიზი. ფრაქციის შეგროვება დაიწყო, როდესაც 3D20E22P-ის შესაბამისი m/z აღმოჩენილი იქნა იმავე შეკავების დროს, როგორც ადრე იყო განსაზღვრული. ექსტრაგირებული ნაერთების სისუფთავე შემდეგ შემოწმდა HPLC-MS/MS-ით, როგორც ზემოთ იყო აღწერილი.
მთლიანი რნმ ექსტრაგირებული იქნა 10-12 რეპროდუქციული ქსოვილიდან ან სხეულის სხვა ნაწილებიდან (თავის გარეშე) TRI რეაგენტის (Thermo Fisher) გამოყენებით მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად. რნმ დამუშავდა TURBO DNase-ით (Thermo Fisher). cDNA სინთეზირებული იქნა Moloney-ის თაგვის ლეიკემიის ვირუსის უკუტრანსკრიპტაზას (M-MLV RT; Thermo Fisher) გამოყენებით მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად. უკუტრანსკრიფციის რაოდენობრივი PCR-ის პრაიმერები (RT-qPCR; გაფართოებული მონაცემების ცხრილი 2) ადრე გამოქვეყნდა24 ან შეიქმნა Primer-BLAST26-ის გამოყენებით, უპირატესობა ენიჭებოდა 70-150 bp ზომის პროდუქტებს და ეგზონ-ეგზონის შეერთებებს ან პრაიმერის წყვილის პრაიმერებს, რომლებიც ეგზონებს გამოყოფენ. cDNA ნიმუშები სამიდან ოთხ ბიოლოგიურ რეპლიკატამდე ოთხჯერ განზავდა წყალში RT-qPCR-ისთვის. რაოდენობრივი განსაზღვრა ჩატარდა 15 µl რეპლიკაციურ რეაქციებში, რომლებიც შეიცავდა 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), პრაიმერებს და 5 µl განზავებულ cDNA-ს. რეაქციები ჩატარდა QuantStudio-ზე. 6 Pro რეალურ დროში PCR სისტემა (Thermo Fisher) და მონაცემები შეგროვდა და გაანალიზდა Design and Analysis-ის (ვერსია 2.4.3) გამოყენებით. როგორც ამ კვლევაში იყო ნაჩვენები, ფარდობითი რაოდენობები ნორმალიზებული იყო რიბოსომული გენ RpL19-ის (AGAP004422) მიმართ, რომლის ექსპრესია მნიშვნელოვნად არ შეცვლილა სისხლის მიწოდებისას27 ან შეჯვარებისას3.
რნმ-ის ხარისხი შემოწმდა Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer-ის (Agilent) გამოყენებით. Illumina-ს შეწყვილებული ბოლოების ბიბლიოთეკები მომზადდა და გამოიყენეს MIT-ისა და ჰარვარდის Broad Institute-ში. სეკვენირების წაკითხვები შეესაბამებოდა A. gambiae-ს გენომს (PEST შტამი, ვერსია 4.12) HISAT2-ის (ვერსია 2.0.5) გამოყენებით ნაგულისხმევი პარამეტრებით. <30 რუკების ხარისხის (MAPQ) ქულების მქონე წაკითხვები ამოღებული იქნა Samtools-ის (ვერსია 1.3.1) გამოყენებით. გენებზე მიმაგრებული წაკითხვების რაოდენობა დაითვალა htseq-count-ის (ვერსია 0.9.1) გამოყენებით ნაგულისხმევი პარამეტრებით. ნორმალიზებული წაკითხვის რაოდენობა გამოითვალა და დიფერენციალური გენის ექსპრესია გაანალიზდა DESeq2 პაკეტის (ვერსია 1.28.1) გამოყენებით R-ში (ვერსია 4.0.3).
