იმუნომოდულატორული მეტაბოლიტები სიმსივნის მიკროგარემოს (TME) ძირითადი მახასიათებელია, თუმცა რამდენიმე გამონაკლისის გარდა, მათი ვინაობა დიდწილად უცნობია. აქ ჩვენ გავაანალიზეთ სიმსივნეები და T უჯრედები მაღალი ხარისხის სეროზული კარცინომის (HGSC) მქონე პაციენტების სიმსივნეებიდან და ასციტებიდან, რათა გამოგვევლინა ამ სხვადასხვა TME კომპარტმენტების მეტაბოლომი. ასციტს და სიმსივნურ უჯრედებს აქვთ მეტაბოლიტების მნიშვნელოვანი განსხვავებები. ასციტთან შედარებით, სიმსივნეში ინფილტრირებული T უჯრედები მნიშვნელოვნად გამდიდრებულია 1-მეთილნიკოტინამიდით (MNA). მიუხედავად იმისა, რომ T უჯრედებში MNA-ს დონე მომატებულია, ნიკოტინამიდ N-მეთილტრანსფერაზას (ფერმენტი, რომელიც აკატალიზებს მეთილის ჯგუფების S-ადენოზილმეთიონინიდან ნიკოტინამიდში გადაცემას) ექსპრესია შემოიფარგლება ფიბრობლასტებით და სიმსივნური უჯრედებით. ფუნქციურად, MNA იწვევს T უჯრედების მიერ სიმსივნის ხელშემწყობი ციტოკინის, სიმსივნის ნეკროზის ფაქტორ ალფას, გამოყოფას. ამიტომ, TME-სგან მიღებული MNA ხელს უწყობს T უჯრედების იმუნურ რეგულაციას და წარმოადგენს პოტენციურ იმუნოთერაპიის სამიზნეს ადამიანის კიბოს სამკურნალოდ.
სიმსივნისგან მიღებულ მეტაბოლიტებს შეიძლება ჰქონდეთ სიმსივნის საწინააღმდეგო იმუნიტეტზე ღრმა დამთრგუნველი ეფექტი და სულ უფრო მეტი მტკიცებულება აჩვენებს, რომ მათ ასევე შეუძლიათ დაავადების პროგრესირების მთავარი მამოძრავებელი ძალის როლის შესრულება (1). ვარბურგის ეფექტის გარდა, ბოლო დროს დაიწყო მუშაობა სიმსივნური უჯრედების მეტაბოლური მდგომარეობისა და მისი სიმსივნის მიკროგარემოს იმუნურ მდგომარეობასთან (TME) მისი კავშირის დასახასიათებლად. თაგვის მოდელებსა და ადამიანის T უჯრედებზე ჩატარებულმა კვლევებმა აჩვენა, რომ გლუტამინის მეტაბოლიზმს (2), ჟანგვით მეტაბოლიზმს (3) და გლუკოზის მეტაბოლიზმს (4) შეუძლიათ დამოუკიდებლად იმოქმედონ იმუნური უჯრედების სხვადასხვა ქვეჯგუფზე. ამ გზებში რამდენიმე მეტაბოლიტი აფერხებს T უჯრედების სიმსივნის საწინააღმდეგო ფუნქციას. დადასტურებულია, რომ კოენზიმ ტეტრაჰიდრობიოპტერინის (BH4) ბლოკადამ შეიძლება დააზიანოს T უჯრედების პროლიფერაცია, ხოლო ორგანიზმში BH4-ის გაზრდამ შეიძლება გააძლიეროს სიმსივნის საწინააღმდეგო იმუნური პასუხი, რომელსაც შუამავლობს CD4 და CD8. გარდა ამისა, კინურენინის იმუნოსუპრესიული ეფექტის შემსუბუქება შესაძლებელია BH4-ის მიღებით (5). იზოციტატ დეჰიდროგენაზას (IDH) მუტანტურ გლიობლასტომაში, ენანტიომეტაბოლური (R)-2-ჰიდროქსიგლუტარატის (R-2-HG) სეკრეცია აფერხებს T უჯრედების აქტივაციას, პროლიფერაციას და ციტოლიზის აქტივობას (6). ბოლო დროს ნაჩვენებია, რომ გლიკოლიზის თანმდევი პროდუქტი, მეთილგლიოქსალი, წარმოიქმნება მიელოიდური წარმოშობის სუპრესორული უჯრედების მიერ და მეთილგლიოქსალის T უჯრედებში გადაცემამ შეიძლება დათრგუნოს ეფექტორული T უჯრედების ფუნქცია. მკურნალობის დროს, მეთილგლიოქსალის ნეიტრალიზაციას შეუძლია დაძლიოს მიელოიდური წარმოშობის სუპრესორული უჯრედების (MDSC) აქტივობა და სინერგიულად გააძლიეროს საკონტროლო პუნქტების ბლოკადის თერაპია თაგვის მოდელებში (7). ეს კვლევები ერთობლივად ხაზს უსვამს TME-სგან მიღებული მეტაბოლიტების მთავარ როლს T უჯრედების ფუნქციისა და აქტივობის რეგულირებაში.
T უჯრედების დისფუნქცია ფართოდ არის აღწერილი საკვერცხის კიბოს დროს (8). ეს ნაწილობრივ განპირობებულია ჰიპოქსიისა და სიმსივნის სისხლძარღვოვანი სისტემის პათოლოგიური მეტაბოლური მახასიათებლებით (9), რაც იწვევს გლუკოზისა და ტრიპტოფანის ისეთ თანმდევ პროდუქტებად გარდაქმნას, როგორიცაა რძემჟავა და კინურენინი. უჯრედგარე ლაქტატის ჭარბი რაოდენობა ამცირებს ინტერფერონ-γ-ს (IFN-γ) გამომუშავებას და ხელს უწყობს მიელოსუპრესიული ქვეჯგუფების დიფერენციაციას (10, 11). ტრიპტოფანის მოხმარება პირდაპირ აფერხებს T უჯრედების პროლიფერაციას და აფერხებს T უჯრედების რეცეპტორების სიგნალიზაციას (12-14). ამ დაკვირვებების მიუხედავად, იმუნური მეტაბოლიზმის გარშემო დიდი სამუშაო ჩატარდა in vitro T უჯრედების კულტურაში ოპტიმიზებული მედიის გამოყენებით, ან შემოიფარგლა ჰომოლოგიური თაგვის მოდელებით in vivo, რომელთაგან არცერთი სრულად არ ასახავს ადამიანის კიბოს ჰეტეროგენულობას და ფიზიოლოგიურ მაკრო და მიკრო გარემოს.
საკვერცხის კიბოს საერთო მახასიათებელია პერიტონეალური გავრცელება და ასციტის გაჩენა. ასციტში უჯრედული სითხის დაგროვება ასოცირდება დაავადების შორსწასულ სტადიასთან და ცუდ პროგნოზთან (15). ცნობების თანახმად, ეს უნიკალური კომპარტმენტი ჰიპოქსიურია, აქვს სისხლძარღვთა ენდოთელური ზრდის ფაქტორის (VEGF) და ინდოლამინ 2,3-დიოქსიგენაზას (IDO) მაღალი დონე და ინფილტრირებულია T მარეგულირებელი უჯრედებით და მიელოიდური ინჰიბიტორული უჯრედებით (15-18). ასციტის მეტაბოლური გარემო შეიძლება განსხვავდებოდეს თავად სიმსივნისგან, ამიტომ T უჯრედების რეპროგრამირება პერიტონეალურ სივრცეში გაურკვეველია. გარდა ამისა, ასციტსა და სიმსივნის გარემოში არსებულ მეტაბოლიტებს შორის ძირითადი განსხვავებები და ჰეტეროგენულობა შეიძლება ხელს უშლიდეს იმუნური უჯრედების ინფილტრაციას და მათ ფუნქციას სიმსივნეებზე და საჭიროა შემდგომი კვლევა.
ამ პრობლემების გადასაჭრელად, ჩვენ შევიმუშავეთ მგრძნობიარე უჯრედების გამოყოფისა და თხევადი ქრომატოგრაფიის ტანდემური მას-სპექტრომეტრიის (LC-MS/MS) მეთოდი, რათა შესწავლილიყო სხვადასხვა ტიპის უჯრედები (მათ შორის CD4 + და CD8 + T უჯრედები), ასევე სიმსივნეებში და სიმსივნეებს შორის. მისი მეტაბოლიტები მოიცავს უჯრედებს პაციენტის იმავე ასციტისა და სიმსივნური გარემოს უჯრედებში. ჩვენ ვიყენებთ ამ მეთოდს მაღალგანზომილებიან ნაკადურ ციტომეტრიასთან და ერთუჯრედიან RNA სეკვენირებასთან (scRNA-seq) ერთად, რათა მოგაწოდოთ ამ ძირითადი პოპულაციების მეტაბოლური სტატუსის მაღალი გარჩევადობის პორტრეტი. ამ მეთოდმა გამოავლინა 1-მეთილნიკოტინამიდის (MNA) დონის მნიშვნელოვანი ზრდა სიმსივნურ T უჯრედებში, ხოლო in vitro ექსპერიმენტებმა აჩვენა, რომ MNA-ს იმუნომოდულატორული ეფექტი T უჯრედების ფუნქციაზე აქამდე უცნობი იყო. ზოგადად, ეს მეთოდი ავლენს სიმსივნეებსა და იმუნურ უჯრედებს შორის ურთიერთმეტაბოლურ ურთიერთქმედებებს და იძლევა უნიკალურ ინფორმაციას იმუნური რეგულირების მეტაბოლიტების შესახებ, რაც შეიძლება სასარგებლო იყოს T უჯრედებზე დაფუძნებული საკვერცხის კიბოს იმუნოთერაპიის სამკურნალოდ. მკურნალობის შესაძლებლობები.
ჩვენ გამოვიყენეთ მაღალგანზომილებიანი ნაკადური ციტომეტრია გლუკოზის შთანთქმის [2-(N-(7-ნიტროფენილ-2-ოქსა-1,3-დიაზა-4-ილ)ამინო)-2-დეოქსიგლუკოზა (2-NBDG) და მიტოქონდრიული აქტივობის [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ერთდროულად რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის, რომლებიც ერთმანეთის გვერდიგვერდ ტიპური მარკერებია, რომლებიც განასხვავებენ იმუნურ უჯრედებსა და სიმსივნურ უჯრედების პოპულაციებს (ცხრილი S2 და სურათი S1A). ამ ანალიზმა აჩვენა, რომ T უჯრედებთან შედარებით, ასციტს და სიმსივნურ უჯრედებს აქვთ გლუკოზის შთანთქმის უფრო მაღალი დონე, მაგრამ მიტოქონდრიულ აქტივობაში უფრო მცირე განსხვავებები აქვთ. სიმსივნური უჯრედების მიერ გლუკოზის საშუალო შთანთქმა [CD45-EpCAM (EpCAM)+] სამიდან ოთხჯერ მეტია T უჯრედების მიერ, ხოლო CD4 + T უჯრედების მიერ გლუკოზის საშუალო შთანთქმა 1.2-ჯერ მეტია CD8 + T უჯრედების მიერ, რაც მიუთითებს, რომ სიმსივნის ინფილტრაციულ ლიმფოციტებს (TIL) განსხვავებული მეტაბოლური მოთხოვნილებები აქვთ ერთი და იგივე TME-შიც კი (სურათი 1A). ამის საპირისპიროდ, სიმსივნურ უჯრედებში მიტოქონდრიული აქტივობა CD4 + T უჯრედების მსგავსია და ორივე ტიპის უჯრედის მიტოქონდრიული აქტივობა უფრო მაღალია, ვიდრე CD8 + T უჯრედების (სურათი 1B). ზოგადად, ეს შედეგები ავლენს მეტაბოლურ დონეს. სიმსივნური უჯრედების მეტაბოლური აქტივობა უფრო მაღალია, ვიდრე CD4 + T უჯრედების, ხოლო CD4 + T უჯრედების მეტაბოლური აქტივობა უფრო მაღალია, ვიდრე CD8 + T უჯრედების. უჯრედების ტიპებს შორის ამ ეფექტების მიუხედავად, არ არსებობს თანმიმდევრული განსხვავება CD4 + და CD8 + T უჯრედების მეტაბოლურ სტატუსში ან მათ ფარდობით პროპორციებში ასციტში სიმსივნეებთან შედარებით (სურათი 1C). ამის საპირისპიროდ, CD45-უჯრედების ფრაქციაში, სიმსივნეში EpCAM+ უჯრედების პროპორცია გაიზარდა ასციტთან შედარებით (სურათი 1D). ჩვენ ასევე დავაკვირდით აშკარა მეტაბოლურ განსხვავებას EpCAM+ და EpCAM- უჯრედების კომპონენტებს შორის. EpCAM+ (სიმსივნური) უჯრედებს აქვთ უფრო მაღალი გლუკოზის შთანთქმა და მიტოქონდრიული აქტივობა, ვიდრე EpCAM- უჯრედებს, რაც გაცილებით მაღალია, ვიდრე ფიბრობლასტების მეტაბოლური აქტივობა სიმსივნურ უჯრედებში TME-ში (სურათი 1, E და F).
(A და B) გლუკოზის შთანთქმის საშუალო ფლუორესცენციის ინტენსივობა (MFI) (2-NBDG) (A) და CD4 + T უჯრედების მიტოქონდრიული აქტივობა (MitoTracker მუქი წითელი) (B) წარმომადგენლობითი გრაფიკები (მარცხნივ) და ცხრილური მონაცემები (მარჯვნივ), CD8 + T უჯრედები და EpCAM + CD45-სიმსივნური უჯრედები ასციტიდან და სიმსივნიდან. (C) CD4 + და CD8 + უჯრედების (CD3 + T უჯრედების) თანაფარდობა ასციტსა და სიმსივნეში. (D) EpCAM + სიმსივნური უჯრედების პროპორცია ასციტსა და სიმსივნეში (CD45−). (E და F) EpCAM + CD45-სიმსივნური და EpCAM-CD45-მატრიცული გლუკოზის შთანთქმა (2-NBDG) (E) და მიტოქონდრიული აქტივობა (MitoTracker მუქი წითელი) (F) წარმომადგენლობითი გრაფიკები (მარცხნივ) და ცხრილური მონაცემები (მარჯვნივ) ასციტები და სიმსივნური უჯრედები. (G) CD25, CD137 და PD1 ექსპრესიის წარმომადგენლობითი გრაფიკები ნაკადური ციტომეტრიით. (H და I) CD25, CD137 და PD1 ექსპრესია CD4 + T უჯრედებზე (H) და CD8 + T უჯრედებზე (I). (J და K) ნაივური, ცენტრალური მეხსიერების (Tcm), ეფექტორული (Teff) და ეფექტორული მეხსიერების (Tem) ფენოტიპები CCR7 და CD45RO ექსპრესიის საფუძველზე. CD4 + T უჯრედების (J) და CD8 + T უჯრედების (K) წარმომადგენლობითი სურათები (მარცხნივ) და ცხრილური მონაცემები (მარჯვნივ) ასციტებსა და სიმსივნეებში. P მნიშვნელობები განისაზღვრება დაწყვილებული t-ტესტით (*P<0.05, **P<0.01 და ***P<0.001). ხაზი წარმოადგენს შესაბამის პაციენტებს (n = 6). FMO, ფლუორესცენცია მინუს ერთი; MFI, ფლუორესცენციის საშუალო ინტენსივობა.
შემდგომმა ანალიზმა გამოავლინა სხვა მნიშვნელოვანი განსხვავებები მაღალი გარჩევადობის მქონე T უჯრედების ფენოტიპურ სტატუსს შორის. სიმსივნეებში გააქტიურებული (სურათი 1, G-დან I-მდე) და ეფექტორული მეხსიერება (სურათი 1, J და K) გაცილებით ხშირია, ვიდრე ასციტი (CD3 + T უჯრედების პროპორცია). ანალოგიურად, ფენოტიპის ანალიზმა აქტივაციის მარკერების (CD25 და CD137) და დაქვეითების მარკერების [პროგრამირებული უჯრედული სიკვდილის ცილა 1 (PD1)] ექსპრესიით აჩვენა, რომ მიუხედავად იმისა, რომ ამ პოპულაციების მეტაბოლური მახასიათებლები განსხვავებულია (სურათი S1, B-დან E-მდე), მნიშვნელოვანი მეტაბოლური განსხვავებები არ დაფიქსირებულა ნაივურ, ეფექტორულ ან მეხსიერების ქვეჯგუფებს შორის (სურათი S1, F-დან I-მდე). ეს შედეგები დადასტურდა მანქანური სწავლების მეთოდების გამოყენებით უჯრედების ფენოტიპების ავტომატურად მინიჭებისთვის (21), რამაც კიდევ უფრო გამოავლინა ძვლის ტვინის უჯრედების დიდი რაოდენობის (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) არსებობა პაციენტის ასციტში (სურათი S2A). ყველა იდენტიფიცირებულ უჯრედულ ტიპს შორის, მიელოიდური უჯრედების ამ პოპულაციამ აჩვენა გლუკოზის ყველაზე მაღალი შთანთქმა და მიტოქონდრიული აქტივობა (სურათი S2, B-დან G-მდე). ეს შედეგები ხაზს უსვამს ძლიერ მეტაბოლურ განსხვავებებს HGSC პაციენტებში ასციტისა და სიმსივნეების დროს აღმოჩენილ მრავალ უჯრედულ ტიპს შორის.
TIL-ის მეტაბონომიური მახასიათებლების გაგების მთავარი გამოწვევა სიმსივნეებიდან საკმარისი სისუფთავის, ხარისხისა და რაოდენობის T უჯრედების ნიმუშების იზოლირების აუცილებლობაა. ბოლოდროინდელმა კვლევებმა აჩვენა, რომ ნაკადურ ციტომეტრიაზე დაფუძნებულმა დახარისხებისა და მძივებით გამდიდრების მეთოდებმა შეიძლება გამოიწვიოს უჯრედული მეტაბოლიტების პროფილების ცვლილებები (22-24). ამ პრობლემის გადასაჭრელად, ჩვენ ოპტიმიზაცია გავუკეთეთ მძივებით გამდიდრების მეთოდს, რათა გამოვყოთ და გამოვყოთ TIL ქირურგიული გზით რეზექცირებული ადამიანის საკვერცხის კიბოდან LC-MS/MS-ით ანალიზამდე (იხ. მასალები და მეთოდები; სურათი 2A). ამ პროტოკოლის მეტაბოლიტების ცვლილებებზე საერთო გავლენის შესაფასებლად, ჩვენ შევადარეთ ჯანმრთელი დონორების მიერ ზემოთ აღნიშნული მძივების გამოყოფის ეტაპის შემდეგ გააქტიურებული T უჯრედების მეტაბოლიტების პროფილები იმ უჯრედებთან, რომლებიც არ იყო გამოყოფილი მძივებით, მაგრამ ყინულზე დარჩნენ. ამ ხარისხის კონტროლის ანალიზმა აჩვენა, რომ ამ ორ პირობას შორის არსებობს მაღალი კორელაცია (r = 0.77) და 86 მეტაბოლიტის ჯგუფის ტექნიკური განმეორებადობა მაღალი განმეორებადობით ხასიათდება (სურათი 2B). ამრიგად, ამ მეთოდებით შესაძლებელია მეტაბოლიტების ზუსტი ანალიზის ჩატარება უჯრედებში, რომლებიც გამდიდრების პროცესში არიან, რითაც იქმნება პირველი მაღალი გარჩევადობის პლატფორმა HGSC-ში სპეციფიკური მეტაბოლიტების იდენტიფიცირებისთვის, რაც ადამიანებს საშუალებას აძლევს, უფრო ღრმად გაიგონ უჯრედის სპეციფიკურობის სექსუალური მეტაბოლიზმის პროგრამა.
(A) მაგნიტური მძივებით გამდიდრების სქემატური დიაგრამა. LC-MS/MS-ით ანალიზამდე, უჯრედები გაივლიან მაგნიტური მძივებით გამდიდრების სამ ზედიზედ რაუნდს ან დარჩებიან ყინულზე. (B) გამდიდრების ტიპის გავლენა მეტაბოლიტების სიმრავლეზე. თითოეული გამდიდრების ტიპის ± SE-სთვის სამი გაზომვის საშუალო. ნაცრისფერი ხაზი წარმოადგენს 1:1 ურთიერთობას. განმეორებითი გაზომვების კლასშიდა კორელაცია (ICC) ნაჩვენებია ღერძის ეტიკეტზე. NAD, ნიკოტინამიდ ადენინ დინუკლეოტიდი. (C) პაციენტის მეტაბოლიტების ანალიზის სამუშაო პროცესის სქემატური დიაგრამა. ასციტები ან სიმსივნეები გროვდება პაციენტებისგან და კრიოკონსერვირებულია. თითოეული ნიმუშის მცირე ნაწილი გაანალიზდა ნაკადური ციტომეტრიით, ხოლო დანარჩენ ნიმუშებს ჩაუტარდათ გამდიდრების სამი რაუნდი CD4+, CD8+ და CD45- უჯრედებისთვის. ეს უჯრედული ფრაქციები გაანალიზდა LC-MS/MS-ის გამოყენებით. (D) სტანდარტიზებული მეტაბოლიტების სიმრავლის სითბური რუკა. დენდროგრამა წარმოადგენს ნიმუშებს შორის ევკლიდური მანძილების უორდის კლასტერიზაციას. (E) ნიმუშის მეტაბოლიტების რუკის მთავარი კომპონენტების ანალიზი (PCA), რომელიც აჩვენებს თითოეული ნიმუშის სამ რეპლიკას, ერთი და იგივე პაციენტის ნიმუშები დაკავშირებულია ხაზით. (F) პაციენტზე დამოკიდებული ნიმუშის მეტაბოლიტების პროფილის PCA (ანუ ნაწილობრივი რედუნდანტობის გამოყენებით); ნიმუშის ტიპი შემოიფარგლება ამოზნექილი კორპუსით. PC1, მთავარი კომპონენტი 1; PC2, მთავარი კომპონენტი 2.
შემდეგ, ჩვენ გამოვიყენეთ გამდიდრების ეს მეთოდი, რათა გაანალიზებულიყო 99 მეტაბოლიტი CD4 +, CD8 + და CD45-უჯრედული ფრაქციებიდან ექვსი HGSC პაციენტის პირველად ასციტებსა და სიმსივნეებში (სურათი 2C, სურათი S3A და ცხრილი S3 და S4). საინტერესო პოპულაცია ცოცხალი უჯრედების საწყისი დიდი ნიმუშის 2%-დან 70%-მდე შეადგენს და უჯრედების პროპორცია მნიშვნელოვნად განსხვავდება პაციენტებს შორის. მძივების გამოყოფის შემდეგ, საინტერესო გამდიდრებული ფრაქცია (CD4+, CD8+ ან CD45-) საშუალოდ ნიმუშში არსებული ყველა ცოცხალი უჯრედის 85%-ზე მეტს შეადგენს. გამდიდრების ეს მეთოდი საშუალებას გვაძლევს გავაანალიზოთ უჯრედების პოპულაციები ადამიანის სიმსივნური ქსოვილის მეტაბოლიზმიდან, რაც შეუძლებელია დიდი ნიმუშებიდან. ამ პროტოკოლის გამოყენებით, ჩვენ დავადგინეთ, რომ l-კინურენინი და ადენოზინი, ეს ორი კარგად დახასიათებული იმუნოსუპრესიული მეტაბოლიტი, მომატებული იყო სიმსივნურ T უჯრედებში ან სიმსივნურ უჯრედებში (სურათი S3, B და C). ამრიგად, ეს შედეგები აჩვენებს ჩვენი უჯრედების გამოყოფისა და მას-სპექტრომეტრიის ტექნოლოგიის სიზუსტეს და უნარს, აღმოაჩინოს ბიოლოგიურად მნიშვნელოვანი მეტაბოლიტები პაციენტის ქსოვილებში.