ეკდიზონის მოდიფიცირების გენის კანდიდატები იდენტიფიცირებულნი იყვნენ A. gambiae გენომის PSI-BLAST ალგორითმის (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) გამოყენებით, პარამეტრების ნაგულისხმევი მნიშვნელობების გამოყენებით შემდეგი საძიებო ცილის თანმიმდევრობით: Bombyx mori-დან (მიმაგრების ნომერი NP_001038956.1), Musca domestica-დან (მიმაგრების ნომერი XP_005182020.1, XP_005175332.1 და XP_011294434.1) და Microplitis demolitor-დან (მიმაგრების ნომერი XP_008552646.1 და XP_008552645.1) EcK B. mori-დან (მიმაგრების ნომერი NP_001036900), Drosophila melanogaster-დან (მიმაგრების ნომერი NP_651202), Apis-დან. mellifera (მიმაგრების № XP_394838) და Acyrthosiphon pisum (მიმაგრების № XP_001947166); და EPP B. mori-დან (მიმაგრების № XP_001947166) NP_001177919.1 და NP_001243996.1) და EP D. melanogaster-დან (მიმაგრების № NP_572986.1) (ნაბიჯი 1). შემდეგ, ფილტრის შედეგები დაფუძნებულია მაღალი mRNA ექსპრესიის (>100 ფრაგმენტი/კილობაზა ეგზონი მილიონზე, რომლებიც შედგენილია (FPKM) ან >85%) რეპროდუქციულ ქსოვილში (მდედრობითი LRT ან MAG) გამბიაში (ნაბიჯი 2). სპეციფიკურობის გასაუმჯობესებლად, ჩვენ შევარჩიეთ კანდიდატი ფერმენტები, რომლებიც ასევე ექსპრესირდება A. albimanus-ის რეპროდუქციულ ქსოვილში, ანოფელური სახეობისა, რომელიც არ სინთეზირებს ან არ გადასცემს ეკდიზონს შეჯვარების დროს. კანდიდატი გენები გაფილტრული იქნა A. albimanus-ის რეპროდუქციულ ქსოვილში დაბალი ექსპრესიის (<100 FPKM ან <85-ე პროცენტილი) საფუძველზე (ნაბიჯი 3). საბოლოო ფილტრის სახით (ნაბიჯი 4), კანდიდატი გენები უნდა აკმაყოფილებდნენ შემდეგიდან სულ მცირე ერთს: (1) მნიშვნელოვნად მომატებული აქტივაცია შეჯვარების შემდეგ (P < 0.05) დიფერენცირებულად ექსპრესირებული გენების ანალიზის მიხედვით და (2) არარეპროდუქციულ ქსოვილებში (< 85% ან <100 FPKM).
ჩვენ შევცვალეთ ადრე აღწერილი მეთოდები 28,29,30 მთელი ორგანიზმის იზოტოპური მარკირების მისაღწევად. მოკლედ, ველური ტიპის Saccharomyces cerevisiae ტიპი II (YSC2, Sigma) გამოსცადეს საფუარის აზოტის ფუძეზე (BD Difco, DF0335), რომელიც შეიცავდა (წონა/მოცულობა) 2% გლუკოზას (G7528, Sigma), 1.7% ამინომჟავებისგან თავისუფალ და ამონიუმის სულფატს (კულტურული გარემო) და 5% 15N ამონიუმის სულფატს (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories), როგორც აზოტის ერთადერთ წყაროს. საფუარი აღდგა ცენტრიფუგირებით და კოღოს ლარვები იკვებებოდა ad libitum-ით, სანამ ჭუპრად არ ჩამოყალიბდებოდა. მეოთხე ეტაპის სიკვდილიანობის თავიდან ასაცილებლად დაამატეთ თევზის ფქვილი (0.5 მგ 300 ლარვაზე). შემდეგ მხოლოდ მდედრები გამოიყენეს შეჯვარების ექსპერიმენტებში არამარკირებულ მამრებთან, რათა გაანალიზებულიყო შეჯვარების დროს გადატანილი მამრის პროტეომა.