ჩვენმა ანალიზმა ასევე გამოავლინა უჯრედების ტიპების ძლიერი მეტაბოლური გამიჯვნა პაციენტებში და მათ შორის (სურათი 2D და სურათი S4A). კერძოდ, სხვა პაციენტებთან შედარებით, პაციენტ 70-ს აღენიშნებოდა განსხვავებული მეტაბოლური მახასიათებლები (სურათი 2E და სურათი S4B), რაც მიუთითებს პაციენტებს შორის მნიშვნელოვანი მეტაბოლური ჰეტეროგენულობის არსებობაზე. აღსანიშნავია, რომ სხვა პაციენტებთან შედარებით (1.2-დან 2 ლიტრამდე; ცხრილი S1), პაციენტ 70-ში შეგროვებული ასციტის საერთო რაოდენობა (80 მლ) უფრო მცირე იყო. ძირითადი კომპონენტების ანალიზის დროს (მაგალითად, ნაწილობრივი რედუნდანტობის ანალიზის გამოყენებით) პაციენტებს შორის ჰეტეროგენულობის კონტროლი აჩვენებს უჯრედების ტიპებს შორის თანმიმდევრულ ცვლილებებს და უჯრედების ტიპები და/ან მიკროგარემოს მკაფიოდ აგრეგირებულია მეტაბოლიტების პროფილის მიხედვით (სურათი 2F). ცალკეული მეტაბოლიტების ანალიზმა ხაზი გაუსვა ამ ეფექტებს და გამოავლინა მნიშვნელოვანი განსხვავებები უჯრედების ტიპებსა და მიკროგარემოს შორის. აღსანიშნავია, რომ ყველაზე ექსტრემალური განსხვავებაა MNA, რომელიც ჩვეულებრივ გამდიდრებულია CD45- უჯრედებით და CD4+ და CD8+ უჯრედებით, რომლებიც ინფილტრირდებიან სიმსივნეში (სურათი 3A). CD4 + უჯრედების შემთხვევაში ეს ეფექტი ყველაზე აშკარაა და, როგორც ჩანს, CD8 + უჯრედებში MNA-ზე გარემოც ძლიერ გავლენას ახდენს. თუმცა, ეს მნიშვნელოვანი არ არის, რადგან ექვსი პაციენტიდან მხოლოდ სამში შეიძლება შეფასდეს სიმსივნის CD8+ ქულები. MNA-ს გარდა, ასციტისა და სიმსივნეების სხვადასხვა ტიპის უჯრედებში, სხვა მეტაბოლიტები, რომლებიც ცუდად არის დახასიათებული TIL-ში, ასევე დიფერენცირებულად მდიდარია (სურათები S3 და S4). ამრიგად, ეს მონაცემები ავლენს იმუნომოდულატორული მეტაბოლიტების პერსპექტიულ ნაკრებს შემდგომი კვლევისთვის.
(A) MNA-ს ნორმალიზებული შემცველობა CD4+, CD8+ და CD45- უჯრედებში ასციტიდან და სიმსივნიდან. ჩარჩოს დიაგრამა აჩვენებს მედიანას (ხაზი), კვარტილთაშორის დიაპაზონს (ჩარჩოს რგოლი) და მონაცემთა დიაპაზონს, კვარტილთაშორის დიაპაზონის (ჩარჩოს ულვაში) 1.5-ჯერამდე. როგორც აღწერილია პაციენტის მასალებსა და მეთოდებში, გამოიყენეთ პაციენტის ლიმას მნიშვნელობა P მნიშვნელობის დასადგენად (*P<0.05 და **P<0.01). (B) MNA მეტაბოლიზმის სქემატური დიაგრამა (60). მეტაბოლიტები: S-ადენოზილ-1-მეთიონინი; SAH, S-ადენოზინ-1-ჰომოცისტეინი; NA, ნიკოტინამიდი; MNA, 1-მეთილნიკოტინამიდი; 2-PY, 1-მეთილ-2-პირიდონ-5-კარბოქსამიდი; 4-PY, 1-მეთილ-4-პირიდონ-5-კარბოქსამიდი; NR, ნიკოტინამიდის რიბოზა; NMN, ნიკოტინამიდის მონონუკლეოტიდი. ფერმენტები (მწვანე): NNMT, ნიკოტინამიდ N-მეთილტრანსფერაზა; SIRT, სირტუინები; NAMPT, ნიკოტინამიდ ფოსფორიბოზილ ტრანსფერაზა; AOX1, ალდეჰიდ ოქსიდაზა 1; NRK, ნიკოტინამიდ რიბოზიდ კინაზა; NMNAT, ნიკოტინამიდ მონო ნუკლეოტიდ ადენილატ ტრანსფერაზა; Pnp1, პურინ ნუკლეოზიდ ფოსფორილაზა. (C) ასციტის scRNA-seq-ის t-SNE (ნაცრისფერი) და სიმსივნის (წითელი; n = 3 პაციენტი). (D) NNMT ექსპრესია სხვადასხვა უჯრედულ პოპულაციებში, რომლებიც იდენტიფიცირებულია scRNA-seq-ის გამოყენებით. (E) NNMT-ის და AOX1-ის ექსპრესია SK-OV-3-ში, ადამიანის ემბრიონულ თირკმელში (HEK) 293T, T უჯრედებში და MNA-დამუშავებულ T უჯრედებში. დაკეცილი ექსპრესია ნაჩვენებია SK-OV-3-თან შედარებით. ნაჩვენებია SEM-ით ექსპრესიის ნიმუში (n = 6 ჯანმრთელი დონორი). 35-ზე მეტი Ct მნიშვნელობები ითვლება არაგამოვლენად (UD). (F) SLC22A1-ის და SLC22A2-ის ექსპრესია SK-OV-3, HEK293T, T უჯრედებსა და 8mM MNA-თი დამუშავებულ T უჯრედებში. დაკეცილი ექსპრესია ნაჩვენებია SK-OV-3-თან შედარებით. ნაჩვენებია SEM-ით ექსპრესიის ნიმუში (n = 6 ჯანმრთელი დონორი). 35-ზე მეტი Ct მნიშვნელობები ითვლება არადეტექტირებად (UD). (G) უჯრედული MNA-ს შემცველობა გააქტიურებულ ჯანმრთელ დონორ T უჯრედებში MNA-თი 72-საათიანი ინკუბაციის შემდეგ. ნაჩვენებია SEM-ით ექსპრესიის ნიმუში (n = 4 ჯანმრთელი დონორი).
MNA წარმოიქმნება მეთილის ჯგუფის S-ადენოზილ-1-მეთიონინიდან (SAM) ნიკოტინამიდში (NA) ნიკოტინამიდ N-მეთილტრანსფერაზას (NNMT; სურათი 3B) მეშვეობით გადატანით. NNMT ზედმეტად არის გამოხატული ადამიანის სხვადასხვა კიბოს დროს და ასოცირდება პროლიფერაციასთან, ინვაზიასთან და მეტასტაზირებასთან (25-27). TME-ში T უჯრედებში MNA-ს წყაროს უკეთ გასაგებად, ჩვენ გამოვიყენეთ scRNA-seq, რათა დაგვეხასიათებინა NNMT-ს ექსპრესიის მრავალფეროვნება სხვადასხვა ტიპის უჯრედებში HGSC პაციენტის ასციტებსა და სიმსივნეებში (ცხრილი S5). დაახლოებით 6,500 უჯრედის ანალიზმა აჩვენა, რომ ასციტებსა და სიმსივნურ გარემოში, NNMT-ს ექსპრესია შემოიფარგლებოდა სავარაუდო ფიბრობლასტური და სიმსივნური უჯრედების პოპულაციებით (სურათი 3, C და D). აღსანიშნავია, რომ არ არსებობს NNMT-ს აშკარა ექსპრესია არცერთ პოპულაციაში, რომელიც გამოხატავს PTPRC (CD45 +)-ს (სურათი 3D და სურათი S5A), რაც მიუთითებს, რომ მეტაბოლიტების სპექტრში აღმოჩენილი MNA შეყვანილია T უჯრედებში. ალდეჰიდ ოქსიდაზა 1-ის (AOX1) ექსპრესია გარდაქმნის MNA-ს 1-მეთილ-2-პირიდონ-5-კარბოქსამიდად (2-PYR) ან 1-მეთილ-4-პირიდონ-5-კარბოქსამიდად (4-PYR); სურათი 3B) ასევე შემოიფარგლება COL1A1-ის გამომხატველი ფიბრობლასტების პოპულაციით (სურათი S5A), რაც ერთად მიუთითებს, რომ T უჯრედებს არ გააჩნიათ ტრადიციული MNA მეტაბოლიზმის უნარი. ამ MNA-სთან დაკავშირებული გენების ექსპრესიის ნიმუში დადასტურდა HGSC პაციენტების ასციტიდან აღებული მეორე დამოუკიდებელი უჯრედული მონაცემების გამოყენებით (სურათი S5B; n = 6) (16). გარდა ამისა, MNA-თი დამუშავებული ჯანმრთელი დონორის T უჯრედების რაოდენობრივი პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (qPCR) ანალიზმა აჩვენა, რომ საკონტროლო SK-OV-3 საკვერცხის სიმსივნურ უჯრედებთან შედარებით, NNMT ან AOX1 თითქმის არ იყო ექსპრესირებული (სურათი 3E). ეს მოულოდნელი შედეგები მიუთითებს, რომ MNA შეიძლება გამოიყოს ფიბრობლასტებიდან ან სიმსივნეებიდან მიმდებარე T უჯრედებში TME-ში.
მიუხედავად იმისა, რომ კანდიდატებს შორისაა ორგანული კათიონების ტრანსპორტიორების 1-დან 3-მდე ოჯახი (OCT1, OCT2 და OCT3), რომლებიც კოდირებულია ხსნადი გადამტანი 22-ის (SLC22) ოჯახით (SLC22A1, SLC22A2 და SLC22A3), MNA-ს პოტენციური ტრანსპორტიორები ჯერ კიდევ განუსაზღვრელია (28). ჯანმრთელი დონორის T უჯრედებიდან მიღებული mRNA-ს QPCR-მა აჩვენა SLC22A1-ის დაბალი ექსპრესიის დონე, მაგრამ SLC22A2-ის შეუსამჩნევი დონე, რაც ადასტურებს, რომ ის ადრე იყო აღწერილი ლიტერატურაში (სურათი 3F) (29). ამის საპირისპიროდ, SK-OV-3 საკვერცხის სიმსივნური უჯრედული ხაზი ორივე ტრანსპორტიორის მაღალ დონეს გამოხატავდა (სურათი 3F).
T უჯრედების მიერ უცხო MNA-ს შთანთქმის უნარის შესამოწმებლად, ჯანმრთელი დონორის T უჯრედები 72 საათის განმავლობაში კულტივირებული იქნა MNA-ს სხვადასხვა კონცენტრაციის თანაარსებობისას. ეგზოგენური MNA-ს არარსებობის შემთხვევაში, MNA-ს უჯრედული შემცველობის აღმოჩენა შეუძლებელია (სურათი 3G). თუმცა, ეგზოგენური MNA-თი დამუშავებულმა გააქტიურებულმა T უჯრედებმა აჩვენეს უჯრედებში MNA-ს შემცველობის დოზადამოკიდებული ზრდა, 6 mM MNA-მდე (სურათი 3G). ეს შედეგი მიუთითებს, რომ ტრანსპორტიორის ექსპრესიის დაბალი დონის და უჯრედშიდა MNA-ს მეტაბოლიზმზე პასუხისმგებელი მთავარი ფერმენტის არარსებობის მიუხედავად, TIL-ს მაინც შეუძლია MNA-ს შთანთქმა.
პაციენტების T უჯრედებში მეტაბოლიტების სპექტრი და MNA-ს შთანთქმის in vitro ექსპერიმენტები ზრდის იმის შესაძლებლობას, რომ კიბოსთან ასოცირებული ფიბრობლასტები (CAF) გამოყოფენ MNA-ს და სიმსივნური უჯრედები არეგულირებენ TIL-ის ფენოტიპსა და ფუნქციას. MNA-ს T უჯრედებზე ზემოქმედების დასადგენად, ჯანმრთელი დონორის T უჯრედები გააქტიურდა in vitro MNA-ს არსებობის ან არარსებობის შემთხვევაში და შეფასდა მათი პროლიფერაცია და ციტოკინების წარმოება. MNA-ს ყველაზე მაღალი დოზით დამატებით 7 დღის შემდეგ, პოპულაციის გაორმაგების რაოდენობა ზომიერად შემცირდა, ხოლო ენერგიულობა შენარჩუნდა ყველა დოზის დროს (სურათი 4A). გარდა ამისა, ეგზოგენური MNA-ს დამუშავებამ გამოიწვია სიმსივნის ნეკროზის ფაქტორ-α-ს (TNFα; სურათი 4B) გამომხატველი CD4 + და CD8 + T უჯრედების პროპორციის ზრდა. ამის საპირისპიროდ, IFN-γ-ს უჯრედშიდა წარმოება მნიშვნელოვნად შემცირდა CD4 + T უჯრედებში, მაგრამ არა CD8 + T უჯრედებში და ინტერლეიკინ 2-ში (IL-2; სურათი 4, C და D) მნიშვნელოვანი ცვლილება არ დაფიქსირებულა. ამგვარად, ამ MNA-თი დამუშავებული T უჯრედების კულტურებიდან მიღებული სუპერნატანტების ფერმენტ-შეკავშირებულ იმუნოსორბენტულ ანალიზში (ELISA) გამოვლინდა TNFα-ს მნიშვნელოვანი ზრდა, IFN-γ-ს შემცირება და IL-2-ის ცვლილების არარსებობა (სურათი 4, E-დან G-მდე). . IFN-γ-ს შემცირება მიუთითებს, რომ MNA-მ შესაძლოა გარკვეული როლი ითამაშოს T უჯრედების სიმსივნის საწინააღმდეგო აქტივობის ინჰიბირებაში. T უჯრედების მიერ განპირობებულ ციტოტოქსიურობაზე MNA-ს ეფექტის სიმულირებისთვის, ჯანსაღი დონორის პერიფერიული სისხლის მონონუკლეარული უჯრედების (PBMC) მიერ წარმოიქმნება ქიმერული ანტიგენური რეცეპტორის T (FRα-CAR-T) უჯრედები, რომლებიც მიმართულია ფოლატის რეცეპტორ α-სა და მწვანე ფლუორესცენტური ცილის (GFP) -CAR-T) უჯრედებით რეგულირებული CAR-T (GFP)-ის მიმართ. CAR-T უჯრედები კულტივირებული იქნა 24 საათის განმავლობაში MNA-ს თანაარსებობისას და შემდეგ თანაკულტივირებული იქნა ადამიანის SK-OV-3 საკვერცხის სიმსივნურ უჯრედებთან, რომლებიც გამოხატავენ ფოლატის რეცეპტორ α-ს ეფექტორისა და სამიზნეს თანაფარდობით 10:1. MNA-თი მკურნალობამ გამოიწვია FRα-CAR-T უჯრედების მკვლელობის აქტივობის მნიშვნელოვანი შემცირება, რაც მსგავსი იყო ადენოზინით დამუშავებული FRα-CAR-T უჯრედებისა (სურათი 4H).
(A) სიცოცხლისუნარიანი უჯრედების საერთო რაოდენობა და პოპულაციის გაორმაგება (PD) პირდაპირ კულტურიდან მე-7 დღეს. სვეტოვანი დიაგრამა წარმოადგენს ექვსი ჯანმრთელი დონორის საშუალო + SEM-ს. წარმოადგენს მონაცემებს მინიმუმ n = 3 დამოუკიდებელი ექსპერიმენტიდან. (B-დან D-მდე) CD3/CD28 და IL-2 გამოყენებული იქნა T უჯრედების გასააქტიურებლად მათი შესაბამისი MNA კონცენტრაციებით 7 დღის განმავლობაში. ანალიზის დაწყებამდე, უჯრედები სტიმულირებული იქნა PMA/იონომიცინით GolgiStop-ით 4 საათის განმავლობაში. TNFα (B) ექსპრესია T უჯრედებში. TNFα ექსპრესიის მაგალითის სურათი (მარცხნივ) და ცხრილური მონაცემები (მარჯვნივ) ცოცხალ უჯრედებში. IFN-γ (C) და IL-2 (D) ექსპრესია T უჯრედებში. ციტოკინების ექსპრესია გაიზომა ნაკადური ციტომეტრიით. სვეტოვანი დიაგრამა წარმოადგენს საშუალოს (n = 6 ჯანმრთელი დონორი) + SEM-ს. P მნიშვნელობის დასადგენად გამოიყენეთ ვარიაციის ცალმხრივი ანალიზი და განმეორებითი გაზომვები (*P<0.05 და **P<0.01). წარმოადგენს მონაცემებს მინიმუმ n = 3 დამოუკიდებელი ექსპერიმენტიდან. (E-დან G-მდე) CD3/CD28 და IL-2 გამოყენებული იქნა T უჯრედების გასააქტიურებლად მათი შესაბამისი MNA კონცენტრაციებით 7 დღის განმავლობაში. გარემო შეგროვდა PMA/იონომიცინის სტიმულაციამდე და 4 საათის შემდეგ. TNFα (E), IFN-γ (F) და IL-2 (G) კონცენტრაციები გაიზომა ELISA-ს მეთოდით. ​​სვეტოვანი დიაგრამა წარმოადგენს საშუალოს (n = 5 ჯანმრთელი დონორი) + SEM. P მნიშვნელობა განისაზღვრა ვარიაციის ცალმხრივი ანალიზისა და განმეორებითი გაზომვების გამოყენებით (*P<0.05). წერტილოვანი ხაზი მიუთითებს აღმოჩენის აღმოჩენის ზღვარს. (H) უჯრედის ლიზისის ანალიზი. FRα-CAR-T ან GFP-CAR-T უჯრედები დაკორექტირდა ადენოზინით (250μM) ან MNA-თი (10 mM) 24 საათის განმავლობაში, ან დარჩა დაუმუშავებელი (Ctrl). გაიზომა SK-OV-3 უჯრედების პროცენტული მკვლელობა. P მნიშვნელობა განისაზღვრა Welch t ტესტით (*P<0.5 და **P<0.01).
MNA-დამოკიდებული TNFα ექსპრესიის რეგულირების მექანიზმის გასაგებად, შეფასდა MNA-თი დამუშავებული T უჯრედების TNFα mRNA-ს ცვლილებები (სურათი 5A). ჯანმრთელი დონორის T უჯრედებმა, რომლებიც დამუშავებულნი იყვნენ MNA-თი, აჩვენეს TNFα ტრანსკრიფციის დონის ორჯერადი ზრდა, რაც მიუთითებს, რომ MNA დამოკიდებულია TNFα ტრანსკრიფციულ რეგულაციაზე. ამ შესაძლო მარეგულირებელი მექანიზმის შესასწავლად, შეფასდა TNFα-ს მარეგულირებელი ორი ცნობილი ტრანსკრიფციის ფაქტორი, კერძოდ, გააქტიურებული T უჯრედის ბირთვული ფაქტორი (NFAT) და სპეციფიკური ცილა 1 (Sp1), MNA-ს პროქსიმალურ TNFα პრომოტერთან შეკავშირების საპასუხოდ (30). TNFα პრომოტორი შეიცავს 6 იდენტიფიცირებულ NFAT შეკავშირების ადგილს და 2 Sp1 შეკავშირების ადგილს, რომლებიც ერთ ადგილას გადაფარავს [-55 ფუძე წყვილი (bp) 5'cap-დან] (30). ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაციამ (ChIP) აჩვენა, რომ MNA-თი დამუშავებისას, Sp1-ის შეკავშირება TNFα პრომოტერთან სამჯერ გაიზარდა. NFAT-ის ინკორპორაციაც გაიზარდა და მნიშვნელობას მიუახლოვდა (სურათი 5B). ეს მონაცემები მიუთითებს, რომ MNA არეგულირებს TNFα-ს ექსპრესიას Sp1 ტრანსკრიფციის გზით და ნაკლებად - NFAT-ის ექსპრესიას.
(A) MNA-ს გარეშე კულტივირებულ T უჯრედებთან შედარებით, TNFα ექსპრესიის ჯერადი ცვლილება MNA-თი დამუშავებულ T უჯრედებში. ნაჩვენებია SEM-ით ექსპრესიის ნიმუში (n = 5 ჯანმრთელი დონორი). წარმოადგენს მონაცემებს მინიმუმ n = 3 დამოუკიდებელი ექსპერიმენტიდან. (B) NFAT-ისა და Sp1-ის შემდეგ 8 mM MNA-თი ან მის გარეშე დამუშავებული T უჯრედების TNFα პრომოტორი შერწყმული იყო (Ctrl)-თან და PMA/იონომიცინით სტიმულაციასთან 4 საათის განმავლობაში. იმუნოგლობულინი G (IgG) და H3 გამოყენებული იყო, შესაბამისად, როგორც უარყოფითი და დადებითი კონტროლი იმუნოპრეციპიტაციისთვის. ChIP-ის რაოდენობრივმა განსაზღვრამ აჩვენა, რომ Sp1-ისა და NFAT-ის შეკავშირება TNFα პრომოუტერთან MNA-თი დამუშავებულ უჯრედებში რამდენჯერმე გაიზარდა საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით. წარმოადგენს მონაცემებს მინიმუმ n = 3 დამოუკიდებელი ექსპერიმენტიდან. P მნიშვნელობა განისაზღვრა მრავალი t-ტესტით (*** P <0.01). (C) HGSC-ის ასციტთან შედარებით, T უჯრედებმა (არაციტოტოქსიური) აჩვენეს TNF-ის გაზრდილი ექსპრესია სიმსივნეში. ფერები წარმოადგენს სხვადასხვა პაციენტებს. ნაჩვენები უჯრედები შემთხვევით იქნა აღებული 300-მდე და შეცვლილი იქნა გადატვირთვის შესამცირებლად (** Padj = 0.0076). (D) საკვერცხის კიბოს MNA-ს შემოთავაზებული მოდელი. MNA წარმოიქმნება სიმსივნურ უჯრედებსა და ფიბრობლასტებში TME-ში და შეიწოვება T უჯრედების მიერ. MNA ზრდის Sp1-ის შეკავშირებას TNFα პრომოუტერთან, რაც იწვევს TNFα ტრანსკრიფციის და TNFα ციტოკინების წარმოების ზრდას. MNA ასევე იწვევს IFN-γ-ს შემცირებას. T უჯრედების ფუნქციის ინჰიბირება იწვევს მკვლელობის უნარის შემცირებას და სიმსივნის ზრდის დაჩქარებას.
ცნობების თანახმად, TNFα-ს აქვს წინა და უკანა დამოკიდებულებითი სიმსივნის საწინააღმდეგო და სიმსივნის საწინააღმდეგო ეფექტები, თუმცა მას კარგად აქვს ცნობილი როლი საკვერცხის კიბოს ზრდისა და მეტასტაზირების ხელშეწყობაში (31-33). ცნობების თანახმად, საკვერცხის კიბოს მქონე პაციენტებში ასციტსა და სიმსივნურ ქსოვილებში TNFα-ს კონცენტრაცია უფრო მაღალია, ვიდრე კეთილთვისებიან ქსოვილებში (34-36). მექანიზმის თვალსაზრისით, TNFα-ს შეუძლია დაარეგულიროს სისხლის თეთრი უჯრედების აქტივაცია, ფუნქცია და პროლიფერაცია და შეცვალოს კიბოს უჯრედების ფენოტიპი (37, 38). ამ დასკვნებთან შესაბამისობაში, გენის დიფერენციალური ექსპრესიის ანალიზმა აჩვენა, რომ TNF მნიშვნელოვნად მომატებული იყო სიმსივნურ ქსოვილებში T უჯრედებში ასციტთან შედარებით (სურათი 5C). TNF ექსპრესიის ზრდა მხოლოდ არაციტოტოქსიური ფენოტიპის მქონე T უჯრედების პოპულაციებში იყო აშკარა (სურათი S5A). შეჯამებისთვის, ეს მონაცემები ადასტურებს იმ მოსაზრებას, რომ MNA-ს აქვს ორმაგი იმუნოსუპრესიული და სიმსივნის ხელშემწყობი ეფექტი HGSC-ში.