4-6 დღის 15N-ით მონიშნული ქალწული დედლები იძულებით შეაწყვილეს ასაკის შესაბამის, არამონიშნულ ქალწულ მამრებთან. წარმატებული შეწყვილება დადასტურდა ეპიფლუორესცენტული მიკროსკოპით შეჯვარების საცობების აღმოჩენით. 3, 12 და 24 hpm-ზე, 45-55 შეწყვილებული დედლის წინაგულები დაიშალა 50 µლ ამონიუმის ბიკარბონატის ბუფერში (pH 7.8) და ჰომოგენიზირებული იქნა სასხლეტით. ჰომოგენიტი ცენტრიფუგირდა და ზედაპირული სითხე შეერია 50 µლ 0.1%-იან RapiGest-ს (186001860, Waters) 50 mM ამონიუმის ბიკარბონატში. თითოეული ნიმუშიდან მიღებული ზედაპირული სითხე და ნალექი მშრალ ყინულზე გაიყინა და ღამით გაიგზავნა ვაშინგტონის უნივერსიტეტის მაკკოსის ლაბორატორიაში, სადაც დასრულდა ნიმუშის მომზადება LC-MS/MS-ისთვის. ნალექი ხელახლა გააზავეთ 50 µლ 0.1%-იან RapiGest-ში 50 mM ამონიუმის ბიკარბონატში და დაამუშავეთ წყლის აბაზანაში სონიკაციით. ნალექისა და ზედაპირული მასის ცილის კონცენტრაცია გაიზომა BCA ანალიზით, ნიმუშები აღდგა 5 mM დითიოტრეიტოლით (DTT; Sigma), ალკილირდა 15 mM იოდოცეტამიდით (Sigma) და ინკუბირებული იქნა 37°C-ზე (1:0 50) 1 საათის განმავლობაში ტრიფსინიზაციით: ტრიფსინი:სუბსტრატის თანაფარდობით). RapiGest ლიზირებული იქნა 200 mM HCl-ის დამატებით, რასაც მოჰყვა ინკუბაცია 37°C-ზე 45 წუთის განმავლობაში და ცენტრიფუგირება 14,000 ბრ/წთ-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე ნარჩენების მოსაშორებლად. ნიმუშები გაირეცხა ორმაგი რეჟიმის მყარი ფაზის ექსტრაქციით (Oasis MCX კარტრიჯები, Waters) და ხელახლა შესუსტდა 0.1% ჭიანჭველმჟავაში 0.33 მკგ µl-1 საბოლოო ცილის კონცენტრაციისთვის. არამარკირებული MAG პროტეომები ანალოგიურად გაანალიზდა ქალწული მამრებისგან. თითოეული ნიმუშისთვის გაანალიზდა ორი ანალიტიკური რეპლიკატი. შემდეგ, გაანალიზდა თითოეულის 1 მკგ. 25 სმ-იანი შედუღებული სილიციუმის 75 მკმ სვეტის გამოყენებით 4 სმ-იანი შედუღებული სილიციუმის Kasil1 (PQ) ფრიტ-ხაფანგით, რომელიც შევსებულია Jupiter C12 უკუფაზური ფისით (Phenomenex) და 180-წუთიანი თხევადი ქრომატოგრაფია. ნიმუშის დაიჯესტები – MS/MS ჩატარდა Q-Exactive HF მას-სპექტრომეტრზე (Thermo Fisher) nanoACQUITY UPLC სისტემით (Waters). თითოეული გაშვებისთვის გენერირებული მონაცემებთან დაკავშირებული შეგროვების მონაცემები გადაყვანილი იქნა mzML ფორმატში Proteowizard-ის (ვერსია 3.0.20287) და Comet31-ის (ვერსია 3.2) გამოყენებით FASTA მონაცემთა ბაზასთან შედარებით, რომელიც შეიცავს Anopheles gambiae-ს (VectorBase ვერსია 54), Anopheles coluzzi-ს ცილის თანმიმდევრობებს. ძიება ჩატარდა Mali-NIH-ზე (VectorBase ვერსია 