ნაკადური ციტომეტრიის საფუძველზე ფლუორესცენტული მარკირება TIL მეტაბოლიზმის შესწავლის მთავარ მეთოდად იქცა. ამ კვლევებმა აჩვენა, რომ პერიფერიული სისხლის ლიმფოციტებთან ან მეორადი ლიმფოიდური ორგანოებიდან T უჯრედებთან შედარებით, თაგვის და ადამიანის TIL-ებს აქვთ გლუკოზის შთანთქმის უფრო მაღალი ტენდენცია (4, 39) და მიტოქონდრიული ფუნქციის თანდათანობითი დაკარგვა (19, 40). მიუხედავად იმისა, რომ ამ კვლევაში მსგავსი შედეგები დავაკვირდით, მთავარი განვითარებაა სიმსივნური უჯრედების და TIL-ის მეტაბოლიზმის შედარება იმავე რეზექცირებული სიმსივნური ქსოვილიდან. ზოგიერთი წინა ანგარიშის შესაბამისად, ასციტიდან და სიმსივნეებიდან მიღებულ სიმსივნურ (CD45-EpCAM +) უჯრედებს აქვთ გლუკოზის უფრო მაღალი შთანთქმა, ვიდრე CD8 + და CD4 + T უჯრედებს, რაც ადასტურებს, რომ სიმსივნური უჯრედების მიერ გლუკოზის მაღალი შთანთქმა შეიძლება შევადაროთ T უჯრედებს. T უჯრედების კონკურენციის კონცეფცია. TME. თუმცა, სიმსივნური უჯრედების მიტოქონდრიული აქტივობა უფრო მაღალია, ვიდრე CD8 + T უჯრედების, მაგრამ მიტოქონდრიული აქტივობა მსგავსია CD4 + T უჯრედების. ეს შედეგები აძლიერებს ახალ თემას, რომ ჟანგვითი მეტაბოლიზმი მნიშვნელოვანია სიმსივნური უჯრედებისთვის (41, 42). ისინი ასევე ვარაუდობენ, რომ CD8 + T უჯრედები შეიძლება უფრო მგრძნობიარენი იყვნენ ჟანგვითი დისფუნქციის მიმართ, ვიდრე CD4 + T უჯრედები, ან რომ CD4 + T უჯრედებმა შეიძლება გამოიყენონ ნახშირბადის სხვა წყაროები მიტოქონდრიული აქტივობის შესანარჩუნებლად გლუკოზის გარდა (43, 44). უნდა აღინიშნოს, რომ ასციტის დროს CD4 + T ეფექტორებს, T ეფექტორულ მეხსიერებას და T ცენტრალური მეხსიერების უჯრედებს შორის გლუკოზის შთანთქმის ან მიტოქონდრიული აქტივობის განსხვავება არ დაგვიფიქსირებია. ანალოგიურად, სიმსივნეებში CD8 + T უჯრედების დიფერენციაციის მდგომარეობას არაფერი აქვს საერთო გლუკოზის შთანთქმის ცვლილებებთან, რაც ხაზს უსვამს მნიშვნელოვან განსხვავებას in vitro კულტივირებულ T უჯრედებსა და ადამიანის TIL-ს შორის in vivo (22). ეს დაკვირვებები ასევე დადასტურდა უჯრედების პოპულაციის მიუკერძოებელი ავტომატური განაწილების გამოყენებით, რამაც კიდევ უფრო აჩვენა, რომ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + უჯრედები, რომლებსაც აქვთ უფრო მაღალი გლუკოზის შთანთქმა და მიტოქონდრიული აქტივობა, ვიდრე სიმსივნურ უჯრედებს, გავრცელებულია, მაგრამ აქვთ მეტაბოლურად აქტიური უჯრედების პოპულაცია. ეს პოპულაცია შეიძლება წარმოადგენდეს მიელოიდური სუპრესორული უჯრედების ან პლაზმაციტოიდური დენდრიტული უჯრედების სავარაუდო ქვეპოპულაციას, რომლებიც იდენტიფიცირებულია scRNA-seq ანალიზში. მიუხედავად იმისა, რომ ორივე ეს შემთხვევა ადამიანის საკვერცხის სიმსივნეებშიც დაფიქსირდა [45], ისინი მაინც საჭიროებენ შემდგომ მუშაობას ამ მიელოიდური ქვეპოპულაციის აღსაწერად.
მიუხედავად იმისა, რომ ნაკადურ ციტომეტრიაზე დაფუძნებულ მეთოდებს შეუძლიათ უჯრედების ტიპებს შორის გლუკოზისა და ჟანგვითი მეტაბოლიზმის ზოგადი განსხვავებების გარკვევა, TME-ში მიტოქონდრიული მეტაბოლიზმისთვის გლუკოზის ან სხვა ნახშირბადის წყაროების მიერ წარმოქმნილი ზუსტი მეტაბოლიტები ჯერ არ არის განსაზღვრული. მეტაბოლიტების არსებობის ან არარსებობის მოცემულ TIL ქვეჯგუფზე მინიჭება მოითხოვს უჯრედების პოპულაციის გაწმენდას ამოკვეთილი ქსოვილიდან. ამიტომ, უჯრედების გამდიდრების ჩვენი მეთოდი მას-სპექტრომეტრიასთან ერთად შეიძლება გვაწვდიდეს ინფორმაციას მეტაბოლიტების შესახებ, რომლებიც დიფერენცირებულად არის გამდიდრებული T უჯრედებსა და სიმსივნური უჯრედების პოპულაციებში შესაბამის პაციენტთა ნიმუშებში. მიუხედავად იმისა, რომ ამ მეთოდს აქვს უპირატესობები ფლუორესცენციით გააქტიურებულ უჯრედების დახარისხებასთან შედარებით, გარკვეულ მეტაბოლიტების ბიბლიოთეკებზე შეიძლება გავლენა იქონიოს თანდაყოლილი სტაბილურობის და/ან სწრაფი მეტაბოლიზმის სიჩქარის გამო (22). მიუხედავად ამისა, ჩვენმა მეთოდმა შეძლო ორი აღიარებული იმუნოსუპრესიული მეტაბოლიტის, ადენოზინის და კინურენინის იდენტიფიცირება, რადგან ისინი მნიშვნელოვნად განსხვავდებიან ნიმუშების ტიპებს შორის.
სიმსივნეებისა და TIL ქვეტიპების ჩვენი მეტაბონომიური ანალიზი მეტ ინფორმაციას გვაწვდის საკვერცხის TME-ში მეტაბოლიტების როლის შესახებ. პირველ რიგში, ნაკადური ციტომეტრიის გამოყენებით, ჩვენ დავადგინეთ, რომ სიმსივნეებსა და CD4 + T უჯრედებს შორის მიტოქონდრიულ აქტივობაში განსხვავება არ იყო. თუმცა, LC-MS/MS ანალიზმა გამოავლინა მნიშვნელოვანი ცვლილებები ამ პოპულაციებში მეტაბოლიტების სიმრავლეში, რაც მიუთითებს, რომ TIL მეტაბოლიზმისა და მისი საერთო მეტაბოლური აქტივობის შესახებ დასკვნები საჭიროებს ფრთხილად ინტერპრეტაციას. მეორეც, MNA არის მეტაბოლიტი, რომელსაც ყველაზე დიდი განსხვავება აქვს CD45-უჯრედებსა და T უჯრედებს შორის ასციტში და არა სიმსივნეებში. ამიტომ, კომპარტმენტალიზაციას და სიმსივნის მდებარეობას შეიძლება განსხვავებული გავლენა ჰქონდეს TIL მეტაბოლიზმზე, რაც ხაზს უსვამს შესაძლო ჰეტეროგენულობას მოცემულ მიკროგარემოში. მესამე, MNA-ს წარმომქმნელი ფერმენტის NNMT-ის ექსპრესია ძირითადად შემოიფარგლება CAF-ით, რომელიც ნაკლებად არის სიმსივნური უჯრედები, მაგრამ სიმსივნიდან მიღებულ T უჯრედებში შეინიშნება MNA-ს აღმოჩენის დონეები. NNMT-ის ზედმეტად ექსპრესიას საკვერცხის CAF-ში აქვს ცნობილი კიბოს ხელშემწყობი ეფექტი, ნაწილობრივ CAF მეტაბოლიზმის, სიმსივნის ინვაზიისა და მეტასტაზირების ხელშეწყობის გამო (27). მიუხედავად იმისა, რომ TIL-ის საერთო დონე ზომიერია, NNMT-ის ექსპრესია CAF-ში მჭიდრო კავშირშია კიბოს გენომის ატლასის (TCGA) მეზენქიმურ ქვეტიპთან, რაც ცუდ პროგნოზთან ასოცირდება (27, 46, 47). და ბოლოს, MNA-ს დეგრადაციაზე პასუხისმგებელი ფერმენტ AOX1-ის ექსპრესია ასევე შემოიფარგლება CAF პოპულაციით, რაც მიუთითებს, რომ T უჯრედებს არ აქვთ MNA-ს მეტაბოლიზების უნარი. ეს შედეგები ადასტურებს იმ აზრს, რომ მიუხედავად იმისა, რომ ამ აღმოჩენის დასადასტურებლად დამატებითი სამუშაოებია საჭირო, T უჯრედებში MNA-ს მაღალი დონე შეიძლება მიუთითებდეს იმუნოსუპრესიული CAF მიკროგარემოს არსებობაზე.
MNA ტრანსპორტიორების დაბალი ექსპრესიის დონისა და MNA მეტაბოლიზმში ჩართული ძირითადი ცილების შეუსწავლელი დონის გათვალისწინებით, T უჯრედებში MNA-ს არსებობა მოულოდნელია. ორი დამოუკიდებელი კოჰორტის scRNA-seq ანალიზით და მიზნობრივი qPCR-ით ვერც NNMT-ის და ვერც AOX1-ის აღმოჩენა ვერ მოხერხდა. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ MNA არ სინთეზირდება T უჯრედების მიერ, არამედ შეიწოვება მიმდებარე TME-დან. in vitro ექსპერიმენტები აჩვენებს, რომ T უჯრედები მიდრეკილნი არიან ეგზოგენური MNA-ს დაგროვებისკენ.
ჩვენმა in vitro კვლევებმა აჩვენა, რომ ეგზოგენური MNA იწვევს TNFα-ს ექსპრესიას T უჯრედებში და აძლიერებს Sp1-ის შეკავშირებას TNFα პრომოუტერთან. მიუხედავად იმისა, რომ TNFα-ს აქვს როგორც სიმსივნის საწინააღმდეგო, ასევე სიმსივნის საწინააღმდეგო ფუნქციები, საკვერცხის კიბოს დროს TNFα-ს შეუძლია ხელი შეუწყოს საკვერცხის კიბოს ზრდას (31-33). TNFα-ს ნეიტრალიზაციას საკვერცხის სიმსივნური უჯრედების კულტურაში ან TNFα სიგნალის აღმოფხვრას თაგვის მოდელებში შეუძლია გააუმჯობესოს TNFα-განპირობებული ანთებითი ციტოკინების წარმოება და შეაფერხოს სიმსივნის ზრდა (32, 35). ამიტომ, ამ შემთხვევაში, TME-სგან მიღებულ MNA-ს შეუძლია იმოქმედოს როგორც პროანთებითი მეტაბოლიტი TNFα-დამოკიდებული მექანიზმის მეშვეობით აუტოკრინული მარყუჟის მეშვეობით, რითაც ხელს უწყობს საკვერცხის კიბოს განვითარებას და გავრცელებას (31). ამ შესაძლებლობის საფუძველზე, TNFα ბლოკადა შესწავლილია, როგორც საკვერცხის კიბოს პოტენციური თერაპიული აგენტი (37, 48, 49). გარდა ამისა, MNA აფერხებს CAR-T უჯრედების ციტოტოქსიურობას საკვერცხის სიმსივნური უჯრედების მიმართ, რაც დამატებით მტკიცებულებას იძლევა MNA-განპირობებული იმუნური დათრგუნვის შესახებ. ერთობლივად, ეს შედეგები მიუთითებს მოდელზე, რომელშიც სიმსივნეები და CAF უჯრედები გამოყოფენ MNA-ს უჯრედგარე TME-ში. (i) TNF-ით ინდუცირებული საკვერცხის კიბოს ზრდის სტიმულაციისა და (ii) MNA-ით ინდუცირებული T უჯრედების ციტოტოქსიური აქტივობის ინჰიბირების გზით, ამას შეიძლება ჰქონდეს ორმაგი სიმსივნური ეფექტი (სურათი 5D).