54), Saccharomyces cerevisiae-ზე (Uniprot, 2021 წლის მარტი), A. gambiae RNA-seq-ზე და ცნობილი ადამიანის დამაბინძურებლების სამფრეიმიან თარგმანებზე. პეპტიდური რუკის შესაბამისი FDR-ები განისაზღვრა Percolator32-ის (ვერსია 3.05) გამოყენებით 0.01 ზღურბლით და პეპტიდები შეიკრიბა ცილის იდენტიფიკაციებად Limelight33-ში (ვერსია 2.2.0). ცილის ფარდობითი სიმრავლე შეფასდა ნორმალიზებული სპექტრული სიმრავლის ფაქტორის (NSAF) გამოყენებით, რომელიც გამოითვლება თითოეული ცილისთვის თითოეულ ცდაში, როგორც ადრე იყო აღწერილი. თითოეულ ცილასთან მიმართებაში NSAF საშუალოდ გამოითვალა ორი განსხვავებული ბიოლოგიური რეპლიკაციის ნიმუშებში. 15N მარკირებამ წარმატებით შენიღბა მდედრი პროტეომი, თუმცა ეტიკეტირებული ქალწულებიდან მცირე რაოდენობით არაეტიკეტირებული ცილის აღმოჩენა შესაძლებელი გახდა. ჩვენ დავაფიქსირეთ მამრის ცილის შემცირების (1-5 სპექტრი) აღმოჩენა მდედრის ნედლ ნიმუშებში მხოლოდ ტექნიკურ ცდებში, სადაც ნედლი ნიმუშები გაიარა მამრის/შეჯვარების ნიმუშების შემდეგ, HPLC „გადატანის“ შედეგად. ეტიკეტირებული ქალწულებიდან „დამაბინძურებლებად“ აღმოჩენილი ცილები ჩამოთვლილია დამატებით ცხრილში 1.
Genscript-ში ორი ანტიგენური პეპტიდი, QTTDRVAPAPDQQQ (PA იზოტიპის ფარგლებში) და MESDGTTPSGDSEQ (PA და PB იზოტიპის ფარგლებში). ორი პეპტიდი გაერთიანდა, შემდეგ კონიუგირებული იქნა მატარებელ ცილა KLH-თან და შეიყვანეს ახალი ზელანდიის კურდღლებში. მეოთხე ინექციის შემდეგ კურდღლები დახოცეს და საერთო IgG იზოლირებული იქნა აფინური გაწმენდით. EPP-სპეციფიკური კურდღლის IgG გამოყენებული იქნა შემდგომი ვესტერნ ბლოტინგისთვის.
ვესტერნ ბლოტებისთვის, 4 დღის ქალწული მამრებისა და ქალწული ან იძულებით შეწყვილებული მდედრებისგან (<10 შეწყვილების შემდეგ) აღებული MAG (n = 10, სადაც n წარმოადგენს ბიოლოგიურად დამოუკიდებელი კოღოს ნიმუშების რაოდენობას) და მდედრი LRT (n = 30), ცალკე დაემატა ცილის ექსტრაქციის ბუფერი (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% ნატრიუმის დეოქსიქოლატი; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× პროტეაზას ინჰიბიტორის კოქტეილი (Roche)). ნიმუშები ჰომოგენიზებული იქნა დისექციისთანავე მძივებით (2 მმ მინის მძივები, 2,400 ბრ/წთ, 90 წმ). უხსნადი ნარჩენები ამოღებული იქნა ცენტრიფუგირებით 20,000 გ-ზე 4°C ტემპერატურაზე. ცილები რაოდენობრივად განისაზღვრა ბრედფორდის ანალიზით (Bio-Rad). შემდეგ, 20 მკგ MAG ცილა, 40 მკგ LRT ცილა და 20 მკგ ნარჩენი ნაყარი ცილა იქნა აღებული. დენატურირებული და გამოყოფილი 10%-იანი Bis-Tris NuPAGE-ით MOPS ბუფერის გამოყენებით. ცილები