დასკვნის სახით, უჯრედების სწრაფი გამდიდრების, ერთუჯრედიანი სეკვენირებისა და მეტაბოლური პროფილირების კომბინაციის გამოყენებით, ამ კვლევამ გამოავლინა უზარმაზარი იმუნომეტაბოლომიური განსხვავებები სიმსივნეებსა და ასციტის უჯრედებს შორის HGSC პაციენტებში. ამ ყოვლისმომცველმა ანალიზმა აჩვენა, რომ T უჯრედებს შორის არსებობს განსხვავებები გლუკოზის შთანთქმასა და მიტოქონდრიულ აქტივობაში და MNA იდენტიფიცირებულია, როგორც არაუჯრედული ავტონომიური იმუნური მარეგულირებელი მეტაბოლიტი. ეს მონაცემები გავლენას ახდენს იმაზე, თუ როგორ მოქმედებს TME T უჯრედების მეტაბოლიზმზე ადამიანის კიბოში. მიუხედავად იმისა, რომ T უჯრედებსა და კიბოს უჯრედებს შორის საკვები ნივთიერებებისთვის პირდაპირი კონკურენციაა დაფიქსირებული, მეტაბოლიტებს ასევე შეუძლიათ იმოქმედონ როგორც არაპირდაპირი რეგულატორები, რათა ხელი შეუწყონ სიმსივნის პროგრესირებას და შესაძლოა დათრგუნონ ენდოგენური იმუნური პასუხები. ამ მარეგულირებელი მეტაბოლიტების ფუნქციური როლის შემდგომმა აღწერამ შეიძლება გახსნას ალტერნატიული სტრატეგიები სიმსივნის საწინააღმდეგო იმუნური პასუხის გასაძლიერებლად.
პაციენტის ნიმუშები და კლინიკური მონაცემები მოპოვებული იქნა კანადის ქსოვილების საცავის ქსელის მიერ სერტიფიცირებული ბრიტანული კოლუმბიის კიბოს სიმსივნის ქსოვილის საცავის მეშვეობით. ბრიტანული კოლუმბიის კიბოს კვლევის ეთიკის კომიტეტისა და ბრიტანეთის კოლუმბიის უნივერსიტეტის (H07-00463) მიერ დამტკიცებული პროტოკოლის თანახმად, ყველა პაციენტის ნიმუშმა და კლინიკურმა მონაცემმა მიიღო ინფორმირებული წერილობითი თანხმობა ან ოფიციალურად უარი თქვა თანხმობაზე. ნიმუშები ინახება სერტიფიცირებულ ბიობანკში (BRC-00290). პაციენტის დეტალური მახასიათებლები ნაჩვენებია ცხრილებში S1 და S5. კრიოკონსერვაციისთვის, სკალპელი გამოიყენება პაციენტის სიმსივნის ნიმუშის მექანიკურად დასაშლელად და შემდეგ მისი 100 მიკრონიან ფილტრში გასატარებლად ერთუჯრედიანი სუსპენზიის მისაღებად. პაციენტის ასციტი ცენტრიფუგირდა 1500 ბრ/წთ-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე უჯრედების პელეტიზაციისა და ზედაპირული სითხის მოსაშორებლად. სიმსივნიდან და ასციტიდან მიღებული უჯრედები კრიოკონსერვირებული იქნა 50%-იან თერმულად ინაქტივირებულ ადამიანის AB შრატში (Sigma-Aldrich), 40%-იან RPMI-1640-ში (Thermo Fisher Scientific) და 10%-იან დიმეთილსულფოქსიდში. ეს კონსერვირებული ერთუჯრედიანი სუსპენზიები გალღობილი იქნა და გამოყენებული იქნა მეტაბოლომიკისა და მეტაბოლიტების განსაზღვრისთვის, როგორც ეს ქვემოთ არის აღწერილი.
სრული გარემო შედგება 0.22 μm გაფილტრული 50:50 თანაფარდობით დამატებული RPMI 1640-ისგან: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-გლუტამინისგან (Thermo Fisher Scientific), რომელსაც დამატებული აქვს 10% თერმულად ინაქტივირებული ადამიანის AB შრატი (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-გლუტამინი (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x პენიცილინის სტრეპტომიცინის (PenStrep) ხსნარი (Thermo Fisher Scientific) და 50 μMB-მერკაპტოეთანოლი. AimV (Invitrogen) დამატებულია 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) და 2 mM l-გლუტამინი (Thermo Fisher Scientific). ნაკადური ციტომეტრის შეღებვის ბუფერი შედგებოდა 0.22 μm გაფილტრული ფოსფატური ბუფერული ფიზიოლოგიური ხსნარისგან (PBS; Invitrogen), რომელსაც დამატებული აქვს 3% თერმულად ინაქტივირებული ადამიანის AB შრატი (Sigma). უჯრედების გამდიდრების ბუფერი შედგება 0.22 μm გაფილტრული PBS-ისგან და დამატებულია 0.5% თერმულად ინაქტივირებული ადამიანის AB შრატით (Sigma-Aldrich).
37°C ტემპერატურაზე სრულ გარემოში უჯრედები შეიღება 10 nM MT DR და 100 μM 2-NBDG-ით 30 წუთის განმავლობაში. შემდეგ, უჯრედები შეიღება სიცოცხლისუნარიანობის საღებავით eF506 4°C ტემპერატურაზე 15 წუთის განმავლობაში. უჯრედები ხელახლა შეასუფრეთ FC Block-ში (eBioscience) და Brilliant Stain Buffer-ში (BD Biosciences), გააზავეთ ნაკადური ციტომეტრის შეღებვის ბუფერში (მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად) და ინკუბაცია მოახდინეთ 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. უჯრედები შეღებეთ ანტისხეულების ნაკრებით (ცხრილი S2) ნაკადური ციტომეტრიის შეღებვის ბუფერში 4°C ტემპერატურაზე 20 წუთის განმავლობაში. ანალიზის წინ უჯრედები ხელახლა შეასუფრეთ ნაკადური ციტომეტრიის შეღებვის ბუფერში (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R კონფიგურაცია). უჯრედების რაოდენობის მონაცემების გასაანალიზებლად გამოიყენეთ SpectroFlo და FlowJo V10, ხოლო მონაცემების შესაქმნელად გამოიყენეთ GraphPad Prism 8. 2-NBDG-სა და MT DR-ის მედიანური ფლუორესცენციის ინტენსივობა (MFI) ლოგარითმულად ნორმალიზებული იქნა, შემდეგ კი სტატისტიკური ანალიზისთვის გამოყენებული იქნა დაწყვილებული t ტესტი, რათა გათვალისწინებულ იქნეს შესაბამისი პაციენტები. ანალიზიდან ამოიღეთ ყველა პოპულაცია, რომელსაც აქვს 40-ზე ნაკლები მოვლენა; სტატისტიკური ანალიზისა და მონაცემთა ვიზუალიზაციის ჩატარებამდე შეიყვანეთ MFI მნიშვნელობა 1 ნებისმიერი უარყოფითი მნიშვნელობისთვის.
ზემოთ აღნიშნული პროცესის პანელის ხელით დაბლოკვის სტრატეგიის შესავსებად, FlowJo-ში მკვდარი უჯრედების აღმოფხვრის შემდეგ, უჯრედების პოპულაციაზე ავტომატურად მინიჭებისთვის გამოვიყენეთ ფორმის შეზღუდვის ხის (FAUST) (21) სრული ანოტაცია. ჩვენ ხელით ვმართავთ გამომავალს, რათა გავაერთიანოთ არასწორად განაწილებული (PD1+ და PD1-სიმსივნის უჯრედების გაერთიანება) და შენარჩუნებული პოპულაციები. თითოეული ნიმუში საშუალოდ შეიცავს 2%-ზე მეტ უჯრედს, სულ 11 პოპულაცია.
ლეიკოციტების გამოყოფის პროდუქტებისგან PBMC-ის გამოსაყოფად გამოყენებული იქნა ფიკოლის გრადიენტის სიმკვრივის ცენტრიფუგირება (STEMCELL Technologies). CD8 + T უჯრედები იზოლირებული იქნა PBMC-დან CD8 MicroBeads-ის (Miltenyi) გამოყენებით და გაფართოვდა სრულ გარემოში TransAct-ის (Miltenyi) გამოყენებით 2 კვირის განმავლობაში მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად. უჯრედები 5 დღის განმავლობაში გააჩერეს სრულ გარემოში, რომელიც შეიცავდა IL-7-ს (10 ნგ/მლ; PeproTech) და შემდეგ ხელახლა სტიმულირდნენ TransAct-ით. მე-7 დღეს, მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად, უჯრედების გასამდიდრებლად სამ ზედიზედ რაუნდში გამოყენებული იქნა ადამიანის CD45 MicroBeads (Miltenyi). უჯრედები ალიკვოტირებული იქნა ნაკადური ციტომეტრიის ანალიზისთვის (როგორც ზემოთ იყო აღწერილი) და ერთი მილიონი უჯრედი სამჯერ ალიკვოტირებული იქნა LC-MS/MS ანალიზისთვის. ნიმუშები დამუშავდა LC-MS/MS-ით, როგორც ქვემოთ არის აღწერილი. ჩვენ შევაფასეთ დაკარგული მეტაბოლიტის მნიშვნელობა 1000 იონური რიცხვით. ანალიზის დაწყებამდე თითოეული ნიმუში ნორმალიზებულია იონების საერთო რიცხვით (TIC), ლოგარითმულად გარდაიქმნება და ავტომატურად ნორმალიზებულია MetaboAnalystR-ში.
თითოეული პაციენტის ერთუჯრედიანი სუსპენზია გალღობეს და გაფილტრეს 40 μm ფილტრის მეშვეობით სრულ გარემოში (როგორც ზემოთ იყო აღწერილი). მწარმოებლის პროტოკოლის თანახმად, CD8+, CD4+ და CD45- უჯრედების ნიმუშების გასამდიდრებლად (ყინულზე) გამოყენებული იქნა დადებითი შერჩევის სამი ზედიზედ რაუნდი მაგნიტური მძივებით გამოყოფით MicroBeads-ის (Miltenyi) გამოყენებით. მოკლედ, უჯრედები ხელახლა სუსპენზირებულია უჯრედების გამდიდრების ბუფერში (როგორც ზემოთ იყო აღწერილი) და დათვლილია. უჯრედები ინკუბირებული იქნა ადამიანის CD8 მძივებთან, ადამიანის CD4 მძივებთან ან ადამიანის CD45 მძივებთან (Miltenyi) 4°C ტემპერატურაზე 15 წუთის განმავლობაში, შემდეგ კი გარეცხილი იქნა უჯრედების გამდიდრების ბუფერით. ნიმუში გაიარა LS სვეტში (Miltenyi) და გროვდება დადებითი და უარყოფითი ფრაქციები. ხანგრძლივობის შესამცირებლად და უჯრედების აღდგენის ეტაპის მაქსიმიზაციის მიზნით, CD8-ფრაქცია გამოიყენება CD4+ გამდიდრების მეორე რაუნდისთვის, ხოლო CD4-ფრაქცია გამოიყენება შემდგომი CD45-გამდიდრებისთვის. ხსნარი შეინახეთ ყინულზე გამოყოფის პროცესის განმავლობაში.
მეტაბოლიტების ანალიზისთვის ნიმუშების მოსამზადებლად, უჯრედები ერთხელ გაირეცხა ყინულივით ცივი მარილის ხსნარით და თითოეულ ნიმუშს დაემატა 1 მლ 80%-იანი მეთანოლი, შემდეგ მორევი და სწრაფად გაიყინა თხევად აზოტში. ნიმუშები დაექვემდებარა გაყინვა-დათბობის სამ ციკლს და ცენტრიფუგირდა 14,000 ბრ/წთ-ზე 15 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე. მეტაბოლიტების შემცველი ზედაპირული სითხე აორთქლდა გაშრობამდე. მეტაბოლიტები ხელახლა გაიხსნა 50 μl 0.03%-იან ჭიანჭველმჟავაში, მორევი შერევისთვის და შემდეგ ცენტრიფუგირდა ნარჩენების მოსაშორებლად.