გადატანილი იქნა პოლივინილიდენფტორიდის მემბრანებში iBlot2 გადაცემის სისტემის (Thermo Fisher) გამოყენებით. მემბრანები ორჯერ გაირეცხა 1× PBS-T-ში (0.1% Tween-20 PBS-ში) და შემდეგ დაიბლოკა Odyssey-ის ბლოკირების ბუფერში (Li-Cor) 1 საათის განმავლობაში 22°C ტემპერატურაზე. მემბრანები შეირყა ღამით 4°C ტემპერატურაზე კურდღლის ანტი-EPP პოლიკლონური პირველადი ანტისხეულით (1:700 ბლოკირების ბუფერში) და ვირთხის ანტი-აქტინის მონოკლონური პირველადი ანტისხეულით MAC237 (Abeam; 1:4,000). მემბრანები გაირეცხა PBS-T-ით და შემდეგ ინკუბირებული იქნა მეორადი ანტისხეულებით (ვირის ანტი-კურდღლის 800CW და თხის ანტი-ვირთხის 680LT (Li-Cor), ორივე 1:20,000) ბლოკირების ბუფერში, რომელიც შეიცავდა 0.01% SDS-ს და 0.2% Tween-20-ს. 1 საათი 22°C ტემპერატურაზე. მემბრანები გაირეცხა PBS-T-ით და გადაიღეს Odyssey CLx სკანერით. სურათები შეგროვდა და დამუშავდა Image Studio-ში (ვერსია 5.2). EPP-RA იზოფორმის (82 kDa) შესაბამისი სპეციფიკური ზოლი არ აღმოჩნდა.
EPP-ის (როგორც იზოფორმა AGAP002463-RB, რომელიც შეიცავს ჰისტიდინ ფოსფატაზას დომენს, NCBI კონსერვირებული დომენის ძიება 34) და EcK2-ის (AGAP002181) კოდირების რეგიონები კლონირებული იქნა pET-21a(+) პლაზმიდში (Novagen Millipore Sigma); პრაიმერები ჩამოთვლილია გაფართოებულ მონაცემთა ცხრილში 2. რვა GS4 ლინკერი (ტანდემში) ჩასმული იყო pET-21a(+)-EcK2 კონსტრუქტის C-ტერმინალურ 6xHis ტეგამდე. რეკომბინანტული ცილები წარმოიქმნა NEBExpress-ის უჯრედგარე E. coli ცილის სინთეზის რეაქციის გამოყენებით (New England BioLabs). რეკომბინანტული ცილები გაიწმინდა NEBExpress Ni სპინური სვეტების გამოყენებით (New England BioLabs). დიჰიდროფოლატ რედუქტაზას (DHFR) საკონტროლო ცილა წარმოიქმნა NEBExpress-ის უჯრედგარე E. coli ცილის სინთეზის ნაკრებიდან დნმ-ის შაბლონის გამოყენებით. ცილები ინახებოდა 50%-იან გლიცეროლში PBS-ში -20°C ტემპერატურაზე 3 თვემდე.
EPP-სა და ქსოვილის ექსტრაქტების ფოსფატაზას აქტივობა გაიზომა 4-ნიტროფენილ ფოსფატის (pNPP; Sigma-Aldrich) გამოყენებით. რეაქციის ბუფერი შეიცავდა 25 mM Tris-ს, 50 mM ძმარმჟავას, 25 mM Bis-Tris-ს, 150 mM NaCl-ს, 0.1 mM EDTA-ს და 1 mM DTT-ს. ქსოვილი ჰომოგენიზებული იქნა რეაქციის ბუფერში და უჯრედის ნარჩენები მოიხსნა ცენტრიფუგირებით. რეაქცია დაიწყეთ ფერმენტის ან ქსოვილის ექსტრაქტის დამატებით რეაქციის ბუფერში, რომელიც შეიცავდა 2.5 მგ მლ-1 pNPP-ს. რეაქციის ნარევი ინკუბირებული იყო ოთახის ტემპერატურაზე, სიბნელეში და pNPP-დან გარდაქმნილი pNP-ის რაოდენობა განისაზღვრა 405 ნმ-ზე შთანთქმის გაზომვით სხვადასხვა დროს.
ინ ვიტრო EcK აქტივობისთვის, ცილა ინკუბირებული იქნა 0.2 მგ 20E-სთან ან 3D20E-სთან 200 µლ ბუფერში (pH 7.5), რომელიც შეიცავდა 10 mM HEPES–NaOH-ს, 0.1% BSA-ს, 2 mM ATP-ს და 10 mM MgCl2-ს 2 საათის განმავლობაში 27°C ტემპერატურაზე. რეაქცია შეჩერდა 800 µლ მეთანოლის დამატებით, შემდეგ გაცივდა -20°C-ზე 1 საათის განმავლობაში, შემდეგ ცენტრიფუგირდა 20,000 გ-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე. შემდეგ ზედა ფენა გაანალიზდა HPLC-MS/MS-ით. საკონტროლო ჯგუფში გამოყენებული ცილების თერმული ინაქტივაციისთვის, ცილები ინკუბირებული იქნა 50%-იან გლიცეროლში PBS-ში 20 წუთის განმავლობაში 95°C ტემპერატურაზე.
ინ ვიტრო EPP აქტივობისთვის, ცილა ინკუბირებული იყო 3D20E22P-თან (ექვივალენტურია HPLC-MS/MS-ით გაწმენდილი MAG-ის 18 წყვილში ნაპოვნი რაოდენობისა) 100 µლ ბუფერში (pH 7.5), რომელიც შეიცავდა 25 mM Tris-ს, 50 mM ძმარმჟავას, 25 mM Bis-Tris-ს, 150 mM NaCl-ს, 0.1 mM EDTA-ს და 1 mM DTT-ს 3 საათის განმავლობაში 27°C ტემპერატურაზე. რეაქცია შეჩერდა 400 µლ მეთანოლის დამატებით და გაცივდა -20°C-ზე 1 საათის განმავლობაში, შემდეგ ცენტრიფუგირდა 20,000 გ-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე. სუპერნატანტი გაანალიზდა HPLC-MS/MS-ით.
EPP-ს (362 bp), EcK1-ის (AGAP004574, 365 bp) და EcK2-ის (556 bp) PCR ფრაგმენტები ამპლიფიცირებული იქნა შერეული სქესის უთავო კოღოს გვამებიდან მომზადებული cDNA-დან. eGFP კონტროლის PCR ფრაგმენტი (495 bp) ამპლიფიცირებული იქნა ადრე აღწერილი pCR2.1-eGFP-დან; PCR პრაიმერები ჩამოთვლილია გაფართოებული მონაცემების მე-2 ცხრილში. PCR ფრაგმენტი ჩასმული იყო pL4440 პლაზმიდის ინვერსიულ T7 პრომოტორებს შორის. პლაზმიდური კონსტრუქტები აღდგენილი იქნა NEB 5-α კომპეტენტური E. coli-დან (New England Biolabs) და გამოყენებამდე ვერიფიცირებული იქნა დნმ-ის სეკვენირებით (ჩანართის თანმიმდევრობისთვის იხილეთ დამატებითი მონაცემები 1). pL4440-ზე დაფუძნებული პლაზმიდიდან ჩანართის ამპლიფიკაციისთვის გამოყენებული იქნა T7 პრომოუტერთან შესაბამისი პრაიმერები (გაფართოებული მონაცემების ცხრილი 2). PCR პროდუქტის ზომა დადასტურდა აგაროზის გელში ელექტროფორეზით. dsRNA ტრანსკრიფცირებული იქნა PCR შაბლონებიდან Megascript T7 ტრანსკრიფციის ნაკრების (Thermo Fisher) გამოყენებით და გაწმენდილი იქნა მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად, ადრე აღწერილი მოდიფიკაციებით.