მეტაბოლიტების ექსტრაქცია ზემოთ აღწერილი მეთოდით. ​​მეტაბოლომიკის კვლევისთვის ზედა ფენა გადაიტანეთ მაღალი ხარისხის თხევადი ქრომატოგრაფიის ბოთლში. პარტიული ეფექტების თავიდან ასაცილებლად გამოიყენეთ შემთხვევითი დამუშავების პროტოკოლი თითოეული ნიმუშის დასამუშავებლად უჯრედების მსგავსი რაოდენობით. ჩვენ ჩავატარეთ გლობალური მეტაბოლიტების თვისებრივი შეფასება, რომელიც ადრე გამოქვეყნდა AB SCIEX QTRAP 5500 სამმაგი კვადრუპოლური მას-სპექტრომეტრის (50) შესახებ. ქრომატოგრაფიული ანალიზი და პიკური ფართობის ინტეგრაცია ჩატარდა MultiQuant 2.1 ვერსიის პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (Applied Biosystems SCIEX).
დაკარგული მეტაბოლიტის მნიშვნელობის შესაფასებლად გამოყენებული იქნა 1000 იონური რაოდენობა, ხოლო თითოეული ნიმუშის TIC გამოყენებული იქნა თითოეული აღმოჩენილი მეტაბოლიტის ნორმალიზებული პიკური ფართობის გამოსათვლელად, რათა გამოსწორებულიყო ნიმუშის დამუშავებიდან ინსტრუმენტული ანალიზით შეტანილი ცვლილებები. TIC ნორმალიზაციის შემდეგ, ლოგარითმული კონვერტაციისა და ნორმის ხაზის ავტომატური მასშტაბირებისთვის გამოიყენება MetaboAnalystR(51) (ნაგულისხმევი პარამეტრი). ნიმუშებს შორის მეტაბოლომების განსხვავებების საძიებო ანალიზის ჩასატარებლად გამოვიყენეთ PCA vegan R პაკეტით და პაციენტების ანალიზისთვის გამოვიყენეთ ნაწილობრივი ზედმეტობის ანალიზი. ნიმუშებს შორის ევკლიდური მანძილის კლასტერიზაციისთვის გამოიყენეთ Ward მეთოდი სითბური რუკის დენდროგრამის შესაქმნელად. მთელ უჯრედის ტიპსა და მიკროგარემოს შორის დიფერენცირებულად უხვი მეტაბოლიტების იდენტიფიცირებისთვის გამოვიყენეთ limma (52) სტანდარტიზებული მეტაბოლიტების სიმრავლეზე. ახსნის გამარტივების მიზნით, მოდელის დასაზუსტებლად ვიყენებთ ჯგუფის საშუალო პარამეტრს და მიკროგარემოს უჯრედების ტიპებს განვიხილავთ თითოეულ ჯგუფად (n = 6 ჯგუფი); მნიშვნელობის ტესტისთვის, თითოეული მეტაბოლიტის სამჯერ განმეორებითი გაზომვა ჩავატარეთ. ცრუ რეპლიკაციის თავიდან ასაცილებლად, პაციენტი ლიმას დიზაინში დაბრკოლებად იყო ჩართული. სხვადასხვა პაციენტს შორის მეტაბოლიტების განსხვავებების შესამოწმებლად, ლიმას მოდელი ფიქსირებული წესით შევცვალეთ, პაციენტების ჩათვლით. ჩვენ ვაფიქსირებთ უჯრედის ტიპსა და მიკროგარემოს შორის წინასწარ განსაზღვრული კონტრასტის მნიშვნელოვნებას Padj <0.05-ის შემთხვევაში (ბენჯამინი-ჰოხბერგის კორექცია).
Miltenyi Dead Cell Removal Kit-ის გამოყენებით ენერგიული გამდიდრების შემდეგ (>80% სიცოცხლისუნარიანობა), 10x 5′გენის ექსპრესიის პროტოკოლის გამოყენებით ჩატარდა ერთუჯრედიანი ტრანსკრიპტომის სეკვენირება ცოცხალ გაყინულ ასციტებსა და სიმსივნის ნიმუშებზე. გაანალიზდა ხუთი შემთხვევა შესაბამისი სიმსივნეებითა და ასციტებით, თუმცა ერთი სიმსივნის ნიმუშიდან დაბალი სიცოცხლისუნარიანობა ხელს უშლიდა მის ჩართვას. პაციენტების მრავალჯერადი შერჩევის მიზნით, ჩვენ გავაერთიანეთ თითოეული პაციენტის ნიმუშები 10x ქრომის კონტროლერის ზოლებში და ასციტი და სიმსივნის ადგილები ცალ-ცალკე გავაანალიზეთ. სეკვენირების შემდეგ [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp შეწყვილებული ბოლო (PE), კვებეკის გენომი; საშუალოდ 73,488 და 41,378 წაკითხვით თითო უჯრედზე სიმსივნისა და ასციტისთვის, შესაბამისად]], ჩვენ გამოვიყენეთ CellSNP და Vireo (53) (CellSNP-ზე დაყრდნობით, როგორც GRCh38-ის მიერ მოწოდებული ადამიანის საერთო SNP-ს (VCF) ენიჭება დონორის იდენტურობა. ჩვენ ვიყენებთ SNPRelate-ს პაციენტის გენოტიპის სტატუსის (IBS) უახლოესი იდენტურობის (IBS) დასადგენად, გამორიცხული არ არის მინიჭებული უჯრედები და დუპლექსებად იდენტიფიცირებული უჯრედები და შესაბამისი დონორები ასციტისა და სიმსივნის ნიმუშებს შორის (54). ამ ამოცანის საფუძველზე, ჩვენ შევინარჩუნეთ სამი შემთხვევა სიმსივნესა და ასციტში უჯრედების უხვი წარმომადგენლობით შემდგომი ანალიზისთვის. მასობრივი ფილტრაციის ეტაპის შესრულების შემდეგ სკატერში (55) და ნაკაწრში (56) BioConductor შეფუთვაში, ამან ანალიზისთვის მოგვცა 6975 უჯრედი (შესაბამისად, 2792 და 4183 უჯრედი სიმსივნიდან და ასციტიდან). ჩვენ ვიყენებთ igraph-ის (57) ლუვენის კლასტერიზაციას უახლოესი მეზობლის ქსელის (SNN) შესახებ, რომელიც დაფუძნებულია ჟაკარდის კლასტერულ უჯრედებამდე მანძილს ექსპრესიით. კლასტერები ხელით ანოტირებული იქნა სავარაუდო უჯრედების ტიპებზე მარკერის გენის ექსპრესიის საფუძველზე და ვიზუალიზებული იქნა t-SNE-ით. ციტოტოქსიკური T უჯრედები განისაზღვრება CD8A და GZMA-ს ექსპრესიით, გარდა რიბოსომული ცილის დაბალი ექსპრესიის მქონე ქვეკლასტერებისა. ჩვენ გამოვიყენეთ იზარის და სხვების (16) გამოქვეყნებული მონაცემები, მათ შორის მათი t-SNE ჩანერგვა, რომელსაც შეუძლია იმუნური უჯრედების მარკერებსა და NNMT ექსპრესიას შორის ექსპრესიის გადაფარვის კონტროლი.
ლეიკოციტების გამოყოფის პროდუქტებისგან (STEMCELL Technologies) PBMC გამოეყო ფიკოლის გრადიენტის სიმკვრივის ცენტრიფუგირებით. CD3+ უჯრედები PBMC-დან იზოლირებული იქნა CD3 მძივების (Miltenyi) გამოყენებით. MNA-ს არსებობის ან არარსებობის შემთხვევაში, CD3+ უჯრედები გააქტიურდა ფირფიტასთან დაკავშირებული CD3-ით (5μg/მლ), ხსნადი CD28-ით (3μg/მლ) და IL-2-ით (300 U/მლ; Proleukin). გაფართოების ბოლო დღეს, სიცოცხლისუნარიანობა (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) და პროლიფერაცია (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) შეფასდა ნაკადური ციტომეტრიით. ეფექტორის ფუნქციის შეფასება უჯრედების PMA-თი (20 ნგ/მლ) და იონომიცინით (1მკგ/მლ) GolgiStop-ით 4 საათის განმავლობაში სტიმულირებით და CD8-PerCP-ის (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700-ის (RPA-T4), BioLegend) და TNFα-ფლუორესცეინის იზოთიოციანატის (FITC) (MAb11, BD) მონიტორინგი. qPCR და ChIP უჯრედების სტიმულირება PMA-თი (20 ნგ/მლ) და იონომიცინით (1μგ/მლ) 4 საათის განმავლობაში. ELISA სუპერნატანტი შეგროვდა PMA-თი (20 ნგ/მლ) და იონომიცინით (1 მკგ/მლ) 4 საათის განმავლობაში სტიმულაციამდე და მის შემდეგ.
RNeasy Plus Mini Kit-ის (QIAGEN) გამოყენებით რნმ-ის იზოლირებისთვის დაიცავით მწარმოებლის პროტოკოლი. ნიმუშის ჰომოგენიზაციისთვის გამოიყენეთ QIAshredder (QIAGEN). კომპლემენტარული დნმ-ის (cDNA) სინთეზირებისთვის გამოიყენეთ მაღალი ტევადობის რნმ-დან cDNA-მდე ნაკრები (Thermo Fisher Scientific). გენის ექსპრესიის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის გამოიყენეთ TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) შემდეგი ზონდებით: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [გლიცერალდეჰიდ-3-ფოსფატი წყალბადიდან (GAPDH)] და Hs01010726_m1 (SLC22A2). ნიმუშები გაშვებული იქნა StepOnePlus რეალურ დროში PCR სისტემაზე (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) MicroAmp ოპტიკური ფირის მქონე MicroAmp სწრაფ ოპტიკურ 96-ჭერიან რეაქციულ ფირფიტაზე (Applied Biosystems). ნებისმიერი Ct მნიშვნელობა, რომელიც აღემატება 35-ს, ითვლება აღმოჩენის ზღურბლზე მაღალ მნიშვნელობად და აღინიშნება, როგორც აღმოუჩენელი.
ChIP-ის ჩატარება ადრე აღწერილი მეთოდით (58) განხორციელდა. მოკლედ, უჯრედები დამუშავდა ფორმალდეჰიდით (საბოლოო კონცენტრაცია 1.42%) და ინკუბირებული იქნა ოთახის ტემპერატურაზე 10 წუთის განმავლობაში. გამოიყენეთ დამატებითი შეშუპების ბუფერი (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl და 0.1% NP-40) ყინულზე 10 წუთის განმავლობაში, შემდეგ კი ხელახლა მოათავსეთ იმუნოპრეციპიტაციის ბუფერში აღწერილი მეთოდით (58). შემდეგ ნიმუში დამუშავდა ულტრაბგერით შემდეგი ციკლებით: 10 ციკლი (20 1-წამიანი იმპულსი) და სტატიკური დრო 40 წამი. ChIP-ხარისხის იმუნოგლობულინ G-ს (უჯრედული სიგნალიზაციის ტექნოლოგია; 1μl), ჰისტონ H3-ს (უჯრედული სიგნალიზაციის ტექნოლოგია; 3μl), NFAT-ს (Invitrogen; 3μl) და SP1-ს (უჯრედული სიგნალიზაციის ტექნოლოგია; 3μl) ანტისხეულები ინკუბირებული იქნა ნიმუშთან 4°CC ტემპერატურაზე, შეანჯღრიეთ მთელი ღამით. ცილის A მძივები (Thermo Fisher Scientific) ინკუბირებულია ნიმუშთან ერთად 4°C ტემპერატურაზე, ნაზი შენჯღრევის შემდეგ 1 საათის განმავლობაში, შემდეგ დნმ-ის გასამდიდრებლად გამოიყენება ჩელექსის მძივები (Bio-Rad), ხოლო ცილის მონელებისთვის გამოიყენება პროტეინაზა K (Thermo Fisher). TNFα პრომოტორი აღმოჩენილია PCR-ით: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; პირიქით, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp პროდუქტი). გამოსახულებები მიღებულია Image Lab-ის (Bio-Rad) მიერ და რაოდენობრივად განსაზღვრულია ImageJ პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.
უჯრედული კულტურის სუპერნატანტი შეგროვდა ზემოთ აღწერილი წესით. განსაზღვრა ჩატარდა ადამიანის TNFα ELISA ნაკრების (Invitrogen), ადამიანის IL-2 ELISA ნაკრების (Invitrogen) და ადამიანის IFN-γ ELISA ნაკრების (Abcam) მწარმოებლის პროცედურების შესაბამისად. მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით, სუპერნატანტი განზავდა 1:100 თანაფარდობით TNFα-ს და IL-2-ის აღმოსაჩენად, ხოლო IFN-γ-ს აღმოსაჩენად 1:3 თანაფარდობით. 450 ნმ-ზე აბსორბციის გასაზომად გამოიყენეთ EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer).