dsRNA ინექციისთვის, ზრდასრული მამრების ან მდედრების (Nanoject III, Drummond) გულმკერდში ეკლოზიიდან 1 დღის განმავლობაში შეიყვანეს 1380 ნგ dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) 10 ნგ nl-1 კონცენტრაციით. გენის ნოკდაუნის დონეები განისაზღვრა სულ მცირე სამ ბიოლოგიურ რეპლიკატში რნმ ექსტრაქციით, cDNA სინთეზით და RT-qPCR-ით. ეკდიზონის ინექციისთვის, 4 დღის ან 6 დღის სისხლით კვებავ ქალწულ მდედრებს შეიყვანეს 0.13, 0.21 ან 0.63 მკგ 20E ან 3D20E (Nanoject III, Drummond) შესაბამისად 1.3, 2.1 კონცენტრაციით, ექსპერიმენტული დიზაინის მიხედვით, ან 6.3 ნგ nl-1. შეიყვანეს 100 ნლ 10%-იანი (მოცულობითი/მოცულობით) ეთანოლი წყალში; 100 ნლ 3D20E22P 10%-იან ეთანოლში (რაც MAG-ების წყვილში არსებული რაოდენობის 75%-ის ექვივალენტურია). კოღოები შემთხვევითობის პრინციპით განაწილდნენ ინექციის ჯგუფში.
ქვირითობის ანალიზებისთვის, 3 დღის დედლებს ადამიანის სისხლით კვებავდნენ ad libitum. მოაშორეთ ნაწილობრივ გამოკვებილი ან გამოუკვებილი კოღოები. დამუშავების მიხედვით, დედლები სისხლის მიღებიდან მინიმუმ 48 საათის განმავლობაში ოთხი ღამის განმავლობაში ცალკე ქვირითობის ჭიქებში მოათავსეს. კვერცხები სტერეოსკოპით (Stemi 508, Zeiss) დაითვალა; შეწყვილებული დედლების შემთხვევაში, კვერცხებიდან ლარვები გამოჩეკილი კვერცხები ნაყოფიერად ითვლებოდა.
შეჯვარების ცდებისთვის, მდედრებს შეჯვარებისადმი რეზისტენტობის განვითარებისთვის დამუშავების მიხედვით, მინიმუმ 2 დღე მიეცათ, ხოლო ველური ტიპის ასაკის შესაბამისი მამრები შემდგომში იმავე გალიაში შეიყვანეს. ორი ღამის შემდეგ, განაყოფიერებული მდედრი ვეზიკულები დაშალეს და გენომური დნმ გამოიყო გაყინვა-დათბობის და ულტრაბგერითი დამუშავების გზით ბუფერში, რომელიც შეიცავდა 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA და 25 mM NaCl (pH 8.2). ნიმუშები ინკუბირებული იქნა პროტეინაზა K-სთან (0.86 μg µl-1) 15 წუთის განმავლობაში 55°C ტემპერატურაზე, შემდეგ კი 10 წუთის განმავლობაში 95°C ტემპერატურაზე. ნედლი გენომური დნმ-ის პრეპარატები განზავდა 10-ჯერ და დაექვემდებარა Y ქრომოსომის თანმიმდევრობების qPCR დეტექციას; პრაიმერები ჩამოთვლილია გაფართოებულ მონაცემთა ცხრილში 2. Y ქრომოსომის თანმიმდევრობის არარსებობა მიუთითებს შეჯვარების არარსებობაზე.
ხელახალი შეჯვარების ანალიზებისთვის, ძალით შეჯვარებული დედლები გამოიკვლიეს შეჯვარების საცობების არსებობაზე შეჯვარების სტატუსის დასადასტურებლად და 2 დღე დაელოდათ მამრების არარსებობის შემთხვევაში შეჯვარებისადმი რეზისტენტობის განვითარებისთვის, როგორც ადრე იყო აღწერილი36. შემდეგ DsRed ტრანსგენური სპერმის მატარებელი მამრები შეიყვანეს დედლების გალიებში. ორი ღამის შემდეგ, განაყოფიერებული ვეზიკულები დედლებისგან ამოკვეთეს და გენომური დნმ მომზადდა ზემოთ აღწერილი მეთოდით და დაექვემდებარა DsRed ტრანსგენის qPCR დეტექციას; პრაიმერები ჩამოთვლილია გაფართოებულ მონაცემთა ცხრილში 2. DsRed ტრანსგენის არარსებობა მიუთითებდა, რომ ხელახალი შეჯვარება არ მომხდარა.
3D20E სინთეზირებული იქნა ადრე აღწერილი მეთოდით 37. მოკლედ, 10 მგ 20E (Sigma-Aldrich) გახსნეს 10 მლ წყალში, რასაც მოჰყვა 30 მგ პლატინის შავი (ფხვნილის სახით, Sigma-Aldrich). რეაქციის ნარევში განუწყვეტლივ შეჰყავდათ O2-ის ნაზი ნაკადი, რომელიც ოთახის ტემპერატურაზე ურიეს. 6 საათის შემდეგ, რეაქციის შესაჩერებლად დაემატა 30 მლ მეთანოლი. ნარევი დაცენტრიფუგირებული იყო კატალიზატორის ნაწილაკების მოსაშორებლად. ზედა ფენა აორთქლდა გაშრობამდე ვაკუუმში ოთახის ტემპერატურაზე. გამხმარი რეაქციის პროდუქტი გახსნეს 10%-იან ეთანოლსა და მეთანოლში HPLC-MS/MS ანალიზისთვის ინექციისთვის. გარდაქმნის სიჩქარე (20E-დან 3D20E-მდე) დაახლოებით 97% იყო (სურ. 4b) და სინთეზირებული 3D20E-ს MS სპექტრი ემთხვეოდა შეწყვილებულ მდედრებში არსებულ სპექტრს (სურ. 4c).
ლეგენდა შეიცავს ჩატარებული სტატისტიკური ტესტების კონკრეტულ დეტალებს. GraphPad (ვერსია 9.0) გამოყენებული იქნა ფიშერის ზუსტი ტესტის, მანტელ-კოქსის ტესტის და სტუდენტის t-ტესტის შესასრულებლად. კოხრან-მანტელ-ჰენცელის ტესტები ჩატარდა მორგებული R სკრიპტის გამოყენებით (ხელმისაწვდომია https://github.com/duopeng/mantelhaen.test-ზე). მონაცემთა განაწილება შემოწმდა ნორმალურობაზე შაპირო-ვილკის ტესტის გამოყენებით 0.05 მნიშვნელობის ზღურბლით. როდესაც მონაცემები ვერ გაიარა ნორმალურობის ტესტი, ჩატარდა მან-უიტნის ტესტი. გადარჩენის მონაცემები გაანალიზდა მანტელ-კოქსის ტესტის გამოყენებით. DESeq2 პაკეტი (ვერსია 1.28.1) გამოყენებული იქნა RNA-seq გენის დონის დიფერენციალური ექსპრესიის ანალიზის შესასრულებლად. გრაფიკზე ჰორიზონტალური ზოლი წარმოადგენს მედიანას. ყველა ტესტისთვის ზღურბლად გამოყენებული იქნა P = 0.05 მნიშვნელობის მნიშვნელობა.
კვლევის დიზაინის შესახებ დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ Nature Research Report-ის რეზიუმე, რომელიც ამ სტატიასთან არის დაკავშირებული.
MS პროტეომიკური მონაცემები PRIDE პარტნიორული რეპოზიტორიის (https://www.ebi.ac.uk/pride/) მეშვეობით ProteomeXchange კონსორციუმში (http://proteomecentral.proteomexchange.org) იქნა შენახული მონაცემთა ნაკრების იდენტიფიკატორით PXD032157.
RNA-seq მონაცემთა ნაკრები განთავსებულია გენების ექსპრესიის ყოვლისმომცველ ბიბლიოთეკაში (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) სერიული ჩანაწერის GSE198665 ქვეშ.
მიმდინარე კვლევის დროს გენერირებული და/ან გაანალიზებული დამატებითი მონაცემთა ნაკრებების მიღება შესაძლებელია შესაბამისი ავტორებისგან გონივრული მოთხოვნის შემთხვევაში. ეს სტატია წარმოადგენს საწყის მონაცემებს.
დე ლუფი, ა. ეკდისტეროიდები: მწერების სქესობრივი სტეროიდების უგულებელყოფა? მამრობითი: შავი ყუთი. მწერების მეცნიერება. 13, 325–338 (2006).
რედფერნი, CPF 20-ჰიდროქსიეკდიზონი და საკვერცხეების განვითარება Anopheles stephens-ში. J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).