ლეიკოციტების გამოყოფის პროდუქტებისგან (STEMCELL Technologies) PBMC გამოიყო Ficoll-ის გრადიენტის სიმკვრივის ცენტრიფუგირებით. CD3+ უჯრედები PBMC-დან იზოლირებული იქნა CD3 მძივების (Miltenyi) გამოყენებით. MNA-ს თანაარსებობისას ან არარსებობისას, CD3+ უჯრედები გააქტიურდა ფირფიტასთან შეკავშირებული CD3-ით (5μg/მლ), ხსნადი CD28-ით (3μg/მლ) და IL-2-ით (300 U/მლ; Proleukin) 3 დღის განმავლობაში. 3 დღის შემდეგ, უჯრედები შეგროვდა და გაირეცხა 0.9%-იანი ფიზიოლოგიური ხსნარით, ხოლო ნალექი სწრაფად გაიყინა. უჯრედების დათვლა ჩატარდა ნაკადური ციტომეტრიით (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R კონფიგურაცია) 123count eBeads-ის გამოყენებით.
მეტაბოლიტების ექსტრაქტი ზემოთ აღწერილი მეთოდით. ​​გამხმარი ექსტრაქტი აღდგენილია 4000 უჯრედის ეკვივალენტის/μლ კონცენტრაციით. ნიმუშის ანალიზი ხორციელდება უკუფაზური ქრომატოგრაფიით (1290 Infinity II, Agilent Technologies, სანტა კლარა, კალიფორნია) და CORTECS T3 სვეტით (2.1×150 მმ, ნაწილაკების ზომა 1.6-μm, ფორების ზომა 120-Å; #186008500, Waters). პოლარული მას-სპექტრომეტრი (6470, Agilent), რომელშიც ელექტროსპრეის იონიზაცია დადებით რეჟიმში მუშაობს. მობილური ფაზა A არის 0.1% ჭიანჭველმჟავა (H2O-ში), მობილური ფაზა B არის 90% აცეტონიტრილი, 0.1% ჭიანჭველმჟავა. LC გრადიენტი არის 0-დან 2 წუთამდე 100% A-სთვის, 2-დან 7.1 წუთამდე 99% B-სთვის და 7.1-დან 8 წუთამდე 99% B-სთვის. შემდეგ ხელახლა დააბალანსეთ სვეტი მოძრავი ფაზით A 0.6 მლ/წთ ნაკადის სიჩქარით 3 წუთის განმავლობაში. ნაკადის სიჩქარეა 0.4 მლ/წთ და სვეტის კამერა თბება 50°C-მდე. შეკავების დროის (RT) და ტრანსფორმაციის დასადგენად გამოიყენეთ MNA-ს სუფთა ქიმიური სტანდარტი (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) (RT = 0.882 წუთი, ტრანსფორმაცია 1 = 137→94.1, ტრანსფორმაცია 2 = 137→92, კონვერსია 3 = 137→78). როდესაც სამივე გადასვლა ხდება სწორ შეკავების დროს, სპეციფიკურობის უზრუნველსაყოფად რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის გამოიყენება გადასვლა 1. MNA-ს (ტორონტოს კვლევითი ქიმიური კომპანია) სტანდარტული მრუდი გენერირებული იქნა საწყის ხსნარის (1 მგ/მლ) ექვსი სერიული განზავებით, შესაბამისად, 0.1, 1.0, 10 და 100 ნგ/მლ და 1.0 და 10μგ/მლ სტანდარტების მისაღებად. აღმოჩენის ზღვარი არის 1 ნგ/მლ, ხოლო წრფივი რეაქცია 10 ნგ/მლ-დან 10μგ/მლ-მდეა. ნიმუშისა და სტანდარტის ორი მიკროლიტრის თითოეული ინექცია გამოიყენება LC/MS ანალიზისთვის და შერეული ხარისხის კონტროლის ნიმუში გამოიყენება ყოველ რვა ინექციაზე ანალიზის პლატფორმის სტაბილურობის უზრუნველსაყოფად. ყველა MNA-თი დამუშავებული უჯრედული ნიმუშის MNA რეაქციები იყო ანალიზის წრფივ დიაპაზონში. მონაცემთა ანალიზი ჩატარდა MassHunter რაოდენობრივი ანალიზის პროგრამული უზრუნველყოფის (v9.0, Agilent) გამოყენებით.
მეორე თაობის αFR-CAR კონსტრუქტი აღებულია სონგისგან და სხვ. (59). მოკლედ, კონსტრუქტი შეიცავს შემდეგ შემცველობას: CD8a ლიდერის თანმიმდევრობა, ადამიანის αFR-სპეციფიკური ერთჯაჭვიანი ცვლადი ფრაგმენტი, CD8a სახსარი და ტრანსმემბრანული რეგიონი, CD27 უჯრედშიდა დომენი და CD3z უჯრედშიდა დომენი. სრული CAR თანმიმდევრობა სინთეზირებული იქნა GenScript-ის მიერ და შემდეგ კლონირებული იქნა მეორე თაობის ლენტივირუსული ექსპრესიის ვექტორში GFP ექსპრესიის კასეტის ზემოთ, რომელიც გამოყენებულია ტრანსდუქციის ეფექტურობის შესაფასებლად.
ლენტივირუსი წარმოიქმნება HEK293T უჯრედების ტრანსფექციით [ამერიკული ტიპის კულტურების კოლექცია (ATCC); გაიზარდა Dulbecco-ს მოდიფიცირებულ Eagle გარემოში, რომელიც შეიცავს 10% ნაყოფის ძროხის შრატს (FBS) და 1% PenStrep-ს, და გამოყენებული იქნა CAR-GFP ვექტორი, ხოლო შეფუთვის პლაზმიდები (psPAX2 და pMD2.G, Addgene) იყენებენ ლიპოფექციის ამინას (Sigma-Aldrich). ვირუსის შემცველი სუპერნატანტი შეგროვდა ტრანსფექციიდან 48 და 72 საათის შემდეგ, გაფილტრული და კონცენტრირებული იქნა ულტრაცენტრიფუგირებით. კონცენტრირებული ვირუსული სუპერნატანტი შეინახეთ -80°C ტემპერატურაზე ტრანსდუქციამდე.
PBMC-ები გამოიყოფა ჯანსაღი დონორის ლეიკოციტების გამოყოფის პროდუქტებისგან (STEMCELL Technologies) Ficoll-ის გრადიენტის სიმკვრივის ცენტრიფუგირებით. CD8+ უჯრედების PBMC-დან იზოლირებისთვის გამოიყენეთ დადებითი შერჩევის CD8 მიკრობურთულები (Miltenyi). T უჯრედების სტიმულირება TransAct-ით (Miltenyi) და TexMACS გარემოში [Miltenyi; დამატებული 3% თერმულად ინაქტივირებული ადამიანის შრატით, 1% PenStrep-ით და IL-2-ით (300 ერთ/მლ)]. სტიმულაციიდან 24 საათის შემდეგ, T უჯრედები ტრანსდუცირებული იქნა ლენტივირუსით (10 μl კონცენტრირებული ვირუსის სუპერნატანტი 106 უჯრედზე). Cytek Aurora-ზე ტრანსდუქციიდან 1-3 დღის შემდეგ (FSC (წინა გაფანტვა)/SSC (გვერდითი გაფანტვა), სინგლეტზე, GFP+-ზე), შეაფასეთ უჯრედების GFP ექსპრესია, რათა დაამტკიცოთ ტრანსდუქციის ეფექტურობა მინიმუმ 30%-ით.
CAR-T უჯრედები 24 საათის განმავლობაში კულტივირებული იყო Immunocult-ში (STEMCELL Technologies; დამატებული 1% PenStrep-ით) შემდეგ პირობებში: დაუმუშავებელი, დამუშავებული 250 μM ადენოზინით ან 10 mM MNA-თი. წინასწარი დამუშავების შემდეგ, CAR-T უჯრედები გაირეცხა PBS-ით და შერწყმული იქნა 20,000 SK-OV-3 უჯრედთან [ATCC; McCoy 5A გარემოში (Sigma-Aldrich), დამატებული 10% FBS-ით და 1% PenStrep-ით 10°C-ზე: ეფექტორისა და სამიზნის თანაფარდობა 1 ამპლიფიცირებული იყო სამჯერ დამატებულ Immunocult გარემოში. SK-OV-3 უჯრედები და SK-OV-3 უჯრედები, რომლებიც ლიზირებული იყო დიგიტალისის საპონინით (0.5 მგ/მლ; Sigma-Aldrich), გამოყენებული იყო შესაბამისად, როგორც უარყოფითი და დადებითი კონტროლი. 24-საათიანი თანაკულტივაციის შემდეგ, შეგროვდა ზედა ფენა და გაიზომა ლაქტატდეჰიდროგენაზა (LDH) მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH ზედა ფენა განზავდა 1:50 პროპორციით LDH ბუფერში. განადგურების პროცენტული მაჩვენებელი გაიზომა შემდეგი ფორმულით: განადგურების პროცენტული მაჩვენებელი = კორექციის პროცენტული მაჩვენებელი / მაქსიმალური განადგურების მაჩვენებელი x 100%, სადაც კორექციის პროცენტული მაჩვენებელი = მხოლოდ თანაკულტივაცია - T უჯრედები, ხოლო მაქსიმალური განადგურების მაჩვენებელი = დადებითი კონტროლი - უარყოფითი კონტროლი.
ტექსტში ან მასალებსა და მეთოდებში აღწერილი წესით, სტატისტიკური ანალიზისთვის გამოიყენეთ GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ან R v3.6.0. თუ ერთი და იგივე პაციენტისგან რამდენიმე ნიმუშია აღებული (მაგალითად, ასციტი და სიმსივნე), ჩვენ ვიყენებთ დაწყვილებულ t ტესტს ან პაციენტს, როგორც შემთხვევით ეფექტს, წრფივ ან განზოგადებულ მოდელში, შესაბამისად. მეტაბოლომიკის ანალიზისთვის, მნიშვნელობის ტესტი სამჯერ ტარდება.
ამ სტატიის დამატებითი მასალებისთვის იხილეთ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
ეს არის ღია წვდომის სტატია, რომელიც გავრცელებულია Creative Commons Attribution-Non-Commercial License-ის პირობებით, რომელიც იძლევა გამოყენების, გავრცელებისა და რეპროდუცირების საშუალებას ნებისმიერ მედიაში, იმ პირობით, რომ საბოლოო გამოყენება არ არის კომერციული სარგებლის მისაღებად და წინაპირობაა, რომ ორიგინალი ნამუშევარი სწორია. წყარო.
შენიშვნა: ჩვენ მხოლოდ თქვენი ელექტრონული ფოსტის მისამართის მითითებას გთხოვთ, რათა გვერდზე თქვენს მიერ რეკომენდაციის გაწევრიანებულმა პირმა იცოდეს, რომ გსურთ, რომ მათ ელ.წერილი ნახონ და რომ ის სპამი არ არის. ჩვენ არ შევინახავთ ელექტრონული ფოსტის მისამართებს.
ეს კითხვა გამოიყენება იმის შესამოწმებლად, ხართ თუ არა ვიზიტორი და ავტომატური სპამის გაგზავნის თავიდან ასაცილებლად.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H.BelsonRH. დებერარდინისი), რასელ ჯი. ჯონსი (რასელ ჯი. ჯონსი), ფინეას ტ.
MNA ხელს უწყობს T უჯრედების იმუნურ დათრგუნვას და წარმოადგენს პოტენციურ იმუნოთერაპიის სამიზნეს ადამიანის კიბოს სამკურნალოდ.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H.BelsonRH. დებერარდინისი), რასელ ჯი. ჯონსი (რასელ ჯი. ჯონსი), ფინეას ტ.
MNA ხელს უწყობს T უჯრედების იმუნურ დათრგუნვას და წარმოადგენს პოტენციურ იმუნოთერაპიის სამიზნეს ადამიანის კიბოს სამკურნალოდ.
©2021 ამერიკის ასოციაცია მეცნიერების წინსვლისთვის. ყველა უფლება დაცულია. AAAS არის HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef და COUNTER-ის პარტნიორი. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.